Постоянный церебральный окклюзия судна<em&gt; С помощью</em&gt; Двойной лигатура и Перерезка

Резюме

Опишем высоко воспроизводимым методом для постоянной окклюзии грызунов основных церебральных кровеносных сосудов. Этот метод может быть достигнуто с очень небольшим повреждением периферических, минимальные потери крови, высокий уровень долгосрочное выживание и в соответствии объем инфаркта соизмеримый с человеческим клинических населения.

Аннотация

Инсульт является одной из ведущих причин смерти, инвалидности и социально-экономические потери по всему миру. Большинство все штрихи в результате прерывания кровотока (ишемии) ^1. Средней мозговой артерии (МСА), обеспечивает большую часть крови к боковой поверхности коры ^2, является наиболее распространенным сайт человеческой инсульт ³ и ишемии на его территории может привести к обширному дисфункцию или гибель ^1,4,5. Пережившие ишемического инсульта часто страдают потерей или нарушением возможности двигателя, сенсорного дефицита и инфарктом. В попытке захватить эти ключевые характеристики инсульта, и тем самым развивать эффективное лечение, большой акцент делается на животных моделях ишемии в MCA.

Здесь мы представляем метод постоянной закупорки кровеносных сосудов коркового поверхности. Мы представим этот метод на примере соответствующих окклюзии судно, которое моделирует наиболее распространенный тип, расположение и OUTCOMе человека инсульт, постоянные окклюзии средней мозговой артерии (pMCAO). В этой модели, мы подвергать хирургическим MCA во взрослой крысы, а затем закрывают через двойные лигатуры и перерезка сосуда. Это pMCAO блокирует проксимальных корковых филиал MCA, вызывая ишемию во всех MCA территории коры, большая часть коры головного мозга. Этот метод окклюзии может также использоваться для окклюзии более дистальных отделах корковых сосудов с целью достижения более фокальной ишемии ориентации меньший области коры головного мозга. Основными недостатками pMCAO в том, что хирургическая процедура занимает несколько инвазивных как небольшой трепанации черепа требуется для доступа к MCA, хотя это приводит к минимальным повреждением тканей. Основными преимуществами данной модели, однако, являются: места окклюзии корректно определено, степень снижения артериального потока является последовательной, функциональной и неврологическими нарушениями происходит быстро, размер инфаркта является последовательной, и высокая выживаемость позволяет использовать длительные Термин хроническая оценки.

Введение

Для того, чтобы индуцировать ишемических состояний, которые эффективно имитировать человеческое ишемический инсульт, инсульт несколько моделей животных широко используются, с различной объема инфаркта в результате. В фототромботического модель, мозг облучают через неповрежденную черепа использованием лазерного излучения после внутривенного введения светочувствительного вещества (например, бенгальского розового), в результате фотохимической коагуляции, блокирование облученного сосудов и ишемия в окружающие ткани ^{6, 7.} Фототромбоза может привести к очень маленьким, изолированные области инфаркта и обычно используется как средство моделирования "мини-ударов" или "микро-ударов".

Более широкое применение техники для индукции ишемического инсульта, особенно в средней мозговой артерии (MCA), является внутрипросветного модель мононити ^8, в которой нити хирургическим путем вводится в наружную сонную артерию и продвинулись, пока наконечник перекрывает основание MCA. PRIМария задача внутрипросветных окклюзии нити высокой смертностью (70%, когда MCA поглощается в течение 3 часов, соответствующие моменту времени для хода исследования) ^9. Другие проблемы с методом включены возможные субарахноидального кровоизлияния, неполные окклюзии, и переменный объем инфаркта ^10,11. Эта модель приводит к обширным инфарктом степени как в коре и подкорково ^12, и модели массивных человека инсульт.

Хотя оба микро-и обширный инсульт модели важны, человеческие Обычно удары где-то посередине. В крупных клинических исследованиях, инсульт инфаркт диапазоны в размере от 28-80 см ^3, что в переводе с 4.5-14% от ипси-ишемическая полушарии ^9. Для сравнения, наши крысы pMCAO размер инфаркта в диапазоне от приблизительно 9-35 мм ^3, которая составляет от 3 ​​до 12% от ипси-ишемических полушарии. Наши pMCAO модели, таким образом, напоминает человека ишемического инсульта объемы инфаркта мозга процентобъема.

