Impresión Moldes inversa termosensible para la Creación de modelado hidrogeles de dos componentes para el 3D de cultivo celular

Resumen

Un bioprinter se utilizó para crear hidrogeles modelado basado en un molde de sacrificio. El molde poloxámero se rellenó con un segundo hidrogel y luego se eluyó, dejando huecos que estaban llenos de una tercera hidrogel. Este método utiliza elución rápida y buena capacidad de impresión de poloxámero para generar arquitecturas complejas a partir de biopolímeros.

Resumen

Bioprinting es una tecnología emergente que tiene su origen en la industria del prototipado rápido. Los procesos de impresión diferentes se pueden dividir en bioprinting contacto ^1-4 (extrusión, pluma de la inmersión y la litografía blanda), ^5-7 (transferencia de láser hacia adelante, la deposición de chorro de tinta) sin contacto bioprinting y técnicas basadas en láser, tales como dos fotones fotopolimerización ^8. Se puede utilizar para muchas aplicaciones tales como la ingeniería de tejidos ^{9-13, 14-16} y microfabricación biosensor como una herramienta para responder a las preguntas biológicas básicas tales como las influencias de co-cultivo de diferentes tipos de células ^17. A diferencia de métodos fotolitográficos o suave-litográfica comunes, bioprinting extrusión tiene la ventaja de que no requiere una máscara o sello separado. El uso de software CAD, el diseño de la estructura se puede cambiar rápidamente y ajusta de acuerdo con los requisitos del operador. Esto hace que bioprinting más flexible que la litografía basadaenfoques.

Aquí se demuestra la impresión de un molde de sacrificio para crear una estructura de múltiples materiales 3D utilizando una matriz de pilares dentro de un hidrogel como un ejemplo. Estos pilares podrían representar estructuras huecas de una red vascular o los tubos dentro de un conducto de guía del nervio. El material escogido para el molde de sacrificio era poloxámero 407, un polímero termosensible con excelentes propiedades de impresión que es líquida a 4 ° C y un sólido por encima de su temperatura de gelificación ~ 20 ° C durante 24,5 soluciones w / v ^18%. Esta propiedad permite que el molde de sacrificio poloxámero basado en que se eluyó en la demanda y tiene ventajas con respecto a la lenta disolución de un material sólido, especialmente para geometrías estrechas. Poloxámero se imprimió en portaobjetos de vidrio para microscopio para crear el molde de sacrificio. La agarosa se pipeteó en el molde y se enfría hasta la gelificación. Después de la elución de la poloxámero en agua fría de hielo, los huecos en el molde de agarosa se llenaron con alginato de metacrilato spIKED con fibrinógeno marcado con FITC. Los huecos llenos fueron entonces reticuladas con UV y el constructo fue fotografiada con un microscopio de epifluorescencia.

Introducción

Enfoques de ingeniería de tejidos han avanzado mucho en los últimos años con respecto a la regeneración de tejidos y órganos humanos ^19,20. Sin embargo, hasta ahora, el enfoque de la ingeniería de tejidos ha sido a menudo limitado a los tejidos que tienen una estructura simple o de pequeñas dimensiones, tales como la vejiga o la piel ^{21,22 23-25.} El cuerpo humano, sin embargo, contiene muchos tejidos tridimensionales complejas en las que las células y la matriz extracelular están dispuestos de una manera espacialmente definido. Para la fabricación de estos tejidos, se requiere una técnica que puede colocar las células y los andamios de matriz extracelular dentro de una construcción de tres dimensiones en las posiciones especificadas. Bioprinting tiene el potencial de ser una técnica tal donde la visión de la fabricación de tejidos tridimensionales complejas puede ser realizado ^10,11,26-28.

Bioprinting se define como "el uso de los procesos de transferencia de material para modelar y montaje biológicamente relmateriales nentes - moléculas, células, tejidos y biomateriales biodegradables. - con una organización prescrita para llevar a cabo una o más funciones biológicas ^"4 abarca varias técnicas diferentes que funcionan a diferentes resoluciones y escalas de longitud, que van desde la resolución sub-micras de dos polimerización de fotón ²⁹ a una resolución de 150 micras a 420 micras para la impresión de extrusión ^1,12,30. No es un único material o combinación de materiales va a satisfacer los requisitos de cada método ^31. Para la impresión de extrusión, los parámetros clave son la viscosidad y el tiempo de gelificación ^32, donde son deseables alta viscosidad y gelificación rápida.

