Drucken Thermoresponsive Reverse-Formen für die Erstellung von Gemusterte Zweikomponenten-Hydrogele für 3D Zellkultur

Zusammenfassung

Ein bioprinter wurde verwendet, um strukturierte Hydrogele auf einem Opfer-Form zu erstellen. Das Poloxamer Form wurde mit einem zweiten Hydrogel verfüllt und dann eluiert, so dass Hohlräume, die mit einem dritten Hydrogel gefüllt wurden. Diese Methode verwendet schnelle Elution und gute Bedruckbarkeit von Poloxamers zu komplexen Architekturen aus Biopolymeren zu generieren.

Zusammenfassung

Bioprinting ist eine neue Technologie, die ihre Ursprünge in der Rapid-Prototyping-Branche hat. Die verschiedenen Druckverfahren in Kontakt Bioprinting ^1-4 (Extrusion, Dip-Pen und weiche Lithographie), kontaktlose Bioprinting ^5-7 (Vorwärtstransfer Laser-, Tintenstrahl-Abscheidung) und Laser-basierte Techniken wie Zwei-Photonen Photopolymerisation ⁸ aufgeteilt werden. Es kann für viele Anwendungen wie Tissue Engineering ^{9-13, 14-16} und Biosensor microfabrication als Instrument genutzt werden, um grundlegende biologische Fragen, wie Einflüsse von Co-Kultivierung verschiedener Zelltypen ¹⁷ beantworten. Anders als bei herkömmlichen Photolithographie oder Soft-lithographischen Methoden, hat Extrusion Bioprinting den Vorteil, dass es nicht erforderlich, eine separate Maske oder Stempel. CAD-Software verwenden, kann das Design der Struktur schnell verändert und entsprechend den Anforderungen des Betreibers eingestellt werden kann. Dies macht Bioprinting flexibler als Lithographie-basiertenAnsätze.

Hier zeigen wir, das Drucken eines Opfer-Form, um ein Multi-Material-3D-Struktur mit einer Reihe von Säulen in einem Hydrogel als Beispiel zu erstellen. Diese Säulen konnte hohlen Strukturen für eine vaskuläre Netzwerk oder die Rohre innerhalb eines Nervenleitschiene Leitung zu vertreten. Das Material für die Opferschicht Form gewählt wurde, Poloxamer 407, ein thermoresponsive Polymer mit hervorragenden Druckeigenschaften, die flüssig ist bei 4 ° C und eine feste oberhalb ihrer Geliertemperatur ~ 20 ° C 24,5% w / v Lösung ^18. Diese Eigenschaft ermöglicht die Poloxamer-basierte Opferschicht Form auf Verlangen eluiert und hat Vorteile gegenüber der langsamen Auflösung eines festen Materials besonders bei schmalen Geometrien. Poloxamer wurde am Mikroskop Glasträger gedruckt, um die Opfer-Form zu erstellen. Agarose wurde in die Form pipettiert und abgekühlt, bis die Gelierung. Nach der Elution der Poloxamer in eiskaltem Wasser wurden die Hohlräume in der Form mit Alginat Agarose Methacrylat sp gefülltiked mit FITC markiertes Fibrinogen. Die gefüllten Hohlräume wurden dann mit UV-vernetzt und das Konstrukt wurde mit einem Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskop abgebildet.

Einleitung

Tissue Engineering Ansätze haben große Fortschritte in den letzten Jahren in Bezug auf Regeneration von menschlichen Geweben und Organen ^19,20. Doch bis jetzt hat sich der Schwerpunkt des Tissue Engineering wurden oft zu den Geweben, die eine einfache Struktur oder kleinen Abmessungen wie die Blase ^21,22 oder der Haut haben ^23-25 ​​begrenzt. Der menschliche Körper enthält jedoch viele komplexe dreidimensionale Gewebe, wo Zellen und der extrazellulären Matrix in einem räumlich definierten Weise angeordnet sind. Um diese Gewebe herzustellen, ist eine Technik erforderlich, die Zellen und der extrazellulären Matrix Gerüst in einer dreidimensionalen Konstrukt an bestimmten Stellen zu platzieren. Bioprinting hat das Potential, ein solches Verfahren, bei dem die Vision Herstellung komplexer dreidimensionaler Gewebe ^10,11,26-28 realisiert werden kann.