В дополнение к моделированию структурных повреждений инсульта, pMCAO результатов в функциональных и поведенческих дефицитов похоже на состояние человека. Как минимум, эффективные модели инсульта приводит к дефициту движения контралатеральной повреждение хода ^13-15, потери или нарушения чувствительности и моторной функции ^16,17, потери или разрушения вызвала активность нейронов ^16,18, снижение мозгового кровотока ^{19, 20, 21,22} и инфаркта. Соответственно, наши pMCAO моделей серьезной окклюзии средней мозговой артерии приводит к инвалидности, потеря функции в сенсорной коре (и соседних коры), нарушению нейронной активности, резкому сокращению кровотока MCA, и инфаркт-признак атрибутами ишемического инсульта ^{23 -25,} поэтому выступающей в качестве эффективной модели человеческого инсульта.

Процедурном pMCAO включает небольшой трепанации черепа, в которых мы осторожно удалить черепа и оболочки из2 х 2 мм "хирургического окна» по начальной (M1) сегмент СМА, незадолго до первичной бифуркации MCA в передних и задних корковых ветвей (рис. 1А и 1В). Проходим половину кривой Режущая иглы и нити шва (6-0 шелк) через слой мягкой мозговой оболочки мозговых оболочек, ниже и выше MCA поверхности коры (см. Таблица специфических реагентов и оборудования для хирургических материалов, необходимых для проведения pMCAO ). Мы затем связать двойные лигатуры, затяните два узлы вокруг MCA, и секут судна между двумя узлами. Двойные лигатуры и рассечение происходит через M1, расположенной по периферии lenticulostriate ветвления, так что только корковых ветвях MCA-страдают таким образом, только корковых инфарктов (без подкорковые повреждения) происходит ^26,27 (рис. 2). Хотя человека инсульт, часто включает в себя подкорковые инфаркты, моделирование этого у грызунов требует увеличения инвазивности (закупорки сосудов головного мозга до коркового Branchiнг, требует обращения к артериям через сонную артерию на шее и требует дополнительных окклюзии) в технике и усиление изменчивости размера инфаркта. Модели, описанные здесь, могут быть выполнены более проксимально, как доступ к ранее ветвей ФВТ не возможно с помощью простой краниотомия. Хотя это может быть хирургическим путем можно вызвать с помощью подкорковых инфарктов pMCAO, окклюзия повлечет за собой крайне инвазивной процедурой и, следовательно, не является идеальным.

Эффективность окклюзии может быть подтверждено с помощью лазерной доплеровской или лазерной спекл-изображений ^12,24,25 (рис. 3), или гистологическое посмертные (рис. 2). Следует отметить, что предыдущие исследования показали, что сенсорная стимуляция может играть важную роль в эволюции и исход инфаркта; обеспечить защиту от повреждений при приеме в течение 2 ч pMCAO и вызывая увеличение ударного повреждения при введении в 3 часа после pMCAO ^24,25,28. Мы подтвердили, что в 5 часов после pMCAO, стимуляция больше не влияет на результат (неопубликованные данные). Таким образом, сенсорная стимуляция субъектов должны быть сведены к минимуму в течение 5 часов после получения pMCAO объемы инфаркта с минимальной изменчивостью. Соответственно, наша группа не проходит "необработанным контролем" такого типа, сохраняя крыс под наркозом в течение 5 ч после pMCAO, в темноте, с минимальным сенсорной стимуляции, и прямо не усов стимуляции.

Кроме того, следует отметить, что случайные изменения в структуре МСА, в том числе чрезмерного ветвления, несколько первичных сегментов или отсутствие связи артерии может происходить с частотой от 10 до 30% взрослого мужчины Sprague Dawley крыс ^29,30. Если нарушения в MCA наблюдаются, желательно не использовать эту конкретную тему, как добавление животных с такими сосудистые аномалии увеличится инфаркта изменчивости.