La impresión 3D es una técnica que permite la fácil creación de moldes de sacrificio para crear geometrías complejas ^30,33,34. Este proceso se basa en la construcción de un molde usando una técnica de prototipado rápido tal como un bioprinter extrusión. Se utiliza el molde de sacrificio creadopara formar estructuras complejas a partir de materiales que son difíciles de imprimir, debido a su baja viscosidad y tiempo de gelificación lenta. El método que aquí se presenta implica la creación de un molde de sacrificio consiste en un material que se disuelve rápidamente a baja temperatura y puede ser extruido con precisión. El bloque de copolímero de poli (etileno glicol) _99-poli (propilenglicol) _67-poli (etilenglicol) ₉₉ (también conocido como Pluronic F127 o poloxámero 407) cumple estos requisitos. Ya se ha utilizado en una versión modificada en la impresión de extrusión ^1, pero, a nuestro conocimiento, nunca se ha utilizado para la impresión en su versión sin modificar debido a su inestabilidad en ambientes líquidos. Poloxámero 407 también muestra un comportamiento de respuesta térmica inversa ¹⁸ es decir, que cambia de un gel a un sol tras el enfriamiento. Lo más importante es que se puede imprimir en las estructuras arbitrariamente curvas complejas con muy alta fidelidad. Esto permite la creación de un hidrogel estructurado a partir de unmaterial de baja viscosidad, en este caso de gelificación lenta de agarosa, con la pipeta la solución en el molde de sacrificio impreso. La combinación de la impresión del molde de sacrificio con alta fidelidad, y su elución rápida del hidrogel estructurado fundido hace que sea un método rápido y flexible para crear moldes con diferentes geometrías sin el uso de una máscara o un sello, ya que se requiere a menudo en métodos litográficos. El hidrogel estructurado fundido puede llenarse aún más con otro material que no es adecuado para la impresión de extrusión debido a su baja viscosidad. Esto es, en nuestro caso una solución metacrilato alginato de baja viscosidad. Aquí presentamos el método de sacrificio termosensible moldes inversa para modelar hidrogel utilizando el ejemplo de una matriz de pilar.

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Protocolo

1. Preparación de la solución de 407 Poloxámero

Si está disponible, lleve a cabo la preparación de la solución de poloxámero en una habitación fría (4 ° C). Si no está disponible, colocar una botella de vidrio en un vaso de precipitados lleno de agua enfriada con hielo. A temperaturas más altas el poloxámero estará por encima del punto de gel y no se disuelve apropiadamente.

1. Añadir 60 ml de solución de PBS frío de hielo en una botella de vidrio y se agita vigorosamente con un agitador magnético.
2. Pesar 24,5 gramos de poloxámero y añadirlo en pequeñas cantidades a la PBS frío. Espere hasta que el poloxámero han disuelto antes de añadir más.
3. Se agita la solución hasta que se haya disuelto todo el poloxámero.
4. Añadir PBS frío hasta que se alcanza un volumen final de 100 ml. La concentración final será de 24,5% w / v
5. Deja de agitar la solución y se deja reposar a 4 ° C hasta que las burbujas y la espuma en la solución han desaparecido. Las burbujas que son atrapadas dentro del gel se transfirieron a la pcartucho IMPRESORA y dará lugar a defectos en los moldes de sacrificio impresos.
6. Filtro (filtro de 0,22 micras) la solución directamente en el cartucho de impresión para eliminar las partículas no deseadas que podrían obstruir la aguja. La etapa de filtración se debe realizar en una habitación fría (o si no está disponible con las puntas enfriados, filtro, etc) para evitar la gelificación de la poloxámero en el filtro. Mantenga el cartucho cargado a 4 ° C hasta 30 minutos antes del experimento.

2. Preparación de la impresora 3D

La impresora 3D utilizado en este trabajo fue el "Biofábrica" ​​de regenHU. La parte del sistema de extrusión consta de varias partes. Un cartucho a presión en la parte superior está unida a un conector a través de un adaptador de cierre luer. El conector de puente entre los espacios entre la salida del cartucho y la entrada de una válvula de solenoide. A la salida de la válvula de solenoide, agujas de diferentes diámetros se pueden utilizar. El material se extruye sobre un subtrar que se mantiene a una etapa en movimiento por medio de vacío. Las partes principales del sistema se representan en la Figura 1. Otros sistemas basados ​​en extrusión se pueden utilizar para el proceso de impresión, y el proceso de optimización que hay que hacer para cada sistema.

