Impression Moules Reverse thermosensible pour la création de motifs d'hydrogels à deux composants pour la culture cellulaire 3D

Résumé

A bioprinter été utilisé pour créer hydrogels motifs fondés sur un moule sacrificiel. Le moule poloxamère a été remblayé avec un second hydrogel et ensuite élue, laissant des vides qui ont été remplis avec un troisième hydrogel. Cette méthode utilise une élution rapide et une bonne imprimabilité de poloxamère pour générer des architectures complexes à partir de biopolymères.

Résumé

Bioprinting est une technologie émergente qui a ses origines dans l'industrie du prototypage rapide. Les différents procédés d'impression peuvent être divisés en contact bioprinting ^1-4 (extrusion, plongeon stylo et lithographie douce), ^5-7 (transfert avant laser, à jet d'encre dépôt) sans contact bioprinting et techniques à laser comme deux photopolymérisation photon ^8. Il peut être utilisé pour de nombreuses applications telles que l'ingénierie tissulaire ^{9-13, 14-16} et microfabrication biocapteur comme un outil pour répondre à des questions biologiques fondamentaux tels que les influences de co-culture de différents types de cellules ^17. Contrairement aux méthodes de photolithographie ou soft-lithographique communes, bioprinting d'extrusion a l'avantage qu'il ne nécessite pas un masque ou d'un cachet distinct. Grâce à un logiciel de CAO, la conception de la structure peut être rapidement modifiée et ajustée en fonction des besoins de l'opérateur. Cela rend bioprinting plus souple que la lithographie basée surapproches.

Ici, nous démontrons l'impression d'un moule sacrificiel de créer une structure multi-matériaux en 3D en utilisant un réseau de piliers dans un hydrogel à titre d'exemple. Ces piliers peuvent représenter des structures creuses pour un réseau vasculaire ou les tubes à l'intérieur d'un conduit de guidage de nerf. Le matériau choisi pour le moule sacrificiel est le poloxamère 407, un polymère thermosensible avec d'excellentes propriétés d'impression qui est liquide à 4 ° C et un solide ci-dessus de sa température de gélification ~ 20 ° C pendant 24,5% p / v de solutions ^18. Cette propriété permet à la moule sacrificiel poloxamère basée à élue à la demande et présente des avantages sur la lente dissolution d'un matériau solide en particulier pour les géométries étroites. Poloxamer a été imprimé sur des lames de verre de microscope pour créer le moule sacrificiel. Agarose a été pipette dans le moule et refroidi jusqu'à la gélification. Après élution de la poloxamère dans de l'eau glacée, les vides dans le moule d'agarose ont été remplis avec de l'alginate méthacrylate spIKED avec FITC fibrinogène marqué. Les vides remplis sont ensuite réticulées aux UV et la construction a été imagé avec un microscope à épifluorescence.

Introduction

approches d'ingénierie tissulaire ont fait beaucoup de progrès au cours des dernières années en ce qui concerne la régénération des tissus et d'organes humains ^19,20. Cependant, jusqu'à présent, l'objet de l'ingénierie tissulaire a été souvent limitée aux tissus qui ont une structure simple ou petites dimensions comme la vessie ou de la peau ^{21,22 23-25.} Le corps humain contient cependant de nombreux tissus complexes en trois dimensions où les cellules et la matrice extracellulaire sont disposées d'une manière définie dans l'espace. Pour la fabrication de ces tissus, une technique est nécessaire qui peut placer les cellules et les échafaudages de la matrice extracellulaire à l'intérieur d'une construction en trois dimensions à des positions spécifiées. Bioprinting a le potentiel pour être une telle technique où la vision de la fabrication des tissus complexes en trois dimensions peut être réalisée ^10,11,26-28.

Bioprinting est définie comme «l'utilisation de procédés de transfert de matériel pour la modélisation et l'assemblage biologiquement relmatériaux nentes - molécules, cellules, tissus et biomatériaux biodégradables -. avec une organisation prescrite pour accomplir une ou plusieurs fonctions biologiques ^»4 Elle englobe plusieurs techniques différentes qui fonctionnent à différentes résolutions et échelles de longueur, allant de la résolution submicronique de deux polymérisation photons ²⁹ à une résolution de 150 um à 420 um pour l'impression d'extrusion ^1,12,30. Pas un seul matériau ou combinaison de matériaux saura satisfaire les exigences de chaque méthode ^31. Pour l'impression d'extrusion, les paramètres clés sont la viscosité et le temps de gélification ^32, où la haute viscosité et la gélification rapide est souhaitable.