Bioprinting wird als "der Verwendung von Material Transfer-Prozesse zur Strukturierung definiert und Montage biologisch relvanten Materialien - Moleküle, Zellen, Gewebe und biologisch abbaubaren Biomaterialien -. einem vorgeschriebenen Organisation an einen oder mehrere biologische Funktionen ^"4 erreichen Sie umfasst verschiedene Techniken, die Arbeit in verschiedenen Auflösungen und Längenskalen, von der Sub-Mikrometer-Auflösung von zwei -Photonen-Polymerisation ²⁹ mit einer Auflösung von 150 bis 420 um für die Extrusion Druck ^1,12,30. Nicht ein einziges Material oder Material-Kombination wird den Anforderungen der jeweiligen Methode ³¹ zu erfüllen. Für Extrusion Druck, sind die wichtigsten Parameter Viskosität und Gelierdauer ^32, wo eine hohe Viskosität und eine schnelle Gelierung wünschenswert.

3D-Druck ist eine Technik, die die einfache Erstellung von Opfer-Formen für die Erstellung von komplexen Geometrien erlaubt ^30,33,34. Dieses Verfahren beruht auf der Konstruktion einer Form unter Verwendung einer Rapid Prototyping Technik, wie eine Extrusion bioprinter basiert. Die erstellte Opfer Form verwendet wird, komplexe Strukturen aus Materialien, die schwer zu aufgrund ihrer niedrigen Viskosität und Gelierzeit langsam gedruckt sind bilden. Das hier vorgestellte Verfahren betrifft die Schaffung eines Opfer-Form, die aus einem Material, das schnell löst bei niedriger Temperatur und extrudiert werden kann, genau. Das Block-Copolymer Poly (ethylenglycol) _99-Poly (Propylenglykol) _67-Poly (ethylenglykol) ₉₉ (auch als Pluronic F127 oder Poloxamer 407 bekannt) erfüllt diese Anforderungen. Es wurde bereits in einer modifizierten Version der Extrusion Druck ¹ verwendet worden, aber nach unserem Wissen, hat noch nie für den Druck in ihrer unmodifizierten Fassung aufgrund seiner Instabilität in flüssigen Umgebungen eingesetzt. Poloxamer 407 zeigt ebenfalls eine inverse thermische Ansprechverhalten ¹⁸ also Änderungen von einem Gel zu einem Sol nach dem Abkühlen. Vor allem aber können sie in komplexe beliebig gekrümmte Strukturen mit sehr hoher Genauigkeit gedruckt werden. Dies ermöglicht die Schaffung eines strukturierten Hydrogel aus einemMaterialien mit niedriger Viskosität in diesem Fall langsam gelierende Agarose durch Pipettieren der Lösung in der gedruckten Form Opferschicht. Die Kombination aus dem Drucken des Opfer-Form mit hoher Wiedergabetreue und ihre praktischen Elution aus dem gegossenen strukturierten Hydrogels ermöglicht eine schnelle und flexible Verfahren zur Herstellung von Formen mit unterschiedlichen Geometrien ohne die Verwendung einer Maske oder eines Stempels, wie es oft in lithographischen Verfahren erforderlich erstellen. Die gegossenen strukturierten Hydrogel weiter mit einem anderen Material, das nicht für die Extrusion geeignet Druck aufgrund seiner niedrigen Viskosität gefüllt werden. Dies ist in unserem Fall eine niedrige Viskosität Alginat Methacrylat Lösung. Hier präsentieren wir die Methode des Reverse thermoresponsive Opfer Formen für Hydrogel Strukturierung am Beispiel einer Säule Array.

