Impressão de Moldes reversa Thermoresponsive para a Criação de Patterned hidrogéis de dois componentes para Cultura de Células em 3D

Resumo

Um bioprinter foi usada para criar hidrogéis modeladas com base num molde de sacrifício. O molde foi poloxâmero backfilled hidrogel com um segundo e, em seguida eluiu-se, deixando espaços vazios que foram preenchidos com uma terceira hidrogel. Este método utiliza eluição rápida e boa capacidade de impressão de poloxamero para gerar arquiteturas complexas de biopolímeros.

Resumo

Bioprinting é uma tecnologia emergente que tem suas origens na indústria de prototipagem rápida. Os diferentes processos de impressão pode ser dividido em contacto bioprinting ^1-4 (extrusão, mergulho caneta e de litografia suave), sem contacto bioprinting ^5-7 (transferência para a frente de laser, de jacto de tinta de deposição) e técnicas baseadas em laser de dois fotões, tais como fotopolimerização ^8. Ele pode ser usado para muitas aplicações de engenharia de tecidos, tais como ^{9-13, 14-16} e microfabricação biossensor, como uma ferramenta para responder a perguntas biológicos básicos, tais como as influências da co-cultura de diferentes tipos de células ^17. Ao contrário dos métodos de fotolitografia ou litografia suave comuns, bioprinting extrusão tem a vantagem de que ele não requer uma máscara ou um selo separado. Utilizando software de CAD, o desenho da estrutura pode ser rapidamente alterada e ajustada de acordo com os requisitos do operador. Isto faz bioprinting mais flexível do que com base em litografiaabordagens.

Aqui demonstramos que a impressão de um molde de sacrifício para criar uma estrutura em 3D de multi-material com uma matriz de pilares no interior de um hidrogel, como um exemplo. Esses pilares podem representar estruturas ocas de uma rede vascular ou os tubos dentro de um guia de canal do nervo. O material escolhido para o molde sacrificial foi poloxamer 407, um polímero thermoresponsive com excelentes propriedades de impressão, que é líquido a 4 ° C e um sólido acima da sua temperatura de gelificação ~ 20 ° C para soluções de 24,5% p / v de ^18. Esta propriedade permite que o molde de sacrifício à base de poloxâmero ser eluída sob demanda e tem vantagens sobre a dissolução lenta de um material sólido, principalmente para geometrias estreitas. Poloxero foi impressa em lâminas de vidro de microscópio para criar o molde sacrificial. A agarose foi pipetada para dentro do molde e arrefecida até a gelificação. Após eluição do poloxâmero em água gelada, os espaços vazios no molde de agarose foram preenchidos com alginato metacrilato spiked fibrinogénio marcado com FITC. Os vazios cheios foram então reticuladas com UV e a construção foi fotografada com um microscópio epi-fluorescência.

Introdução

Abordagens de engenharia de tecidos têm feito grandes progressos nos últimos anos no que diz respeito à regeneração de tecidos e órgãos humanos ^19,20. No entanto, até agora, o foco de engenharia de tecidos tem sido geralmente limitada a tecidos que têm uma estrutura simples ou de pequenas dimensões, como a bexiga ou a pele ^{21,22 23-25.} O corpo humano, no entanto, contém muitos tecidos tridimensionais complexas onde células e matriz extracelular são arranjados de um modo espacialmente definido. Para a fabricação desses tecidos, é necessária uma técnica que possa colocar andaimes células e matriz extracelular num construto tridimensional em posições especificadas. Bioprinting tem o potencial de ser uma técnica em que a visão de fabricação de tecidos tridimensionais complexos podem ser realizados ^10,11,26-28.

Bioprinting é definida como "o uso de processos de transferência de materiais para padronização e montagem biologicamente relmateriais levantes - moléculas, células, tecidos e biomateriais biodegradáveis ​​-., com uma organização prescrita para realizar uma ou mais funções biológicas ^"4 Ela engloba várias técnicas diferentes que funcionam em diferentes resoluções e escalas de comprimento, que vão desde a resolução sub-micron de dois -fotão de polimerização ²⁹ com uma resolução de 150 um a 420 mm para a impressão de extrusão ^1,12,30. Nem um único material ou combinação de materiais que satisfazem os requisitos de cada método ^31. Para a impressão de extrusão, os parâmetros principais são a viscosidade e o tempo de gelificação ^32, onde a elevada viscosidade e gelificação rápida são desejáveis.