1. Coloque la válvula de solenoide (diámetro de la boquilla 0,3 mm) y la aguja (diámetro interior 0,15 mm) en tubos de ensayo separados 1,5 ml llenos con agua ultrapura y colocarlas en un baño de ultrasonidos para limpiar climatizada durante 30 min. Enjuague las válvulas limpias con etanol y secar con una pistola de nitrógeno.
2. Instalar la válvula y la aguja en la impresora, así como un, cartucho vacía y limpia.
3. Aplicar 3 bar de presión en el sistema y apagar todos los líquidos residuales de la válvula instalada y la aguja con aire a presión. Para los pequeños diámetros de aguja, se recomienda tener un filtro (filtro de jeringa común, 0,45 micras de tamaño de poro) instalado en la salida del aire comprimido para evitar la entrada de pequeñas partículas que podrían obstruir la aguja.
4. Gire a la presión e instalar el cartucho cargado con el poloxámero. El cartucho se debe tomar de la nevera aproximadamente 30 min antes de montar el cartucho de manera que el poloxámero puede alcanzar la temperatura ambiente y el gel.
5. Aplicar 3 bar de presión para el sistema y dispensar poloxámero hasta que llega a la punta de la aguja y se extruye en una hebra continua.

3. Optimización de los parámetros de impresión

Para crear estructuras 3D precisos, el proceso de impresión tiene que ser optimizado para el material elegido y de la concentración. Dependiendo de la viscosidad y el sistema de impresión 3D cada material se dió un volumen de dispensación específica y grosor de la línea para un conjunto fijo de parámetros.

1. Con un software CAD adecuado (capaz de crear archivos ISO de los dibujos), dibujar una sola línea acerca de la misma longitud que la estructura que se va a imprimir.
2. Coloque un microscopio portaobjetos 25 mm x 75 mm x 1mm o cualquier otro sustrato en la impresora y asegurar que girando en el vacío.
3. En el software de la impresora, coloque la válvula de solenoide de alta frecuencia de 50 Hz y establecer una alta presión de 3 bar.
4. Imprimir una capa de una sola línea con una velocidad de fase de 300 mm / min.
5. Reducir la presión hasta alcanzar el ancho de la línea deseada. También se puede controlar el volumen que se extruye a través del tiempo de apertura de la válvula.
6. Reducir la frecuencia de la válvula hasta que hay una línea continua se puede imprimir más. Elija una frecuencia por encima de este valor.

Nota: Una vez que se alcanzan el grosor de línea deseado y líneas continuas, determinar la velocidad de fase óptima y espesor de la capa es decir, la elevación de la aguja después de una capa impresa.

7. Imprima varias capas una encima de la otra y ver si la aguja está en la posición correcta sobre la capa anterior después de varias capas impresas. Ajustar el espesor de la capa (ascensor aguja) De modo que cada capa se imprime en la parte superior de la siguiente (Figura 3).
8. Reduzca la velocidad de fase de la etapa de 300 mm / min paso a paso de manera que las capas extruidas comienzan y terminan en las mismas posiciones que los anteriores (Figura 4). Velocidades demasiado altas escenario hacen que el escenario para estar en movimiento antes de que el material extruido ha tocado la capa anterior.
9. Para la impresión de las estructuras pilar siguen los pasos 3.1.-3.8., Pero en vez de dibujar una sola línea dibujan un solo punto. Los parámetros para centrarse en la hora de imprimir los pilares son la presión (regula espesor de la capa y el diámetro del pilar de poloxámero), el tiempo de apertura de la válvula (volumen extruido) y el tiempo de residencia de la cabeza de impresión en la posición donde el pilar debe ser depositado .
10. Cuando se optimizan los parámetros, la impresión de varias capas de una línea debe resultar en una pared sólida, o en el caso de los puntos, un pilar. Guardar los parámetros para su uso posterior.

4. Prensa y elución del molde inversa

Utilice los parámetros encontrados durante el proceso de optimización a partir de ahora.

