Un modèle de souris induite par laser de l'hypertension oculaire chronique pour caractériser les défauts d'apparence

Résumé

Hypertension oculaire chronique est induite en utilisant la photocoagulation au laser du trabéculum dans les yeux de souris. La pression intraoculaire (PIO) est élevée pendant plusieurs mois après le traitement au laser. La diminution de l'acuité visuelle et la sensibilité au contraste des animaux expérimentaux sont surveillés en utilisant le test optomoteur.

Résumé

Le glaucome, souvent associé à une pression intraoculaire (PIO) élevée, est l'une des principales causes de cécité. Nous avons cherché à établir un modèle de souris de l'hypertension oculaire pour imiter haute tension humaine glaucome. Ici illumination laser est appliqué sur le limbe cornéen à photocoagulate l'écoulement aqueux, induisant fermeture de l'angle. Les variations de pression intraoculaire sont surveillés à l'aide d'un tonomètre à rebond avant et après le traitement au laser. Un test de comportement optomoteur est utilisé pour mesurer les changements correspondants dans la capacité visuelle. Le résultat représentatif d'une souris qui a développé élévation de la PIO soutenue après l'illumination laser est affiché. Une diminution de l'acuité visuelle et la sensibilité au contraste est observé dans ce oculaire souris hypertensive. Ensemble, notre étude introduit un système modèle intéressant d'étudier la dégénérescence neuronale et les mécanismes moléculaires sous-jacents chez les souris glaucomateux.

Protocole

Procédures

C57BL/6J souris (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) sont portées à la Facilité de protection des animaux de l'Université Northwestern. Tous les animaux sont utilisés conformément aux protocoles approuvés par Northwestern University Institutional Animal Care et du Comité de l'utilisation et conforme aux lignes directrices sur l'utilisation des animaux en recherche en neurosciences du NIH.

1. La photocoagulation au laser

La procédure de photocoagulation laser est modifiée à partir de protocoles publiés précédemment ^5-7.

1. Anesthésier une vieille souris de 40-60 jours par une injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg / kg, Butler Schein santé animale, OH) et de xylazine (10 mg / kg, Lloyd Inc. de l'Iowa, Shenandoah, IA).
2. Dilater la pupille de l'oeil droit de l'animal expérimental par traitement topique avec une ou deux gouttes de solution de sulfate d'atropine à 1% (Alcon Labs, Inc., Fort Worth, TX).
3. Après mydriase, aplatir la unechambre nterior pour améliorer l'induction laser ^6. Insérez une micro-pipette en verre avec bout pointu (World Precision Instruments Inc, Sarasota, Floride) dans l'espace antérieure sous la lampe à fente (SL-3E, Topcon, Oakland, NJ) pour vidanger le liquide dans la chambre antérieure.
4. Retenez la souris dans un porte-cône en plastique (Braintree Sci Inc., MA) et ligoté sur une plate-forme maison (voir la figure 1A). Maintenez la souris avec retardateur et expose l'oeil droit de la souris vers la source de lumière derrière la lampe à fente. Aligner l'œil droit de la souris anesthésiée sous la lampe à fente.
5. Tout en maintenant le dispositif de retenue de la souris avec les deux mains, appliquez l'illumination laser au limbe cornéen à l'aide d'un laser Argon (Ultima 2000SE, Coherent, Santa Clara, CA). Livrer environ 80-100 spots laser (514 nm, 100 mW, 50 ms impulsion, et 200 spots pm) perpendiculairement autour de la circonférence du trabéculum. Les souris C57BL / 6 ont iris pigmenté qui sert de barrière pour tout potentiel énergie perdue ^7.
6. Instiller topique 0,5% moxifloxacine (Alcon Labs, Inc., Fort Worth, TX) sur la surface oculaire pour désinfecter la zone traitée au laser et de 0,5% Proparacaine (Bausch & Lomb, Rochester, NY) pour soulager la douleur.
7. Gardez l'animal sur un coussin chauffant (Sunbeam Products Inc, Boca Raton, FL) pour la récupération pendant environ une heure jusqu'à ce qu'il soit complètement réveillé.
8. L'oeil gauche est non traitée pour servir de témoin.

