永久的な脳血管閉塞<em&gt;経由</em&gt;ダブルリガチャーと離断

要約

私たちは、齧歯類の主要脳血管の閉塞のための永久的な再現性の高い方法を記述します。この技術は、非常に少ない周損傷、最小限の血液損失、長期生存率が高いと、ヒト臨床人口に見合った一貫性梗塞体積を達成することができる。

要約

脳卒中は、死亡、障害、および社会経済的損失、世界中の主要な原因である。すべてのストロークの大部分は血液の流れの中断（虚血^）1から生じる。中大脳動脈（MCA）は、皮質²の側面への血液の大部分を提供し、人間のストローク³の最も一般的なサイトであり、その領土内の虚血は、広範な機能障害または死亡^1,4,5になることがあります。虚血性脳卒中の生存者は、多くの場合、運動機能、感覚障害、および梗塞の損失や混乱に苦しむ。脳卒中のこれらの重要な特性をキャプチャし、それによって効果的な治療法を開発するための努力では、強調の多大MCAにおける虚血の動物モデルに置かれている。

ここでは、永久皮質表面の血管を閉塞する方法を提案する。私たちは、最も一般的なタイプ、場所、およびoutcomをモデル関連血管閉塞の例を使用して、この方法を紹介します人間脳卒中、永久中大脳動脈閉塞（pMCAO）のE。このモデルでは、外科的に成体ラットにMCAを公開し、その後、容器の重結紮および離断を介して閉塞。このpMCAOは大脳皮質の大部分、MCA皮質領域のすべてにおいて虚血を引き起こし、MCAの近皮質枝をブロックします。閉塞のこの方法は、皮質の小さい領域を対象とした多くの局所的虚血を達成するために、皮質血管のより遠位の部分を閉塞するために使用することができる。 pMCAOの主な欠点は小開頭がMCAにアクセスするために必要とされるように外科的処置は、最小限の組織の損傷は、この結果も、やや侵襲的であることである。このモデルの主な利点は、しかし、ある：閉塞部位が十分に定義されている、血流の減少の程度は一貫性があり、機能的および神経学的障害が急速に発生し、梗塞サイズは一貫しており、生存率が高いために長いことができ長期慢性査定。

概要

効果的に人間の脳梗塞を模倣虚血状態を誘導するために、いくつかの動物モデルストロークが広く梗塞の体積を変化させることにより得られた、使用される。 photothromboticモデルでは、脳^、光化学凝固、照射された血管の閉塞、および周囲の組織^以内虚血をもたらす、感光性物質（例えば、ローズベンガル等）の静脈内注射後にレーザー照射を使用してそのまま頭蓋骨を通して照射される^7。 Photothrombosisは、梗塞の非常に小さな、孤立した領域をもたらすことができ、典型的にモデリング "ミニストローク"または "マイクロストローク"の手段として用いられる。

特に、中大脳動脈（MCA）において虚血性脳卒中を誘導するための、より広く採用されている技術は、フィラメントは、外科的に外頸動脈に導入され、チップは、MCAのベースを閉塞するまで、前進させた管腔内モノフィラメントモデル⁸である。 PRI腔内フィラメント閉塞のメアリーの課題は、高い死亡率^9（MCAは3時間、脳卒中研究に関連する時点に対して閉塞さ70％）である。メソッドを使用して他の問題は、可能なくも膜下出血、不完全閉塞と、可変梗塞容積^10,11を含ん^でいた。両方の皮質とsubcortically ^12、およびモデルにおける梗塞の広範度大規模な人間のストロークでこのモデルの結果。

ミクロと巨大両方ストロークモデルは重要ですが、人間のストロークはどこかの間で一般的である。大規模臨床研究では、脳卒中梗塞の範囲のサイズのIPSI-ishemic半球⁹の4.5から14までパーセントに変換28〜80センチメートル^3、から。 IPSI-ishemic半球3〜12％を構成する約9〜35ミリメートル³からの比較では、我々のラットpMCAO梗塞サイズの範囲。当社pMCAOモデル、したがって、密接に脳の割合で人間の虚血性脳卒中梗塞ボリュームに似ているボリューム。