1. Imprimir la estructura interna (en este caso se trata de una matriz pilar) sobre un portaobjetos de vidrio y deje que se seque durante la noche. Esto a) reduce el tamaño y el grosor de las estructuras y b) proporciona una mejor adhesión entre la estructura y el sustrato, por lo que el despegue durante el relleno puede ser evitado.
2. Con el software de CAD, dibuje una estructura que consiste en una pared exterior que rodea la estructura va a haber eluido lejos y lleno. Imprimir la estructura con poloxámero. La impresión de la pared tendrá 6 min.

Atención: La pared tiene que ser impresa al menos 3,5 mm de la estructura interna, debido a las dimensiones de la aguja. De lo contrario la impresión de la pared exterior va a destruir la estructura interna

3. Preparar la solución que desea rellenar el sacrmolde ificial con (aquí agarosa al 1% en agua desionizada). La solución de agarosa debe tener una temperatura entre 35 ° C y 45 ° C. Por debajo de esta temperatura, la agarosa se solidifica demasiado rápidamente; encima de esta temperatura, que podría destruir los pilares impresos debido a que la estructura de poloxámero se ablandará.
4. Llene lentamente el molde de sacrificio con la solución de relleno con una pipeta. Esto se debe hacer lentamente para evitar la destrucción de la estructura dentro de la pared.
5. Deje que el gel de solución rellenada o reticular que dependiendo del polímero utilizado. En el caso de la solidificación de agarosa se llevó a cabo a 4 º C durante 10 min.
6. Colocar el molde de sacrificio rellenada en un baño de hielo durante 10 min para eluir la estructura de poloxámero.
7. Seque la estructura rellenada con un pañuelo de papel y colocarlo en un nuevo portaobjetos de vidrio. Pulse la estructura cuidadosamente sobre el portaobjetos de microscopio de vidrio para evitar la fuga de la tercera hidrogel desde el vacío en el espacio entrela estructura rellenada y el portaobjetos de microscopio de vidrio.

5. El llenado de los huecos

1. Para llenar los huecos dejados por el poloxámero eluido, llenar la solución de polímero deseado en una jeringa equipada con una aguja de 30 G. En este ejemplo, se utilizó un metacrilato de alginato al 1% en solución 0,15 M de NaCl con la adición de 0,05% w / v de litio fenil-2, 4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) y 2,5% v / v de Alexa-488 fibrinógeno conjugado . El Alexa-488 conjugado fibrinógeno fue agregada para fines de visualización.
2. Fotopolimerizar el polímero con una lámpara de UV de alta intensidad (100 vatios, 365 nm, distancia del substrato fue de 3,5 cm) durante 5 min y la imagen de la construcción usando un microscopio de epi-fluorescencia o confocal.

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Resultados

Los resultados representativos muestran que la técnica inversa del molde (representado en la Figura 2) va a crear un gel estructurada que puede ser llenado con un segundo material. Al comienzo de cada proceso de impresión los parámetros de impresión están optimizados primero. Ajustes paso a paso de los parámetros darán como resultado construcciones multicapa impresos representadas en la Figura 3 y la Figura 4 cuando se imprimen líneas individuales. Si el espesor...

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Discusión

Aquí se presenta, por primera vez, el uso de un polímero termosensible para un molde de sacrificio que se pueden eluyó rápidamente en agua fría debido a la transición de gel-sol de poloxámero de ~ 20 ° C. La velocidad de todo el proceso de poloxámero hace interesante para la rápida creación de estructuras de biopolímeros que no se puede imprimir con una resolución adecuada. La técnica descrita aquí puede ser utilizado para modelar un hidrogel dentro de otro hidrogel o para la creación de canales de micro...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Poloxamer (Pluronic F127)	Sigma	P2443
PBS	Invitrogen	10010-015
CAD software	regenHU	BioCAD
Alginate methacrylate	Innovent e.V Technologieentwicklung Jena		Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate	Invitrogen	F13191
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	Innovent e.V Technologieentwicklung Jena		Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Agarose	Lonza	50004
EQUIPMENT
Bioprinter	regenHU	Biofactory
Valve	regenHU	300 μm Nozzel Diameter
Needle	regenHU	150 μm Inner Diameter
Zeiss Axioobserver with ApoTome	Zeiss
UV Light Source	UVP	Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp	100 W