Un modello di topo indotta da laser di cronica ipertensione oculare per caratterizzare difetti visivi

Riepilogo

Ipertensione oculare cronica è indotta mediante fotocoagulazione laser del trabecolato negli occhi del mouse. La pressione intraoculare (IOP) è elevato per diversi mesi dopo il trattamento laser. La diminuzione di acuità visiva e la sensibilità al contrasto di animali da esperimento sono monitorati utilizzando il test optomotor.

Abstract

Glaucoma, frequentemente associata a elevata pressione intraoculare (IOP), è una delle principali cause di cecità. Abbiamo cercato di stabilire un modello murino di ipertensione oculare per imitare ad alta tensione umana glaucoma. Qui illuminazione laser è applicato al limbus corneale per fotocoagulare il deflusso acquosa, inducendo chiusura dell'angolo. Le variazioni di IOP sono controllati mediante un tonometro rimbalzo prima e dopo il trattamento laser. Un test comportamentale optomotor viene utilizzato per misurare corrispondenti variazioni della capacità visiva. Il risultato rappresentante di un topo che si è sviluppato subito dopo IOP elevazione illuminazione laser è indicato. Un acuità visiva diminuita e la sensibilità al contrasto sono osservati in questo oculare ipertensiva mouse. Insieme, il nostro studio introduce un sistema modello prezioso per studiare la degenerazione neuronale e dei meccanismi molecolari sottostanti nei topi glaucomatosi.

Protocollo

Procedure

C57BL/6J topi (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) sono allevati presso la Northwestern University Animal Care strumento. Tutti gli animali sono utilizzati secondo protocolli approvati dalla Northwestern University Institutional Animal Care e del Comitato uso e conforme alle linee guida sull'uso degli animali in Neuroscience Research dal NIH.

1. Fotocoagulazione laser

La procedura di fotocoagulazione laser viene modificata dai protocolli precedentemente pubblicati ^5-7.

1. Anestetizzare un 40-60 giorni vecchio mouse con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg / kg, Butler Schein la salute degli animali, OH) e xilazina (10 mg / kg, Lloyd Inc. di Iowa, Shenandoah, IA).
2. Dilatare la pupilla dell'occhio destro dell'animale sperimentale per il trattamento topico con una o due gocce di soluzione di solfato di atropina 1% (Alcon Labs, Inc., Fort Worth, TX).
3. Dopo midriasi, appiattire l'unacamera di nterior per migliorare l'induzione laser ^6. Inserire una micropipetta di vetro con punta acuminata (World Precision Instruments Inc, Sarasota, FL) nello spazio anteriore sotto la lampada a fessura (SL-3E, Topcon, Oakland, NJ) per drenare il liquido nella camera anteriore.
4. Frena il mouse in un supporto cono di plastica (Braintree Sci Inc., MA) e legato su una piattaforma fatta in casa (vedere Figura 1A). Tenere il mouse con dispositivo di immobilizzazione ed espone l'occhio destro del mouse per la fonte di luce dietro la lampada a fessura. Allineare l'occhio destro del mouse anestetizzato sotto la lampada a fessura.
5. Tenendo premuto il dispositivo di immobilizzazione del mouse con entrambe le mani, applicare l'illuminazione laser per il limbus corneale utilizzando un laser ad Argon (Ultima 2000SE, Coherent, Santa Clara, CA). Trasporti circa 80-100 punti laser (514 nm, 100 mW, 50 msec impulsi e 200 pronti micron) perpendicolarmente intorno alla circonferenza del trabecolato. I topi C57BL / 6 hanno iride pigmentata che funge da barriera per ogni pPotenziali energia randagio ^7.
6. Instillare topico 0,5% moxifloxacina (Alcon Labs, Inc., Fort Worth, TX) sulla superficie oculare per disinfettare la zona trattata con laser e 0,5% Proparacaine (Bausch & Lomb, Rochester, NY) per alleviare il dolore.
7. Tenere l'animale su una piastra elettrica (Sunbeam Products Inc, Boca Raton, FL) per il recupero per circa un'ora fino a quando non è completamente sveglio.
8. L'occhio sinistro è trattata per servire come controllo.