Impressão 3D é uma técnica que permite a fácil criação de moldes sacrificiais para a criação de geometrias complexas ^30,33,34. Este processo baseia-se na construção de um molde usando uma técnica de prototipagem rápida, tal como um bioprinter extrusão. O molde sacrificial criado é usadode modo a formar estruturas complexas, a partir de materiais que são difíceis de imprimir devido à sua baixa viscosidade e o tempo de gelificação lenta. O método aqui apresentado envolve a criação de um molde sacrificial consistindo de um material que se dissolve rapidamente a uma temperatura baixa e pode ser extrudida com precisão. O copolímero em bloco de poli (etileno-glicol) _99-poli (propileno glicol) _67-poli (etileno-glicol) ₉₉ (também conhecido como o Pluronic F127 ou poloxâmero 407) cumpre estes requisitos. Já foi utilizada uma versão modificada na impressão de extrusão ^1, mas, para o nosso conhecimento, nunca foi usado para imprimir na sua versão inalterada, devido à sua instabilidade em ambientes líquidos. Poloxero 407 também apresenta um comportamento não responsivo térmica inversa ¹⁸ ou seja ela muda de um gel para um sol durante o arrefecimento. Mais importante, ele pode ser impresso nas estruturas curvadas arbitrariamente complexas com elevada fidelidade. Isso permite a criação de uma estrutura a partir de um hidrogelmaterial de baixa viscosidade, neste caso, de gelificação lenta de agarose, pipetando-se a solução para dentro do molde sacrificial impressa. A combinação de impressão do molde de sacrifício com alta fidelidade e sua eluição rápida do hidrogel estruturado fundido torna um método rápido e flexível para criar moldes com geometrias diferentes, sem o uso de uma máscara ou um selo, uma vez que é muitas vezes necessário em métodos de litografia. O hidrogel estruturado fundido pode ser ainda cheio com outro material que não é adequado para a impressão de extrusão, devido a sua baixa viscosidade. Isto é, no nosso caso uma solução de alginato de metacrilato de baixa viscosidade. Aqui apresenta-se o método de moldes sacrificiais invertidas thermoresponsive para padronização de hidrogel, utilizando o exemplo de uma matriz de coluna.

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Protocolo

1. Preparação da solução de Poloxamer 407

Se estiver disponível, realizar a preparação da solução poloxamero em uma câmara fria (4 ° C). Se não estiver disponível, o lugar de uma garrafa de vidro de um recipiente cheio de água gelada. A temperaturas mais elevadas, o poloxâmero estará acima do ponto de gel e não se dissolvem bem.

1. Adicionar 60 ml de solução de PBS frio de gelo numa garrafa de vidro e agita-se vigorosamente com um agitador magnético.
2. Pesar 24,5 g de poloxâmero e adiciona-o em pequenas quantidades ao PBS frio. Aguarde até que o poloxamero foi parcialmente dissolvido antes de adicionar mais.
3. Agita-se a solução até tudo estar dissolvido poloxâmero.
4. Adicionar PBS frio até um volume final de 100 ml é atingida. A concentração final será de 24,5% w / v
5. Parar a agitação da solução e deixar em repouso a 4 ° C até que as bolhas e espuma na solução desapareceram. As bolhas que estão presos dentro do gel vai ser transferido para o pcartucho rinter e vai levar a defeitos nos moldes sacrificiais impressos.
6. Filtro (filtro de 0,22 mM), a solução directamente para dentro do cartucho de impressão para remover quaisquer partículas indesejáveis, que poderiam obstruir a agulha. O passo de filtração deve ser realizada numa sala fria (ou se não estiver disponível, arrefecidos com pontas de filtro, etc), para evitar a gelificação do poloxâmero no filtro. Manter o cartucho carregado a 4 ° C, até 30 minutos antes da experiência.

2. Preparação da impressora 3D

A impressora 3D utilizado neste trabalho foi o "biofábrica" ​​de regenHU. A parte do sistema de extrusão é composto por várias peças. Um cartucho sob pressão na parte superior está ligada a um conector por meio de um adaptador luer. O conector preenche os espaços entre a saída do cartucho e a entrada de uma válvula de solenóide. À saída da válvula de solenóide, as agulhas de diferentes diâmetros podem ser usadas. O material é extrudido sobre um subdemonstrar que é realizada a um estágio em movimento por vácuo. As partes principais do sistema estão apresentados na Figura 1. Outros sistemas baseados em extrusão pode ser utilizada para o processo de impressão, e o processo de optimização precisa de ser feito para cada sistema.