人間の条件と同様の機能と行動障害で脳卒中、pMCAO結果の構造的損傷のモデリングに加えて、。最低限、ストロークダメージ^13-15に反対運動不足、誘発神経活動^16,18の運動および感覚機能^16,17、損失または中断の損失または中断、脳血流¹⁹の削減^、の脳卒中の結果の効果的なモデルで^20、および梗塞^21,22。したがって、当社pMCAOモデル身体障害、感覚皮質（および近隣皮質）内の機能の喪失、神経活動の中断、MCAの血流が著しく低下し、虚血性脳卒中²³の梗塞·特徴的な属性になりMCAの深刻な閉塞したがって、人間の脳卒中の効果的なモデルとして^-25、。

手続き、pMCAOは、我々は慎重にから頭蓋骨と硬膜を除去する小さな開頭術を伴うMCAの初期（M1）セグメント上2×2ミリメートル"外科ウィンドウ"、ただ前部と後部皮質枝（ 図1Aおよび1B）にMCAの主な分岐の前に。我々は（pMCAOを遂行するために必要な外科的供給のための具体的な試薬や機器の表を参照してMCAの下と皮質表面上、髄膜の軟膜層を介してハーフ曲線の逆切断縫合針と糸（6-0絹）を通過）。我々はその後ダブルリガチャーを結ぶ、MCAの周りに2つの結び目を締めて、2つの結び目の間に血管を横断する。 M1を通じてダブルリガチャーと離断はちょうどlenticulostriate分岐に対して遠位MCAの唯一の皮質枝が影響を受け、こうしてのみ皮質梗塞（無皮質下の損傷が^）26,27を （ 図2）が発生していることなどが発生します。人間のストロークがしばしば皮質下梗塞を伴うが、げっ歯類でこれをモデル化すると、増加した侵襲性を（脳血管を閉塞する皮質branchi前に必要NGは、首の頸動脈を経由してアクセスして動脈を必要とし、技術と梗塞サイズの増加変動に）追加の閉塞を必要とする。 MCA以前の支店へのアクセスが簡単な開頭術を介して可能ではないので、ここで説明されたモデルは、より近位に実行することはできません。それはpMCAO経由皮質下梗塞を誘発することが外科的に可能かもしれないが、閉塞は極めて侵襲を伴うため、理想的ではないでしょう。

オクルージョンの効果はレーザードップラー、またはレーザーを介して確認することができる（ 図2）事後組織学的にイメージング^12,24,25（ 図3）スペックル、または。これは、以前の研究では、感覚刺激が梗塞の進化と結果に大きな役割を果たすことができることを示していることに留意すべきである。pMCAOの2時間以内に投与したとき損傷からの保護を付与し、3時間後のpMCAOで投与ストローク損傷の増加を引き起こす^24,25,28。私たちは、5時間後pMCAOで、刺激はもはや結果（未発表データ）に影響を及ぼさないことを確認しています。したがって、被験者の感覚刺激は、最小限の変動性と梗塞ボリュームを得るためpMCAO以下の5時間最小化されるべきである。したがって、当社グループは、最小限の感覚刺激と、明示しないウィスカー刺激と、暗闇の中で、5時間後pMCAO用麻酔ラットを保つことによって、このタイプの "未処理のコントロール"を実行します。

さらに、過剰分岐、複数のプライマリセグメント、または動脈の通信の有無を含めMCA構造において時折変化は、成人男性のSprague Dawleyラット^29,30が10〜30％頻度で発生する可能性があることに留意すべきである。 MCAの異常が認められた場合には、そのような血管異常と動物を加えること梗塞ばらつきを増加するように、その特定の被写体を使用しないことが望ましい。

