Un modelo de ratón inducida por láser de la hipertensión ocular crónica a Caracterizar los defectos visibles

Resumen

Hipertensión ocular crónica se induce mediante fotocoagulación con láser de la malla trabecular en los ojos de ratón. La presión intraocular (PIO) es elevada durante varios meses después del tratamiento con láser. La disminución de la agudeza visual y la sensibilidad al contraste de los animales experimentales se vigila por medio de la prueba de optomotor.

Resumen

El glaucoma, con frecuencia asociado con la presión intraocular (PIO) elevada, es una de las principales causas de ceguera. Se pretende establecer un modelo de ratón de la hipertensión ocular para imitar glaucoma alta tensión humana. Aquí iluminación láser se aplica al limbo corneal para fotocoagular la salida del humor acuoso, la inducción de ángulo cerrado. Los cambios en la PIO se controlan usando un tonómetro de rebote antes y después del tratamiento con láser. Un ensayo de comportamiento optomotor se utiliza para medir los cambios correspondientes en la capacidad visual. Se muestra el resultado representativo de un ratón que desarrolla PIO elevación sostenida después de la iluminación láser. Una disminución de la agudeza visual y la sensibilidad al contraste se observa en este ocular ratón hipertensiva. Juntos, nuestro estudio introduce un sistema modelo valioso para investigar la degeneración neuronal y los mecanismos moleculares subyacentes en ratones glaucomatosos.

Protocolo

Procedimientos

C57BL/6J ratones (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) se crían en la Instalación de Cuidado de Animales de la Universidad de Northwestern. Todos los animales se utilizan de acuerdo con los protocolos aprobados por la Universidad de Northwestern Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión y conforme a las directrices sobre el uso de animales en Investigación de Neurociencia de la NIH.

1. La fotocoagulación con láser

El procedimiento de fotocoagulación con láser es una modificación de los protocolos previamente publicados ^5-7.

1. Anestesiar a un ratón viejo 40-60 días por una inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg / kg, Butler Schein Animal Health, OH) y xilazina (10 mg / kg, Lloyd Inc. de Iowa, Shenandoah, IA).
2. Dilatar la pupila del ojo derecho del animal experimental por el tratamiento tópico con una o dos gotas de solución de sulfato de atropina 1% (Alcon Laboratorios, Inc., Fort Worth, TX).
3. Después midriasis, aplanar la unacámara de nterior para mejorar la inducción láser ^6. Inserte una micropipeta de vidrio con punta afilada (World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL) en el espacio anterior bajo la lámpara de hendidura (SL-3E, Topcon, Oakland, NJ) para drenar el fluido en la cámara anterior.
4. Restringir el ratón en un soporte de cono de plástico (Braintree Sci Inc., MA) y atado en una plataforma hecha en casa (Ver Figura 1). Mantenga el ratón con inmovilización y expone el ojo derecho del ratón para la fuente de luz detrás de la lámpara de hendidura. Alinear el ojo derecho del ratón anestesiado bajo la lámpara de hendidura.
5. Mientras sostiene el retenedor de ratón con las dos manos, aplicar la iluminación láser para el limbo corneal utilizando un láser de argón (Ultima 2000SE, coherente, Santa Clara, CA). Entregar aproximadamente 80-100 puntos de láser (514 nm, 100 mW, 50 ms de pulso, y 200 micras punto) perpendicularmente alrededor de la circunferencia de la malla trabecular. Los ratones C57BL / 6 tienen iris pigmentada que sirve como una barrera para cualquier potencial energía perdida ^7.
6. Inculcar tópica 0,5% moxifloxacino (Alcon Labs, Inc., Fort Worth, TX) en la superficie ocular para desinfectar el área tratada con láser y el 0,5% Proparacaine (Bausch & Lomb, Rochester, NY) para aliviar el dolor.
7. Mantenga al animal en una almohadilla eléctrica (Sunbeam Products Inc, Boca Raton, FL) para la recuperación durante aproximadamente una hora hasta que esté completamente despierto.
8. El ojo izquierdo es sin tratar para servir como un control.