1. Coloque a válvula de solenóide (diâmetro do bocal de 0,3 mm), e a agulha (diâmetro interno de 0,15 milímetros), em tubos de ensaio separados cheios com 1,5 ml de água ultrapura e colocá-los num banho de ultra-sons para limpar aquecida durante 30 min. Lavar as válvulas limpas com álcool e seque-os com uma arma de nitrogênio.
2. Instalar a válvula de agulha e na impressora, bem como um cartucho vazio e limpo.
3. Aplicar 3 bar de pressão para o sistema e apagar quaisquer líquidos residuais da válvula instalada e agulha com ar comprimido. Para pequenos diâmetros de agulhas, é recomendado para ter um filtro (filtro de seringa comum, de tamanho de poro de 0,45 um) instalado na saída do ar comprimido a fim de evitar a entrada de pequenas partículas que podem entupir a agulha.
4. Vire a pressão e instale o cartucho carregado com o poloxamero. O cartucho deve ser retirado do frigorífico, aproximadamente, 30 min antes da montagem do cartucho de modo que o poloxâmero pode atingir a temperatura ambiente e gel.
5. Aplicar 3 bar de pressão no sistema e dispensar poloxâmero até que ele atinja a ponta da agulha e é extrudido numa cadeia contínua.

3. Otimização dos parâmetros de impressão

Para criar estruturas 3D precisas, o processo de impressão tem que ser optimizado para o material escolhido e concentração. Dependendo da viscosidade e o sistema de impressão 3D cada material irá produzir um volume de dosagem específico e a espessura da linha de um conjunto fixo de parâmetros.

1. Com um software CAD adequado (capaz de criar arquivos ISO a partir dos desenhos), desenhe uma única linha sobre o mesmo comprimento que a estrutura que você pretende imprimir.
2. Coloque uma lâmina de vidro de microscópio 25 milímetros x 75 mm x 1mm ou qualquer outro substrato na impressora e prendê-lo ligando o vácuo.
3. No software da impressora, defina a válvula solenóide de alta freqüência de 50 Hz e defina uma alta pressão de 3 bar.
4. Imprimir uma camada de uma única linha, com uma velocidade de fase de 300 mm / min.
5. Reduzir a pressão até que a largura da linha desejada seja atingida. Também é possível controlar o volume que é extrudido através do tempo de abertura da válvula.
6. Reduzir a frequência da válvula, até que nenhuma linha contínua mais pode ser impressa. Escolha uma freqüência acima deste valor.

Observação: Uma vez que a largura da linha desejada e linhas contínuas são alcançados, determinar a velocidade de fase óptimo e isto é, a espessura da camada de elevação da agulha depois de uma camada impressa.

7. Imprimir várias camadas em cima uns dos outros e ver se a agulha está na posição correcta sobre a camada anterior, depois de várias camadas impressas. Ajustar a espessura da camada (elevador agulha) De modo que cada camada é impressa em cima do próximo (Figura 3).
8. Diminua a velocidade de fase da etapa, de 300 mm / min passo a passo para que as camadas extrudados começam e terminam nas mesmas posições que os anteriores (Figura 4). Velocidades demasiado elevadas do estágio causar a fase de mover-se antes de o material extrudido tiver tocado na camada anterior.
9. Para imprimir as estruturas de pilar, siga os passos 3.1.-3.8., Mas em vez de desenhar uma única linha desenhar um único ponto. Os parâmetros para se concentrar ao imprimir os pilares são a pressão (regula a espessura da camada e do diâmetro pilar de poloxâmero), o tempo de abertura da válvula (volume micronizada) e o tempo de residência na cabeça de impressão na posição onde o pilar deve ser depositado .
10. Quando os parâmetros são optimizadas, a impressão de várias camadas de uma linha deverá resultar numa parede sólida ou, no caso de os pontos, um pilar. Salvar os parâmetros para uso posterior.

4. Impressão e eluição do molde reverso

Use os parâmetros encontrados durante o processo de otimização a partir deste ponto.

