Um modelo de rato induzida por laser de crônica Ocular Hypertension para Caracterizar defeitos visuais

Resumo

Hipertensão ocular crônica é induzida pelo uso de fotocoagulação a laser da malha trabecular em rato olhos. A pressão intra-ocular (IOP) é ​​elevada durante vários meses após o tratamento com laser. A diminuição da acuidade visual e sensibilidade ao contraste de animais experimentais são monitorados por meio do teste optomotor.

Resumo

Glaucoma, frequentemente associada com a pressão intra-ocular elevada (PIO), é uma das principais causas de cegueira. Buscou-se estabelecer um modelo do rato de hipertensão ocular para imitar alta tensão humana glaucoma. Aqui iluminação laser é aplicado ao limbo corneano para photocoagulate o escoamento do humor aquoso, induzindo fechamento angular. As mudanças de pressão intra-ocular são monitorizadas utilizando um tonómetro rebote antes e após o tratamento com laser. Um teste comportamental optomotor é usado para medir as mudanças correspondentes na capacidade visual. O resultado representante de um rato que desenvolveu elevação da PIO sustentada após a iluminação a laser é mostrado. Uma diminuição da acuidade visual e sensibilidade ao contraste é observado neste rato hipertenso ocular. Juntos, nosso estudo apresenta um modelo de sistema valioso para investigar a degeneração neuronal e dos mecanismos moleculares subjacentes em camundongos portadores de glaucoma.

Protocolo

Procedimentos

Camundongos C57BL/6J (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) são levantadas a Animal Care Facility da Universidade Northwestern. Todos os animais são utilizados em conformidade com os protocolos aprovados pela Northwestern University Animal Care Institucional e Comitê de Uso e conformados com as orientações sobre o uso de animais em pesquisa Neurociência do NIH.

1. Fotocoagulação a laser

O procedimento de fotocoagulação com laser é modificado a partir de protocolos previamente publicados ^5-7.

1. Anestesiar um rato de 40-60 dias de idade por uma injecção intraperitoneal de cetamina (100 mg / kg, Butler Schein Animal Health, OH) e xilazina (10 mg / kg, Lloyd Inc. de Iowa, Shenandoah, IA).
2. Dilatar a pupila do olho direito do animal experimental por tratamento tópico com uma ou duas gotas de solução de sulfato de atropina 1% (Alcon Labs, Inc., Fort Worth, TX).
3. Depois de midríase, achatar a umcâmara nterior para aumentar a indução de laser ^6. Insira uma micropipeta de vidro com a ponta afiada (World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL) para o espaço anterior sob a lâmpada de fenda (SL-3E, Topcon, Oakland, NJ), para drenar o fluido na câmara anterior.
4. Contenha o mouse em uma porta-cone de plástico (Braintree Sci Inc., MA) e amarrado em uma plataforma caseiro (veja a Figura 1A). Segure o mouse com limitador e expõe o olho direito do mouse para a fonte de luz por trás da lâmpada de fenda. Alinhe o olho direito do rato anestesiado sob a lâmpada de fenda.
5. Enquanto segura o limitador do mouse com as duas mãos, aplique a iluminação a laser para o limbo da córnea utilizando um laser de argônio (Ultima 2000SE, Coherent, Santa Clara, CA). Entregar cerca de 80-100 pontos de laser (514 nm, 100 mW, 50 ms de pulso, e 200 no local im) perpendicularmente ao redor da circunferência da rede trabecular. Os ratinhos C57BL / 6 têm íris pigmentada, que serve como uma barreira para qualquer pOTENCIAIS energia perdida ^7.
6. Instill tópica de 0,5% de moxifloxacina (Alcon Labs, Inc., Fort Worth, TX) na superfície ocular, para desinfectar a zona tratada com laser e proparacaína a 0,5% (Bausch & Lomb de Rochester, NY, EUA), para aliviar a dor.
7. Mantenha o animal em uma almofada de aquecimento (Sunbeam Products Inc, Boca Raton, FL) para a recuperação de cerca de uma hora até que esteja completamente desperto.
8. O olho esquerdo é tratado para servir como controlo.