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Protokoll

1. Vorbereitung des Poloxamer 407 Lösung

Falls vorhanden, führen Sie die Vorbereitung des Poloxamers Lösung in einem kalten Raum (4 ° C). Wenn nicht vorhanden, legen Sie eine Glasflasche in einem Becherglas mit eiskaltem Wasser gefüllt. Bei höheren Temperaturen wird die Poloxamers oberhalb des Gels Punkt und wird nicht richtig auflösen.

1. 60 ml eiskaltem PBS Lösung in einer Glasflasche und rühren kräftig mit einem Magnetrührer.
2. Wiegen 24,5 Gramm Poloxamer und fügen Sie ihn in kleinen Mengen, um die kalte PBS. Warten Sie, bis das Poloxamer hat teilweise, bevor Sie mehr aufgelöst.
3. Rühren Sie die Lösung bis alle Poloxamers aufgelöst hat.
4. In kaltem PBS bis zu einer endgültigen Volumen von 100 ml erreicht ist. Die Endkonzentration 24,5% w / v. sein
5. Stoppen Sie die Lösung gerührt und ruhen lassen bei 4 ° C bis Blasen und Schaum in der Lösung sind verschwunden. Blasen, die in dem Gel eingeschlossen sind, werden die p übertragen werdenrinter Patrone und wird, um Defekte in der gedruckten Opfer Formen führen.
6. Filter (0,22 um-Filter) die Lösung direkt in die Druckkassette, um unerwünschte Partikel, die die Nadel verstopfen könnten, zu entfernen. Die Filterung Schritt sollte in einem kalten Raum durchgeführt werden (oder falls nicht vorhanden mit gekühlten Tipps, Filter usw.), um ein Gelieren des Poloxamers im Filter zu vermeiden. Halten Sie die geladenen Patrone bei 4 ° C bis 30 min vor dem Experiment.

2. Vorbereitung der 3D-Drucker

Der 3D-Drucker in dieser Arbeit verwendet wurde, war die "BioFactory" von regenHU. Die Extrusion Teil des Systems besteht aus mehreren Teilen. Eine Patrone unter Druck an der Oberseite ist mit einem Verbinder über eine Luer-Lock-Adapter angeschlossen ist. Der Verbinder überbrückt den Raum zwischen dem Auslass der Kartusche und dem Einlass eines Magnetventils. Am Ausgang des Magnetventils kann Nadeln mit unterschiedlichen Durchmessern verwendet werden. Das Material ist auf einer sub extrudiertenStrate das ist an einem beweglichen Bühne von Vakuum gehalten. Die wesentlichen Teile des Systems sind in Abbildung 1 dargestellt. Andere Extrusion basierte Systeme für den Druckvorgang verwendet werden, und die Optimierung muss für jedes System erfolgen.

1. Legen Sie das Magnetventil (Düsendurchmesser 0,3 mm) und die Nadel (Innendurchmesser 0,15 mm) in separaten 1,5 ml Röhrchen mit hochreinem Wasser gefüllt und legen Sie sie in einem beheizten Ultraschallbad für 30 min reinigen. Spülen Sie die Ventile gereinigt mit Ethanol und trocknen Sie sie mit einem Stickstoff-gun.
2. Installieren Sie das Ventil und die Nadel in den Drucker sowie ein leeres, sauberes Patrone.
3. Bewerben 3 bar Druck auf das System und ausblasen alle restlichen Flüssigkeiten aus dem Ventil installiert und Nadel mit Druckluft. Für kleine Nadeldurchmesser, ist es empfehlenswert, einen Filter (common Spritzenfilter, 0,45 um Porengröße) am Austritt der Druckluft eingebaut, um den Eintritt von kleinen Teilchen, die die Nadel verstopfen könnten zu vermeiden.
4. Drehen Sie den Druck aus und installieren Sie die Patrone mit dem Poloxamers geladen. Die Patrone sollte aus dem Kühlschrank genommen werden ca. 30 min vor der Montage die Patrone so das Poloxamer Raumtemperatur und Gel erreichen können.
5. Anwenden 3 bar Druck auf das System und verzichten Poloxamer, bis er die Nadelspitze erreicht und wird in einem kontinuierlichen Strang extrudiert.