さらに、Oのいくつかの実用的な側面があります脳卒中調査のための有利なこの閉塞方法を作るウル手順。まず、縫合糸は、動脈の周囲に配置されただけで結紮し、離断後の虚血後の評価に続いて基礎評価を収集するために締め付けられていないことができる。このように、閉塞のために必要な外科手術の準備を効果的に被験者内に制御される。被写体が静止したり、閉塞を通して定位フレーム内に残ることがありますので、中に、そして閉塞後にサブジェクトを移動または使用^25,28内の任意の実験装置を乱すことなく、前に各被験者の実験的評価を実施することが可能です。なお、この手順であっても高齢者の齧歯類の科目内で非常に低い死亡率の結果、生後21-24ヶ月（高齢者の人間に相当^）31、そして、したがって、より密接に、最も一般的にモデル化することをラットで脳卒中の治療法を評価するために用いることができる脳卒中患者^25,28の年齢層。容器transectionは、また、いくつかの実用的な目的を提供しています。離断後の出血がないことは、血管が完全に両方の字サイトで閉塞されたことを確認。さらに、離断は血流の永久破壊を確実にします。最後に、離断は、閉塞した血管の末端部分で検出された血流が代替ソースから来なければならないことを保証します。

我々は、特にこの原稿やビデオMCA閉塞のために、この技法を説明するが、最終的には、同一の二重結紮離断技術は開頭術を介してアクセスされ得る任意の脳血管に適用することができる。我々の研究室は、例えば、選択的に一次体性感覚皮質³²内の虚血を誘発するために設計された技術と同様の方法で、一次、および担保血流²⁴の両方をブロックするために遠位MCA分岐のいくつかの追加の永続的な閉塞に関連してpMCAOを利用した。

結論として、T脳卒中のヒト臨床文献に関連する最も一般的な場所（MCA）、タイプ（虚血）、及び損傷の程度（梗塞）：MCAに適用される永続的な閉塞のための彼の方法は密接に人間の虚血性脳卒中の三原色ファセットをモデル化します。また、閉塞のこの方法は、脳全体に単一または複数の閉塞部位に適用してもよいし、生存率が高い高齢の被験者で実施してもよい。この閉塞の動的な、永続的な、そして比較的非侵襲的な性質を考えると、この技術はからの保護や脳卒中の治療のための新たなアプローチを評価する前臨床研究のための追加ツールを表します。

プロトコル

1。入門：必須手術器具

図4を参照してください

1. 歯科用ドリル（KaVo社歯科用機器、モデル：UMXL-TM）、2ビットのドリルと、3ビットのドリル
2. 二つ〜30ゲージの皮下注射針
3. 鋸歯ピンセット、任意の湾曲した先端（有用しかし必須ではないことができます）
4. 二つの先端の細いピンセット
5. ワイヤーカッター
6. 縫合糸
7. マイクロハサミ