2. IOP mesures

1. Placez la souris éveillé dans un tube à charger dans le porte-cône en plastique, puis le retenir sur la plate-forme (voir figure 2A).
2. Permettre cinq à dix minutes pour laisser la souris et s'adapter à la position de la porte. Approchez-vous du tonomètre à rebond (TonoLab, Colonial Medical Supply, Franconia, NH) à l'œil de la souris jusqu'à la pointe de la sonde est de 2-3 mm de la surface de la cornée ^14.
3. Appuyez sur le bouton de mesure de laisser la pointe de la sonde a atteint la surface du centrede la cornée doucement. Trois séries consécutives de six mesures de la PIO du même œil sont acquises et que la moyenne de la PIO de l'oeil. L'oeil du témoin non traité est toujours mesurée premier à obtenir une lecture de référence pour l'œil traité par laser qui est mesurée suivant.

3. Test optomoteur

L'acuité visuelle et la sensibilité aux contrastes sont testés ^14,15. Les deux yeux de souris individuelles sont examinées séparément en inversant le sens de la grille à la dérive, c'est à dire un réseau dérive vers la droite est utilisée pour identifier la fonction visuelle de l'oeil gauche et un réseau à la dérive dans le sens antihoraire pour l'oeil droit ^16. Chaque test dure environ 15 minutes et est répété par deux observateurs indépendamment.

1. Placez la souris et la souris permet de se déplacer librement sur ​​une plate-forme surélevée entourée de quatre écrans d'ordinateur (figure 3A-B).
2. Mettre en place les moniteurs afin qu'ils écran horizontalement dérive sinusoïdalegrilles en tant stimuli visuels en appliquant une luminance moyenne de 39 cd / m ^2. Le sens de déplacement du réseau de diffraction doit alterner consécutivement entre droite et à gauche.
3. Analyser les mouvements de l'animal. Les mouvements de l'animal en concert avec les réseaux de dérive sont considérés comme "positive" dans les 15 secondes après le stimulus visuel est en marche et ensuite progressivement augmentée. La réponse la plus élevée, provoquant stimulus visuel est définie comme une acuité visuelle de l'animal ^17.
4. Examiner la sensibilité de contraste à trois présélectionnés fréquences spatiales: 0,075, 0,16 et 0,3 cycles par degré (CPD). Le seuil de contraste pour chaque oeil est défini comme étant la plus faible contraste qui provoque des réponses visuelles à la fréquence pré-déterminée. La sensibilité au contraste est l'inverse du seuil ^17.

Résultats

Comme décrit dans les procédures, illumination laser est dirigé vers le trabéculum dans la région limbique à photocoagulate l'écoulement aqueux, provoquant la fermeture de l'angle (figure 1). La plupart des yeux sérigraphiés au laser ne présentaient pas de dommages physiques importants, le détachement de pigment ou d'une infection, en accord avec les résultats antérieurs ^6. Quand un petit groupe de souris (moins de 5% de tous les animaux sérigraphiés au laser) a mon...

Discussion

Nous rapportons ci-dessus que l'hypertension oculaire soutenue peut être induite par illumination laser dans les yeux de souris. Par rapport au modèle d'injection saline ¹⁸ et le modèle de cautérisation de la veine ¹¹ qui exigent tous deux de vastes compétences de microchirurgie, l'illumination laser est relativement simple et facile à réaliser. Habituellement, nous pouvons réaliser l'illumination laser pour 4-6 souris dans 2-3 heures. Les étapes essentielles pour atteindre...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent
moxifloxacin	Alcon Labs, Inc.	NDC 0065-4013-03	0.5 %, Rx only
Proparacaine Hydrochloride	Bausch & Lomb	NDC 24208-730-06	0.5 %, Rx only
Ophthalmic Solution USP	Bausch & Lomb	NDC 24208-730-06	.5 %, Rx only
ketamine	Butler Schein Animal Health	NDC 11695-0550-1	100 mg / kg
xylazine	LLOYD Inc. of Iowa	NADA 139-236	10 mg / kg
atropine sulfate solution	Alcon Labs, Inc.	NDC 61314-303-02	1 %, Rx only
			Equipment
Slit Lamp, TOPCON	Visual Systems Inc	SL-3E	powered by PS-30A
OptoMotry 1.8.0 virtual	CerebralMechanics Inc.
opto-kinetic testing system	CerebralMechanics Inc.
Tonometer, TonoLab, for mice	Colonial Medical Supply
Heating pad	Sunbeam Products Inc	722-810
Argon laser	Coherent Inc	Ultima 2000SE
DECAPICONE Plastic cone holder	Braintree Sci Inc.	MDC-200	for mouse