1. Imprima a estrutura interna (aqui é uma matriz coluna) em uma lâmina de vidro e deixe secar durante a noite. Esta a) reduz o tamanho e espessura das estruturas e b), proporciona uma melhor adesão entre a estrutura e o substrato, de modo a descolagem durante o enchimento pode ser evitado.
2. Com o software CAD, desenhar uma estrutura que consiste em uma parede exterior em torno da estrutura que você pretende ter eluição de distância e preenchido. Imprimir a estrutura com poloxamero. A impressão da parede terá 6 min.

Atenção: A parede tem de ser impresso, pelo menos, 3,5 milímetros de distância a partir da estrutura interna por causa das dimensões da agulha. Caso contrário, a impressão da parede exterior vai destruir a estrutura interna

3. Prepare a solução que você deseja para aterrar seu sacrmolde ificial com (aqui de agarose 1% em água deionizada). A solução de agarose deve ter uma temperatura entre 35 ° C e 45 ° C. Abaixo dessa temperatura, irá a agarose solidificar muito rapidamente; acima desta temperatura, o que poderia destruir os pilares impressos porque a estrutura poloxâmero vai amolecer.
4. Lentamente encher o molde de sacrifício com a solução de enchimento, utilizando uma pipeta. Isto deve ser feito lentamente para evitar a destruição da estrutura dentro da parede.
5. Deixe a solução de gel utilizados no enchimento ou reticular que, dependendo do polímero usado. No caso de agarose a solidificação terá lugar a 4 ° C durante 10 min.
6. Coloque o molde sacrificial backfilled num banho de gelo durante 10 minutos para eluir a estrutura poloxâmero.
7. Blot a estrutura backfilled com um lenço de papel e colocá-lo em uma nova lâmina de vidro. Pressionar a estrutura cuidadosamente no lâmina de microscópio de vidro para evitar a fuga da terceira hidrogel do vácuo no espaço entrea estrutura e utilizados no enchimento da lâmina de vidro.

5. Enchimento dos vazios

1. Para preencher os espaços vazios deixados pela poloxâmero eluido, preencher a solução de polímero que se destina a uma seringa equipada com uma agulha 30 G. Neste exemplo, utilizou-se um alginato de metacrilato de 1% em solução de NaCl 0,15 M com a adição de 0,05% w / v de lítio fenil-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (PLA) e de 2,5% v / v de Alexa-488 fibrinogénio conjugado . A Alexa-488 fibrinogénio conjugado foi adicionada para efeitos de visualização.
2. Fotopolimerizá o polímero com uma lâmpada de UV de alta intensidade (100 watt, 365 nm, distância do substrato foi de 3,5 cm), durante 5 min e a construção da imagem usando um microscópio de epi-fluorescência ou confocal.

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Resultados

Os resultados representativos mostram que a técnica de molde reversa (ilustrado na Figura 2), vai criar um gel estruturado que pode ser preenchido com um segundo material. No início de cada processo de impressão os parâmetros de impressão são optimizados em primeiro lugar. Ajustamentos faseada dos parâmetros irão resultar em camadas múltiplas impressas construções representadas na Figura 3 e na Figura 4, quando as linhas individuais são impressos. Se a espes...

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Discussão

Apresentamos aqui, pela primeira vez, o uso de um polímero para um molde thermoresponsive sacrificial que podem ser rapidamente eluída em água fria, devido à transição gel-sol de poloxâmero de ~ 20 ° C. A velocidade de todo o processo torna poloxâmero interessante para a criação rápida de estruturas de biopolímeros, que não podem ser impressas com uma resolução adequada. A técnica aqui descrita pode ser usado para modelar um hidrogel dentro de um outro ou de hidrogel para a criação de canais microflui...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Poloxamer (Pluronic F127)	Sigma	P2443
PBS	Invitrogen	10010-015
CAD software	regenHU	BioCAD
Alginate methacrylate	Innovent e.V Technologieentwicklung Jena		Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate	Invitrogen	F13191
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	Innovent e.V Technologieentwicklung Jena		Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Agarose	Lonza	50004
EQUIPMENT
Bioprinter	regenHU	Biofactory
Valve	regenHU	300 μm Nozzel Diameter
Needle	regenHU	150 μm Inner Diameter
Zeiss Axioobserver with ApoTome	Zeiss
UV Light Source	UVP	Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp	100 W