3. Optimierung der Parameter Druck

Um eine genaue 3D-Strukturen zu schaffen, hat der Druckvorgang für das ausgewählte Material und Konzentration optimiert werden. Abhängig von der Viskosität und der 3D-Druck-System jedes Material ergibt eine spezifische Abgabe Volumen und Strichstärke für einen festen Satz von Parametern.

1. Mit einer geeigneten CAD-Software (in der Lage, ISO-Dateien aus den Zeichnungen zu erstellen), ziehen eine einzige Zeile über die gleiche Länge wie die Struktur, die Sie drucken möchten.
2. Legen Sie ein Mikroskop Objektträger aus Glas 25 mm x 75 mm x 1mm oder andere Substrat in den Drucker einsetzen und mit dem Einschalten des Vakuums.
3. In der Druckersoftware, setzen Sie das Magnetventil zu einer hohen Frequenz von 50 Hz und stellen einen hohen Druck von 3 bar.
4. Drucken einer Schicht aus einer einzigen Zeile mit einer Phase von 300 mm / min.
5. Reduzieren Sie den Druck, bis die gewünschte Linienbreite erreicht ist. Sie können auch die Lautstärke regeln, die extrudierten über die Öffnung des Ventils ist.
6. Reduzieren der Frequenz des Ventils, bis keine durchgehende Linie nicht mehr bedruckt werden. Wählen Sie eine Frequenz oberhalb dieses Wertes.

Hinweis: Wenn die gewünschte Linienbreite und durchgezogenen Linien erzielt werden, die optimale Phase Geschwindigkeit und Dicke, dh der Hub der Nadel nach einer bedruckten Schicht.

7. Drucken Sie mehrere Schichten auf der jeweils anderen und sehen, ob die Nadel in der richtigen Position über dem vorherigen Schicht nach mehreren gedruckten Schichten. Stellen Sie die Schichtdicke (Nadelhubsensor), So daß jede Schicht auf der Oberseite des nächsten (3) gedruckt wird.
8. Verringern der Drehzahl einer von der Stufe von 300 mm / min stufenweise so dass extrudierten Schichten beginnen und enden an den gleichen Positionen wie die vorherigen (Abbildung 4). Zu hohe Geschwindigkeiten Stadium verursachen die Bühne zu bewegen, bevor das extrudierte Material der vorherigen Schicht berührt hat.
9. Für den Druck der Säule Strukturen folgen Schritte 3.1.-3.8., Sondern zeichnen, nicht einen Linie zeichnen einen einzigen Punkt. Die Parameter, die den Schwerpunkt auf die beim Drucken die Säulen sind der Druck (regelt Schichtdicke und Säule Durchmesser Poloxamers), die Öffnungszeit des Ventils (extrudierte Volumen) und die Verweilzeit des Druckkopfes an der Stelle, wo die Säule aufgebracht werden sollten .
10. Wenn die Parameter optimiert werden sollte Druck mehrerer Schichten einer Linie in einer festen Wand, oder im Falle der Punkte, eine Säule führen. Speichern Sie die Parameter für die spätere Verwendung.

4. Druck und Elution des Reverse-Mold

Verwenden Sie die Parameter bei der Optimierung Prozedur ab diesem Zeitpunkt gefunden.

1. Drucken Sie die innere Struktur (hier ist eine Säule Array) auf einem Glas-Objektträger und lassen Sie es über Nacht trocknen. Diese a) reduziert die Größe und die Dicke der Strukturen und b) eine bessere Haftung zwischen der Struktur und dem Substrat, so dass ein Abheben beim Verfüllen vermieden werden.
2. Mit der CAD-Software, ziehen Sie eine Struktur, die aus einer äußeren Mauer, die die Struktur, die Sie wollen weg eluiert haben und füllte besteht. Drucken Sie die Struktur mit Poloxamers. Der Druck von der Wand dauert 6 min.