2. Las mediciones de PIO

1. Coloque el ratón despierto en un tubo de carga en el soporte de cono de plástico y luego siente en la plataforma (véase la Figura 2A).
2. Espere cinco a diez minutos para dejar que el ratón consigue adaptarse a la posición de soporte. Acérquese al tonómetro de rebote (TonoLab, Colonial Medical Supply, Franconia, NH) en el ojo del ratón hasta que la punta de la sonda es de 2 a 3 mm de la superficie de la córnea ^14.
3. Presione el botón de medición para que la punta de la sonda alcanzó la superficie centralde la córnea suavemente. Tres series consecutivas de seis mediciones de PIO del mismo ojo se adquieren y se promediaron como el IOP del ojo. El ojo control no tratado se mide siempre primero para conseguir una lectura de referencia para el ojo tratado con láser que se mide a continuación.

3. Prueba optomotor

La agudeza visual y la sensibilidad al contraste se prueban ^14,15. Los dos ojos de ratones individuales se examinan por separado mediante la inversión de la dirección de rejilla a la deriva, es decir, una rejilla de la deriva las agujas del reloj se utiliza para identificar la función visual del ojo izquierdo y una rejilla a la deriva en sentido antihorario para el ojo derecho ^16. Cada prueba dura aproximadamente 15 minutos y se repite por dos observadores de forma independiente.

1. Coloque el ratón y dejar que el ratón se mueva libremente sobre una plataforma elevada rodeada por cuatro monitores de ordenador (Figura 3A-B).
2. Configurar los monitores para que se muestren a la deriva horizontal sinusoidalrejillas como estímulos visuales con luminancia media de 39 cd / m ^2. La dirección de movimiento de la rejilla debe alternar consecutivamente entre las agujas del reloj y en sentido contrario.
3. Analizar los movimientos del animal. Los movimientos de los animales en-concierto con las rejillas de la deriva se consideran "positivo" dentro de 15 segundos después de que el estímulo visual está encendido y luego se aumenta gradualmente. La respuesta más alta inductora de estímulo visual se define como la agudeza visual del animal ^17.
4. Examine la sensibilidad al contraste en tres frecuencias preseleccionadas espaciales: 0,075, 0,16 y 0,3 ciclos por grado (cpd). El umbral de contraste para cada ojo se define como el contraste más bajo que provoca respuestas visuales a la frecuencia prefijada. La sensibilidad al contraste es el recíproco del umbral ^17.

Resultados

Como se describe en los Procedimientos, iluminación con láser está dirigido a la malla trabecular en la región limbar a fotocoagular la salida del humor acuoso, la inducción de ángulo cerrado (Figura 1). La mayoría de los ojos lasered mostraron ningún daño físico significativo, desprendimiento de pigmento o infección, de acuerdo con los resultados anteriores ^6. Cuando un pequeño grupo de ratones (menos del 5% de todos los animales lasered) mostraron signos físicos de daños grave...

Discusión

Se presenta por encima de que la hipertensión ocular sostenida puede ser inducida por iluminación con láser en ojos de ratón. En comparación con el modelo de inyección de solución salina ¹⁸ y el cauterio modelo de vena ¹¹ ambos de los cuales requieren amplios conocimientos de microcirugía, la iluminación con láser es relativamente simple y fácil de realizar. Por lo general, se puede realizar la iluminación láser para 4-6 ratones en 2-3 horas. Los pasos críticos para lograr la elevaci?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent
moxifloxacin	Alcon Labs, Inc.	NDC 0065-4013-03	0.5 %, Rx only
Proparacaine Hydrochloride	Bausch & Lomb	NDC 24208-730-06	0.5 %, Rx only
Ophthalmic Solution USP	Bausch & Lomb	NDC 24208-730-06	.5 %, Rx only
ketamine	Butler Schein Animal Health	NDC 11695-0550-1	100 mg / kg
xylazine	LLOYD Inc. of Iowa	NADA 139-236	10 mg / kg
atropine sulfate solution	Alcon Labs, Inc.	NDC 61314-303-02	1 %, Rx only
			Equipment
Slit Lamp, TOPCON	Visual Systems Inc	SL-3E	powered by PS-30A
OptoMotry 1.8.0 virtual	CerebralMechanics Inc.
opto-kinetic testing system	CerebralMechanics Inc.
Tonometer, TonoLab, for mice	Colonial Medical Supply
Heating pad	Sunbeam Products Inc	722-810
Argon laser	Coherent Inc	Ultima 2000SE
DECAPICONE Plastic cone holder	Braintree Sci Inc.	MDC-200	for mouse