Кроме того, существует несколько практических аспектов оUR процедуры, которые делают этот метод окклюзии выгодным для хода расследования. Во-первых, швы могут быть размещены вокруг артерии, но не затянуты, чтобы собрать базовую оценку, а затем после ишемии оценка после лигатуры и рассечения. Таким образом, хирургическая подготовка необходимых для эффективной окклюзии контролировали в течение предметов. Поскольку объектами может оставаться неподвижным или в стереотаксической раме всей окклюзии, можно проводить экспериментальные оценки каждого субъекта до, во время и после окклюзии без перемещения объекта или нарушения любого экспериментального оборудования, используемого ^25,28. Кроме того, эта процедура приводит к очень низкой смертности, даже в возрасте субъектов грызунов 21-24 месяцев (эквивалент пожилого человека) ^31, и поэтому может быть использован для оценки лечения инсульта у крыс, которые более точно смоделировать наиболее распространенных возрасте от инсульта страдает ^25,28. Судно transectioN также выполняет несколько практических целей. Отсутствие кровотечение после рассечения подтверждает, что полной закупорки сосудов в обоих лигатуры сайтов. Кроме того, пересечение создает постоянное нарушение кровотока. Наконец, пересечение гарантирует, что любой поток крови обнаружены в дистальной части закупоренный сосуд должны происходить из другого источника.

Наконец, хотя мы конкретно описать этот метод для окклюзии МСА в этой рукописи и видео, те же технике двойного рассечения лигатуры могут быть применены к любому церебральный судна, которые могут быть доступны через краниотомия. Наша лаборатория, например, использованы pMCAO в сочетании с несколькими дополнительными постоянными окклюзии дистальных ветвей MCA для того, чтобы блокировать как первичный, и обеспечения притока крови ²⁴ таким образом, чтобы аналогичные методы, призванные избирательно вызывать ишемию в первичной соматосенсорной коре ^32.

В заключение, тего метод для постоянной окклюзии применительно к MCA близко моделирует три основные аспекты человеческой ишемического инсульта: наиболее распространенным расположение (MCA), тип (ишемии) и степени повреждения (инфаркт), связанные с человеческим клинической литературы инсульта. Кроме того, этот метод окклюзии может быть применено к одной или нескольких местах по всей окклюзии мозга, и может быть проведена в возрасте субъектов с высокой скоростью на выживание. Учитывая динамичное, постоянный, неинвазивный и относительно природы этого окклюзии, этот метод представляет собой дополнительный инструмент для доклинической оценки исследователей новых подходов для защиты от и лечения инсульта.

протокол

1. Приступая к работе: Требуется Хирургические инструменты

См. Рисунок 4

1. Бормашины (Kavo стоматологического оборудования, модель: UMXL-TM), 2-сверло, и 3-сверло
2. Два ~ 30 иглами подкожно
3. Зубчатые пинцета с изогнутыми концами дополнительно (может быть полезно, но не обязательно)
4. Два штрафа пинцет наконечник
5. кусачки
6. Шовные нити
7. Микро-ножницы