2。外科ウィンドウの作成

1. 麻酔：プロシージャはNIHのガイドラインに準拠しており、カリフォルニア大学アーバイン校の動物実験委員会によって承認されている。実験の被験者は295〜400グラム雄Sprague Dawleyラット（チャールズ·リバー·ラボラトリーズ、ウィルミントン、MA、USA）、次の麻酔の手順を使用する必要があります。
   1. Hにおけるアトロピンの筋肉内注射（0.05 mg / kg体重、体重）に続いてペントバルビタールナトリウムボーラス（55 mg / kg体重）をラット腹腔内に注入するIND脚、そして皮下水中5％デキストロースの投与して3.0 ccの。
   2. 必要に応じて、ペントバルビタールナトリウム（27.5 mg / kg体重、体重）注射を補う。次の手順の間に角膜を保護するために眼に眼抗生物質軟膏を管理します。六時間おきに麻酔中に気道分泌を減少させ、5％デキストロース（3 ml）とアトロピン（0.05 mg / kg体重、体重）を管理。メジャー本体直腸プローブを介して温度、および自己調節サーマルブランケットによって37℃で体温を維持する。
2. いずれかの方法でMCAを探します
   1. 2×2ミリメートルイメージングを薄く/頭蓋骨はほぼ透明で、サイズHP 2ドリルビットを使用して完全な透明に間伐までサイズHP 3ドリルビットを使用して体性感覚皮質上のウィンドウを可視化する。 MCAの位置は、このウィンドウと最初のセグメントのおおよその位置を使用し、その近位軌跡を介して見ることができる。 MCAは、一般的にこれを斜めに実行されます（例えば、ビューの外科医の視点から左半球を表示する際の先頭に右/下へ左）背側方向に腹/尾に吻側の窓。外科ウィンドウはその後、観察者が最初に窓を通して見える遠位枝に基づいて配置されるM1セグメント（皮質分岐の近位）を推定する場合に、上記で作成することができます。 MCAへのアクセスを得るために除去される頭蓋骨の量を最小限にするために、画像処理/可視ウィンドウが近くに位置するが、外科手術用ウィンドウとは別にすべきである。
      または
   2. 小手術ウィンドウは卵円孔またはアーチ演壇^30,33,34に近い下顎神経に横約3mm前方と1ミリメートルを配置する必要があります。効果的にMCA（また、M1セグメントとして知られている）のステムにアクセスするためには、側頭筋を一時的に頭蓋表面から反射される。 （注：長期生存の手術の場合には、私たちの研究室の経験は股関節でしたT側頭筋は、そのアンカーに取り付けたままにさせることによって、筋肉が健康的な食行動と体重の効果的な維持管理を可能にする、頭蓋骨の表面に再アニールされます。
3. その最初の皮質枝がどこにあるかを推定するために、撮像窓の吻側、腹角（基準としてこれを使用している場合）にMCAに従ってください。
4. 少し吻側およびMCAのM1セグメント（プリ皮質分岐）があるべき撮像窓（参考としてこれを使用している場合）に腹新しい薄頭蓋骨領域（我々は外科ウィンドウとしてこれを参照してください）​​を作成します。重要な注意：（参考としてこれを使用する場合）、外科ウィンドウ撮像窓の間に約2mmの隙間を残す。
5. 図1Aおよび1Bに示されているようにだけ動脈の分岐皮質前MCAのステムを（また、M1セグメントとしても知られる）を探します。
6. 推定M1セグメント場所上記頭蓋骨薄い、サイズHP-3ドリルビットを使用した。時頭蓋骨はやや透明になり、それは完全に透明になるまで、より繊細なサイズのHP-2ドリルビットと薄い頭蓋骨に切り替えます。外科用ウィンドウ領域が脈管構造を表示し、この時点では、M1の位置を把握し、2〜3ミリメートルM1セグメントの長さのいずれかの側に存在するようにウィンドウ（完了するのに十分薄くなるように視覚的に確認してこれにより、挿入のための部屋とMCAの両側に縫合針の出口）。

重要な注意：頭蓋骨の厚さがラップのそれと類似しているときに間伐を停止します。ドリルが頭蓋骨と硬膜を突き破る場合容器が破裂します。頭蓋骨は、他の一方で十分に薄くされていない場合は、閉塞のためにそれを除去することは難しいだろうと皮質や動脈の損傷につながる可能性があります。

7. 30ゲージ（30 G）皮下注射針を取り、鋸歯ピンセットを使って、針の先端を曲げる。
8. 穿刺頭蓋骨ケアに30 G針を使用して、完全に直接ではなく、動脈の上の領域である。ピンセットは、頭蓋骨を把握し、慎重に手術窓の間伐面積を除去できるようにするには、この穿刺孔を使用してください。
9. 、新しい30 Gのニーズを取るステップ6のように、その先端を曲げ、慎重に硬膜を除去する。

注：硬切削は、ピールバックになりますし、MCAは減圧の結果として、より顕著になるだろう。

3。 MCAを閉塞

1. 3-5程度に縫合針（ラウンド3/8、16ミリメートルの縫合針を）削減半カーブ逆トリミングするワイヤカッターを使用してください。
2. 図4Eに写真のようにトリミングされた縫合針に糸を通す。重要：縫合糸の両端が等しい長さであるので、それは、針がねじ込まれることが重要である。両方の糸の引き上げが同時にM1の下に終了これが可能になり、針が次にMCAの周りに2つの結び目を結ぶために、スレッドの2つの長さを残して自由にカットすることができます。
3. ピンセットは、M1の下に縫合針をスリップ鋸歯を使用してください。皮質の損傷を最小にするようにできるだけ浅くとして滞在が、同様にMCAにすぎ緊張を避け、MCA 0.5から1 mm程度の距離に挿入します。
4. 縫合針は、それがMCAの下になるように反対側に出てくる時、供給を継続又は縫合糸の他端を押しながら反対側から縫合針の先端を引っ張って（以下に示すように）先端の細いピンセットを使用して鋸歯状の先端ピンセットで針。
5. 縫合針が完全にMCAで渡され、引き出された後、糸の長さはMCAの両側に等しくなるまで、縫合針又は糸を引っ張るし続ける。それはMCAへの負担を最小限にするためにを介して供給されるようにスレッドを下に押すと、スレッドが動脈の下を通過するように破裂を防ぐために役立ちます。
6. 縫合針に近い糸をカットします。
7. 得られた2つの縫合糸を解くために、両方の細かい点のピンセットを使用してsがそう触れていないMCAの下に張ら二つの独立したスレッドがあることを。理想的には、スレッドは、彼らはMCAの下を通過離れて約1mmとなります。
8. ノットの間のスペースの〜1 mmが離断の余地を許可することを維持しようとするMCAの周りに糸で2つの別々のノット（2合字）を結ぶために、両方の細かい点のピンセットを使用してください。