2. PIO

1. Posicione o mouse acordado em um tubo de carregar no porta-cone de plástico e então restringi-lo na plataforma (Figura 2A).
2. Permitir que cinco a dez minutos para permitir que o rato se adaptar à posição do suporte. Aproxime-se do tonômetro de rebote (TonoLab, Colonial Medical Supply, Franconia, NH) aos olhos do mouse até a ponta da sonda é de 2-3 mm de distância da superfície da córnea ^14.
3. Pressione o botão de medição para deixar a ponta da sonda atingir a superfície do centrode córnea suavemente. Três conjuntos consecutivos de seis medições da pressão intra-ocular do olho mesmas são adquiridos e a média calculada como o IOP do olho. O olho de controlo não tratada é sempre medido primeiro para obter uma leitura de linha de base para o olho tratado com laser, que é medida em seguida.

3. Teste Optomotor

Acuidade visual e sensibilidade ao contraste são testados ^14,15. Os dois olhos de ratinhos individuais são analisados ​​separadamente, invertendo a direcção ralar deriva, ou seja uma grelha derivação dos ponteiros do relógio é usada para identificar a função visual do olho esquerdo e uma grelha flutuando anti-horário para o olho direito ^16. Cada teste demora cerca de 15 minutos e é repetido por dois observadores de forma independente.

1. Posicione o mouse e deixar o mouse para mover-se livremente em uma plataforma elevada rodeada por quatro monitores de computador (Figura 3A-B).
2. Configure os monitores para que eles exibem horizontalmente à deriva sinusoidalgrades como estímulos visuais com luminância média de 39 cd / m ^2. A direção do movimento da grade deve alternar consecutivamente entre em sentido horário e anti-horário.
3. Analisar os movimentos do animal. Os movimentos do animal no-show com as grades à deriva são considerados "positivos" no prazo de 15 segundos após o estímulo visual está ligado e, em seguida, aumentada gradualmente. A maior resposta eliciador estímulo visual é definido como a acuidade visual do animal ^17.
4. Examine a sensibilidade ao contraste em três freqüências pré-selecionadas espaciais: 0,075, 0,16 e 0,3 ciclos por grau (cpg). O limiar de contraste, para cada olho é definido como a menor contraste que provoca respostas visuais com a frequência pré-fixada. A sensibilidade de contraste é o recíproco do limiar ^17.

Resultados

Tal como descrito nos Procedimentos, iluminação laser é apontado para a malha trabecular na região límbica para photocoagulate o escoamento do humor aquoso, induzindo ângulo fechado (Figura 1). Olhos mais lasered exibiu nenhum dano físico significativo, descolamento pigmento ou infecção, de acordo com os achados anteriores ^6. Quando um pequeno grupo de ratos (menos de 5% de todos os animais lasered) apresentaram sinais de danos físicos graves, como bolas deflacionados oculares grave...

Discussão

Descrevemos anteriormente que a hipertensão ocular sustentada pode ser induzida pela iluminação do laser em olhos de rato. Em comparação com o modelo de injecção de solução salina ¹⁸ e o modelo cautério veia ¹¹ ambos os quais requerem extensivas técnicas de microcirurgia, a iluminação laser é relativamente simples e fácil de executar. Normalmente, podemos realizar a iluminação a laser para 4-6 ratos em 2-3 horas. Os passos fundamentais para alcançar elevação da PIO sustentado s?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent
moxifloxacin	Alcon Labs, Inc.	NDC 0065-4013-03	0.5 %, Rx only
Proparacaine Hydrochloride	Bausch & Lomb	NDC 24208-730-06	0.5 %, Rx only
Ophthalmic Solution USP	Bausch & Lomb	NDC 24208-730-06	.5 %, Rx only
ketamine	Butler Schein Animal Health	NDC 11695-0550-1	100 mg / kg
xylazine	LLOYD Inc. of Iowa	NADA 139-236	10 mg / kg
atropine sulfate solution	Alcon Labs, Inc.	NDC 61314-303-02	1 %, Rx only
			Equipment
Slit Lamp, TOPCON	Visual Systems Inc	SL-3E	powered by PS-30A
OptoMotry 1.8.0 virtual	CerebralMechanics Inc.
opto-kinetic testing system	CerebralMechanics Inc.
Tonometer, TonoLab, for mice	Colonial Medical Supply
Heating pad	Sunbeam Products Inc	722-810
Argon laser	Coherent Inc	Ultima 2000SE
DECAPICONE Plastic cone holder	Braintree Sci Inc.	MDC-200	for mouse