2. Создание хирургической окно

1. Анестезия: Процедуры в соответствии с руководящими принципами NIH и были одобрены UC Irvine уходу и использованию животных комитета. Экспериментальные предметы 295-400 г самец крысы Sprague Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, США) и следующую процедуру анестезии следует использовать:
   1. Введите крыс внутрибрюшинно с фенобарбиталом натрия болюса (55 мг / кг массы тела), а затем внутримышечно атропин (0,05 мг / кг, BW) в чIND ногу, и вводили 3,0 см 5% раствора декстрозы в воде подкожно.
   2. Дополнение пентобарбитала натрия (27,5 мг / кг массы тела) инъекции по мере необходимости. Администрирование глазной мази с антибиотиком для глаз для защиты роговицы в течение следующих процедур. Администрирование 5% раствора декстрозы (3 мл) и атропин (0,05 мг / кг, BW) каждые шесть часов уменьшения выделений из дыхательных путей во время анестезии. Измерение температуры тела с помощью ректального датчика, и поддерживать температуру тела при 37 ° С с помощью саморегулируемых тепловых одеяло.
2. Найдите MCA путем:
   1. Разбавление 2 х 2 мм изображения / визуализации окно над соматосенсорной коры с использованием размера HP 3 сверла, пока череп не является практически прозрачным, а затем прореживания до полной прозрачности с использованием размера HP 2 бурового долота. Расположение MCA может быть виден через это окно и его проксимального траектории использоваться для аппроксимации местоположения начального сегмента. MCA как правило, работают по диагонали этойОкно в ростральнее хвостового / брюшной спинной направлении (например, слева направо / снизу вверх, при просмотре левого полушария с точки хирурга зрения). Хирургический окно может быть создано выше, где наблюдатель оценивает M1 сегмента (проксимально по отношению к кортикальной ветвления), расположены на основе дистальных ветвей видны через первое окно. Для того чтобы минимизировать количество черепа, который удаляется для того, чтобы получить доступ к СМА, изображения / визуализации окна должны быть расположены близко к, но отдельно от хирургических окна.
      Или
   2. Небольшое хирургическое окна должен располагаться приблизительно 3 мм впереди и 1 мм сбоку от овального отверстия или нижнечелюстного нерва, рядом с трибуной арку ^30,33,34. Для того чтобы эффективно получить доступ к штоку MCA (также известный как M1 сегмент), височной мышцы временно отраженный от поверхности черепа. (Примечание: В случае долгосрочной операции выживания, опыт нашей лаборатории была тхат, позволяя височной мышцы оставаться прикреплена на ее якорь, мышца будет повторно отжига относительно поверхности черепа, что позволяет здорового пищевого поведения и эффективного поддержания массы тела.
3. Последующие MCA в ростральной, вентральной углу окна изображения (при использовании этого в качестве ссылки), чтобы оценить, как исходное корковой ветви лежит.
4. Создайте новый тонкий череп региона (мы называем это хирургическая окне) слегка ростральные через брюшную полость до визуализации окна (если использовать это в качестве ссылки), где M1 сегменте (до корковых ветвления) СМА должна быть. ВАЖНО: Оставьте примерно 2 мм между изображениями окна (если использовать это в качестве ссылки) и хирургическое окна.
5. Найти ствола СМА (также известный как M1 сегмента) непосредственно перед корковых разветвления артерии, как показано на фиг.1А и 1В.
6. Использование размеров HP-3 сверла, тонкие черепа над предполагаемой M1 расположения сегмента. Когдачереп становится несколько прозрачных, переключитесь на более тонкие размеры HP-2 сверла и тонкие черепа, пока он не является полностью прозрачным. Подтверждение визуально как хирургические область окна становится достаточно тонким, чтобы посмотреть в сосудистой сети, и оценивать местоположение M1 в этой точке и заполнить окно, так что имеется 2-3 мм по обе стороны от длины М1 сегмента (это позволяет место для вставки и выхода нити иглы по обе стороны от MCA).

ВАЖНО: остановить истончение когда толщина черепа похож на полиэтиленовой пленкой. Судно будет разрыв, если сверло прорывается черепа и оболочки. Если черепа не достаточно тонким, с другой стороны, удаление его для окклюзии будет трудным и может привести к повреждению коры или артерию.

7. Возьмите 30 размера (30 г) подкожной иглой и согните кончик иглы, используя зубчатые пинцетом.
8. Используйте иглу 30 G для прокола черепа уходаполностью в области, не непосредственно над артерией. Используйте этот прокол, чтобы пинцет, чтобы понять черепа и осторожно удалите разбавленной площадь хирургического окна.
9. Возьмите новый G 30 необходимо, согните его кончик, как в шаге 6, и осторожно удалите твердую мозговую оболочку.

ПРИМЕЧАНИЕ: резки твердой мозговой оболочки приведет к его отогните MCA и станет более заметным, в результате пониженном давлении.