注：内部偽制御が必要な場合は、緩いので、彼らはすべてでMCAを収縮し、ノットを締め、血管を切断する前にデータを収集しないことをオクルージョンの結び目を残して閉塞を準備します。それが閉塞する前に何かに引っ掛かる防ぐが、後でノットの締め付け可能にするために十分なスレッドを残してスレッドをトリミング。この方法は、任意の基準イメージングまたはデータ収集が閉塞し、少し遅れて、適切な時点で締め付け結び目と同じ外科手術侵襲の全てを行うことができる。

9. ノットことしたらアンは、2つの結び目の間にM1を横断するためにマイクロはさみを使用し、タイトなプル。
10. 長期的な、生存研究の場合：
    1. 縫合糸は、無菌手術糸のある場所に戻って頭皮フラップを切開または滅菌創傷クリップを使用して組織を固定します。
    2. 創傷領域（例えばバシトラシン軟膏など）に局所的に抗生物質を投与し、全身アンピシリンの予防注射（150 mg / kgをIM）で。
    3. 被写体がまだ麻酔ですが、目に眼科抗生物質軟膏を投与。
    4. 麻酔時の気道分泌物を減少させる補足アトロピン（0.05 mg / kgでIM）を管理します。
    5. 手術の結論と疼痛コントロールのために再び翌朝（〜12時間後）で皮下フルニキシンメグルミンを（1.1 mg / kg）を注入します。
    6. 動物の鼻は傾斜（動物が目を覚ましになるまで、これが呼吸を容易に）上の尻尾の上にあるような乾燥した、暖かい、傾斜面に動物を配置します
    7. それは目を覚まして、独自に安全に移動するまで、動物を監視します。
    8. 動物がビバリウムに戻ってたら、動物の活動は、外観、発声、そして摂食と行動を飲んで、毎日監視する必要があります。

4。安楽死

1. 各実験の終了時に、ラットをペントバルビタールナトリウム（2-3ミリリットル、腹腔内）で安楽死させなければならない。

結果

血管の閉塞の成功は、他の血流イメージング技術のうちイメージング（LSI）をスペックルレーザを用いて確認することができる。 MCAの主要な皮質枝内の血流は、記録システムおよび技術の感度ノイズのレベルに応じて約25％のベースライン以下閉塞以下に低下するべきである。 MCA閉塞前後MCAの皮質枝のセグメントの代表的なLSIの画像については、図3を参照してくだ?...

ディスカッション

このプロトコルは、げっ歯類の大脳皮質内の虚血を誘発する、実験の被験者への最小限の周辺機器への影響でそうするために開発された。二重閉塞および横断方法は、容器が恒久的に閉塞されていることを視覚的に確認可能にし、過度の浸潤または組織損傷を伴うものではなく、高い生存率を用いて行うことができる。この閉塞プロトコルは、特定のドメイン内の皮質虚血を誘導するために?...

資料

Name of the equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Extra Fine Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Slight Curve (1)	Fine Science Tools	11151-10
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps (2)	Fine Science Tools	11252-50
Extra Fine Bonn Scissors, straight (1)	Fine Science Tools	14084-08
Round 3/8 (16 mm) Suture Needles	Fine Science Tools	12050-02
6-0 Braided Silk Suture	Fine Science Tools	NC9071061 Harvard Apparatus No.:510461
30 gauge needle, ½" length	Fine Science Tools	NC9867376 No.:ZT-5-030-5-L/COL