Achtung: Die Wand hat, die gedruckt mindestens 3,5 mm werden von der inneren Struktur aufgrund der Abmessungen der Nadel. Andernfalls wird der Druck von der äußeren Wand zur Zerstörung der inneren Struktur

3. Bereiten Sie die Lösung, die Sie wollen Ihre sacr verfüllenificial Form mit (hier 1% Agarose in entionisiertem Wasser). Die Agarose-Lösung sollte eine Temperatur zwischen 35 ° C und 45 ° C. Unterhalb dieser Temperatur wird die Agarose zu schnell verfestigen; oberhalb dieser Temperatur, könnte es die gedruckten Säulen zu zerstören, weil die Struktur Poloxamers erweichen.
4. Langsam füllen die Opfer-Form mit der Verfüllung Lösung mit einer Pipette. Dies sollte langsam erfolgen, um Zerstörung der Struktur in der Wand zu vermeiden.
5. Lassen Sie die Lösung verfüllten Gel oder vernetzen sie in Abhängigkeit von dem verwendeten Polymer. Im Falle von Agarose die Verfestigung erfolgte bei 4 ° C für 10 min.
6. Setzen Sie den verfüllten Opfer Form in einem Eisbad für 10 min, um die Struktur Poloxamers eluieren.
7. Tupfen Sie die verfüllten Struktur mit einem Papiertuch und legen Sie es auf eine neue Glasobjektträger. Drücken Sie die Struktur vorsichtig auf den Objektträger, um eine Leckage des dritten Hydrogel aus dem Hohlraum in den Raum zwischen vermeidendie verfüllten Struktur und das Glas Objektträger.

5. Füllung der Hohlräume

1. Um die Hohlräume von der eluierten Poloxamer zu füllen, Füllen der beabsichtigten Polymer-Lösung in eine Spritze mit einer 30 G Nadel ausgestattet. In diesem Beispiel wurde eine 1% ige Alginatlösung Methacrylat in 0,15 M NaCl-Lösung mit Zusatz von 0,05% w / v Lithium phenyl-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) und 2,5% v / v von Alexa-488 konjugiert Fibrinogen . Der Alexa-488-konjugierten Fibrinogen wurde zur Visualisierung hinzugefügt.
2. Photopolymerisation das Polymer mit einer hohen Intensität UV-Lampe (100 Watt, 365 nm, Entfernung vom Substrat war 3,5 cm) für 5 min und Bild das Konstrukt unter Verwendung eines Epi-Fluoreszenz oder konfokalen Mikroskop.

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Ergebnisse

Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass die Rückform Technik (dargestellt in Abbildung 2) wird eine strukturierte Gel, das mit einem zweiten Material gefüllt werden können. Zu Beginn eines jeden Druckvorgang die Druckparameter werden zunächst optimiert. Stufenweise Anpassung der Parameter werden in gedruckter vielschichtigen Konstrukte in Abbildung 3 und Abbildung 4, wenn einzelne Zeilen gedruckt dargestellt führen. Wenn die Schichtdicke (die Nadelhub nach ein...

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Diskussion

Hier stellen wir zum ersten Mal die Verwendung eines thermosensitiven Polymeren nach einem Opfer-Form, die sich schnell in kaltem Wasser kann durch die Gel-Sol-Übergang von Poloxamer von ~ 20 ° C eluiert Die Geschwindigkeit des gesamten Prozesses macht Poloxamers interessant für die schnelle Erstellung von Biopolymer Strukturen, die nicht mit ausreichender Auflösung gedruckt werden kann. Die hier beschriebene Technik kann zur Strukturierung eines Hydrogels in einem anderen Hydrogel oder für die Erstellung von mikro...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Poloxamer (Pluronic F127)	Sigma	P2443
PBS	Invitrogen	10010-015
CAD software	regenHU	BioCAD
Alginate methacrylate	Innovent e.V Technologieentwicklung Jena		Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate	Invitrogen	F13191
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	Innovent e.V Technologieentwicklung Jena		Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Agarose	Lonza	50004
EQUIPMENT
Bioprinter	regenHU	Biofactory
Valve	regenHU	300 μm Nozzel Diameter
Needle	regenHU	150 μm Inner Diameter
Zeiss Axioobserver with ApoTome	Zeiss
UV Light Source	UVP	Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp	100 W