3. Окклюзии MCA

1. Используйте кусачки, чтобы обрезать половину кривой шов Режущая игла (круглая 3/8, 16 мм шовные иглы) до примерно 3-5 мм.
2. Заправьте обрезанного шва иглу, как показано на рисунке на рисунке 4Е. ВНИМАНИЕ: Очень важно, что игла имеет резьбу, так что оба конца шовной нити имеют эквивалентную длину. Это позволяет вытягивать как концы нитей под M1 в то же время, игла может быть свободного кроя оставив две длины нити, чтобы связать два узла вокруг MCA.
3. Используйте пинцет зубчатые скольжения шва иглу под M1. Вставьте около 0,5-1 мм расстояние от MCA, оставаясь как мелкие, как можно так, чтобы минимизировать повреждения коры, но избегая слишком много нагрузки на MCA, а также.
4. Когда шов игла выходит с другой стороны так, что он находится под MCA, использовать тонкий пинцет наконечник (как показано ниже), чтобы вытащить кончик иглы шва с противоположной стороны, продолжая кормить или толкать другой конец шовного игла с зубчатым наконечником пинцетом.
5. Как только шов игла полностью проходила под MCA и вынут, продолжать тянуть на иглу шов или поток до длины нити не станет равным по обе стороны от MCA. Нажав на нить, как она подается через, чтобы минимизировать нагрузку на MCA может быть полезно, чтобы предотвратить разрыв как нить проходит под артерией.
6. Обрежьте нить близко к шовные иглы.
7. Используйте оба прекрасно пинцетом точки, чтобы распутать двух полученных в результате нити шовногос таким, что существует два независимых потока нанизаны под MCA, которые не соприкасаются. В идеале потоки будут составлять около 1 мм друг от друга, где они проходят под MCA.
8. Используйте оба прекрасно пинцетом точки, чтобы связать два отдельных узлов (два лигатур) с нитями вокруг MCA пытается утверждать, что ~ 1 мм пространство между узлами, чтобы места для рассечения.

Примечание: Если внутренний контроль фиктивные желательно, готовят окклюзии оставляя окклюзии узлов свободно таким образом, что они не ограничивают MCA вообще и собирать данные перед затягиванием узлов и резки судна. Обрежьте нить, чтобы предотвратить его ловить на что-либо до окклюзии, но оставить достаточно нити, чтобы ужесточение узлов позже. Таким образом, любое изображение базового или сбора данных может быть выполнена со всеми же хирургическое вторжение как закупорка и узлов затягивается в соответствующий момент времени с небольшой задержкой.

9. Как только узлы имеют бытьEN натянута, используйте ножницы, чтобы микро секут M1 между двумя узлами.
10. В случае долгосрочного исследования выживания:
    1. Шовный надрезают кожу головы лоскут на место стерильной хирургической нити или закрепите ткань с использованием стерильных клипов раны.
    2. Администрирование антибиотики местно в область раны (например, мазь бацитрацин) и системно на профилактический инъекции ампициллин (150 мг / кг внутримышечно).
    3. В то время как предмет по-прежнему управлять анестезией офтальмологических мазь с антибиотиками для глаз.
    4. Администрирование дополнительных атропин (0,05 мг / кг внутримышечно) для уменьшения выделений из дыхательных путей во время анестезии.
    5. Введите флуниксин меглумин (1,1 мг / кг) подкожно в конце операции и снова на следующее утро (~ 12 ч позже) для обезболивания.
    6. Место животное на сухой, теплый, наклонные поверхности, так что животные нос выше хвоста по наклонной (это облегчает дыхание, пока животное не спит).
    7. Следить за животным, пока он не проснулся и перемещение безопасно само по себе.
    8. Как только животное обратно в виварии, активность животного, внешний вид, вокализации и кормления и поения поведение должно контролироваться ежедневно.

4. Эвтаназия

1. По завершении каждого эксперимента, крысы должны быть умерщвлены с фенобарбиталом натрия (2-3 мл, внутрибрюшинно).

Результаты

Успешное окклюзии сосуда может быть подтверждена с помощью лазерного спекл-изображений (LSI) среди других методов кровотока изображений. Кровоток в основных корковых ветвей ФВТ должна упасть до ~ 25% от исходного уровня или меньше следующие окклюзии в зависимости от уровня шума ...

Обсуждение

Этот протокол был разработан для того, чтобы вызвать ишемию в коре грызунов, и делать это с минимальными периферийного воздействия на испытуемых. Двойной прикус и перерезка метод позволяет для визуального подтверждения того, что судно было постоянной окклюзии, и может быть выполнена б...

Материалы

Name of the equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Extra Fine Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Slight Curve (1)	Fine Science Tools	11151-10
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps (2)	Fine Science Tools	11252-50
Extra Fine Bonn Scissors, straight (1)	Fine Science Tools	14084-08
Round 3/8 (16 mm) Suture Needles	Fine Science Tools	12050-02
6-0 Braided Silk Suture	Fine Science Tools	NC9071061 Harvard Apparatus No.:510461
30 gauge needle, ½" length	Fine Science Tools	NC9867376 No.:ZT-5-030-5-L/COL