2. IOP Misure

1. Posizionare il mouse svegli in un tubo di caricare nel porta cono di plastica e poi frenare sulla piattaforma (vedi Figura 2A).
2. Consentire 9:55 minuti per lasciare il mouse ottenere adattato alla posizione di titolare. Avvicinatevi al tonometro rimbalzo (TonoLab, coloniale Medical Supply, Franconia, NH) per l'occhio del mouse fino a quando la punta della sonda è di 2-3 mm di distanza dalla superficie della cornea ^14.
3. Premere il tasto di misurazione per lasciare la punta della sonda ha colpito la superficie del centrodella cornea con delicatezza. Tre set consecutivi di sei misure di IOP dello stesso occhio sono acquisite e mediate come la IOP dell'occhio. L'occhio controllo non trattato è sempre misurato prima di ottenere una lettura di base per l'occhio laser-trattato che viene misurato dopo.

3. Prova Optomotor

Acuità visiva e la sensibilità al contrasto sono testati ^14,15. Due occhi del singoli topi sono esaminati separatamente invertendo il senso reticolo deriva, cioè un reticolo deriva in senso orario viene utilizzato per identificare la funzione visiva dell'occhio sinistro e una grata alla deriva in senso antiorario per l'occhio destro ^16. Ogni test richiede circa 15 minuti e si ripete da due osservatori in modo indipendente.

1. Posizionare il mouse e lasciare il mouse per muoversi liberamente su una piattaforma elevata, circondato da quattro monitor per computer (Figura 3A-B).
2. Impostare i monitor in modo da visualizzare alla deriva orizzontalmente sinusoidalegrate come stimoli visivi con luminanza media di 39 cd / m ^2. La direzione di spostamento del reticolo deve alternare consecutivamente tra senso orario e antiorario.
3. Analizzare i movimenti dell'animale. Movimenti degli animali in-concerto con le grate alla deriva sono considerati "positivi" entro 15 secondi dopo lo stimolo visivo è accesa e poi gradualmente aumentata. La risposta di elicitare massima stimolo visivo è definita come acuità visiva dell'animale ^17.
4. Esaminare la sensibilità al contrasto a tre pre-selezionati frequenze spaziali: 0.075, 0.16, e 0,3 cicli per grado (CPD). La soglia di contrasto per ciascun occhio è definita come la più bassa contrasto che suscita risposte visive alla frequenza prefissata. La sensibilità al contrasto è il reciproco della soglia ^17.

Risultati

Come descritto nelle Procedure, illuminazione laser è finalizzata alla trabecolato nella regione limbare fotocoagulare per il deflusso acquosa, inducendo chiusura di angolo (Figura 1). Occhi più esposte al laser senza significativi danni fisici, distacco pigmento o infezione, in linea con i risultati precedenti ^6. Quando un piccolo gruppo di topi (meno del 5% di tutti gli animali al laser) espone i segni fisici di gravi danni, come palle sgonfie occhio, grave cataratta, distacco significati...

Discussione

Segnaliamo soprattutto che l'ipertensione oculare sostenuta può essere indotta da illuminazione laser negli occhi del mouse. Rispetto al modello iniezione salina ¹⁸ e il modello cauterizzazione vena ¹¹ entrambi richiedono estese competenze microchirurgia, l'illuminazione laser è relativamente semplice e facile da eseguire. Di solito siamo in grado di eseguire l'illuminazione laser per 4-6 topi in 2-3 ore. I passi fondamentali per raggiungere sostenuta IOP elevazione sono la camera ant...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent
moxifloxacin	Alcon Labs, Inc.	NDC 0065-4013-03	0.5 %, Rx only
Proparacaine Hydrochloride	Bausch & Lomb	NDC 24208-730-06	0.5 %, Rx only
Ophthalmic Solution USP	Bausch & Lomb	NDC 24208-730-06	.5 %, Rx only
ketamine	Butler Schein Animal Health	NDC 11695-0550-1	100 mg / kg
xylazine	LLOYD Inc. of Iowa	NADA 139-236	10 mg / kg
atropine sulfate solution	Alcon Labs, Inc.	NDC 61314-303-02	1 %, Rx only
			Equipment
Slit Lamp, TOPCON	Visual Systems Inc	SL-3E	powered by PS-30A
OptoMotry 1.8.0 virtual	CerebralMechanics Inc.
opto-kinetic testing system	CerebralMechanics Inc.
Tonometer, TonoLab, for mice	Colonial Medical Supply
Heating pad	Sunbeam Products Inc	722-810
Argon laser	Coherent Inc	Ultima 2000SE
DECAPICONE Plastic cone holder	Braintree Sci Inc.	MDC-200	for mouse