L'impression 3D est une technique qui permet la création facile de moules sacrificiels pour créer des géométries complexes ^30,33,34. Ce procédé est basé sur la construction d'un moule en utilisant une technique de prototypage rapide tel qu'un bioprinter d'extrusion. Le moule sacrificiel créée est utiliséepour former des structures complexes à partir de matériaux qui sont difficiles à imprimer du fait de leur faible viscosité et temps de gélification lente. La méthode présentée ici consiste en la création d'un moule sacrificiel consistant en un matériau qui se dissout rapidement à basse température et qui peut être extrudé avec précision. Le copolymère à blocs poly (éthylène glycol) _99-poly (propylène glycol) _67-poly (éthylène glycol) ₉₉ (également connu sous le nom de Pluronic F127 ou le poloxamère 407) répond à ces exigences. Il a déjà été utilisé dans une version modifiée de l'impression d'extrusion ^1, mais, à notre connaissance, n'a jamais été utilisé pour l'impression dans sa version non modifiée en raison de son instabilité dans les milieux liquides. Poloxamer 407 montre également un comportement réactif thermique inverse ¹⁸ c'est à dire qu'il passe d'un gel à un sol lors du refroidissement. Plus important encore, il peut être imprimé dans des structures courbes arbitrairement complexes avec une très grande fidélité. Cela permet la création d'un hydrogel structuré à partir d'unun matériau à faible viscosité, en l'occurrence gélifiant lente d'agarose, à la pipette de la solution dans le moule sacrificiel imprimé. La combinaison de l'impression du moule sacrificielle avec une grande fidélité et son élution rapide de l'hydrogel structuré coulé en fait un procédé rapide et flexible pour créer des moules avec des géométries différentes, sans l'utilisation d'un masque ou d'un timbre comme il est souvent nécessaire dans les procédés lithographiques. L'hydrogel structuré coulé peut encore être rempli avec un autre matériau qui n'est pas adapté à l'impression d'extrusion en raison de sa faible viscosité. Il s'agit dans notre cas une solution de méthacrylate bas d'alginate de viscosité. Ici, nous présentons la méthode de thermosensibles moules sacrificiels inverse pour motif d'hydrogel en utilisant l'exemple d'un tableau de pilier.

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Protocole

1. Préparation de la Solution 407 Poloxamer

Le cas échéant, réaliser la préparation de la solution de poloxamère dans une chambre froide (4 ° C). S'il n'est pas disponible, placez une bouteille en verre dans un bécher rempli d'eau glacée. A des températures plus élevées, le poloxamère sera au-dessus du point de gel et ne se dissoudra pas correctement.

1. Ajouter 60 ml de solution PBS froid dans une bouteille en verre et agiter vigoureusement à l'aide d'un agitateur magnétique.
2. Peser 24,5 g de poloxamère et l'ajouter en petites quantités à la PBS froid. Attendez que le poloxamère a partiellement dissous avant d'ajouter plus.
3. Agiter la solution jusqu'à ce que tous poloxamère a dissoute.
4. Ajouter PBS froid jusqu'à un volume final de 100 ml est atteinte. La concentration sera de 24,5% p / v
5. Arrêtez de remuer la solution et laisser reposer à 4 ° C jusqu'à ce que des bulles et de la mousse dans la solution ont disparu. Bubbles qui sont piégés dans le gel seront transférés à la pcartouche RINTER et conduire à des défauts dans les moules sacrificiels imprimés.
6. Filtre (filtre de 0,22 um) de la solution directement dans la cartouche d'impression pour éliminer les particules non désirées qui pourraient boucher l'aiguille. L'étape de filtrage doit être effectuée dans une chambre froide (ou s'il n'est pas disponible aux pointes refroidis, filtre etc) pour éviter la gélification du poloxamère dans le filtre. Conservez la cartouche chargée à 4 ° C jusqu'à 30 min avant l'expérience.

2. Préparation de l'imprimante 3D

L'imprimante 3D utilisée dans ce travail était la "bioproduction" de regenHU. La partie d'extrusion du système est constitué de plusieurs parties. Une cartouche sous pression dans la partie supérieure est fixée à un connecteur par l'intermédiaire d'un adaptateur Luer Lock. Le connecteur comble les espaces entre la sortie de la cartouche et l'entrée d'une électrovanne. A la sortie de l'électrovanne, d'aiguilles de diamètres différents peuvent être utilisés. Le matériau est extrudé sur un soustrer qui se tient à une étape déplaçant par le vide. Les principaux éléments du système sont illustrés dans la Figure 1. D'autres systèmes à base d'extrusion peuvent être utilisées pour le processus d'impression, et le processus d'optimisation qui doit être fait pour chaque système.

1. Placer l'électrovanne (buse de diamètre 0,3 mm) et l'aiguille (diamètre interne 0,15 mm) dans des éprouvettes ml séparées 1,5 remplis avec de l'eau ultra pure et de les placer dans un bain à ultrasons chauffé à nettoyer pendant 30 min. Rincer les soupapes nettoyées avec de l'éthanol et séchez-les avec un fusil d'azote.
2. Installer le clapet et l'aiguille dans l'imprimante ainsi que d'un vide, la cartouche propre.
3. Appliquer une pression de 3 bar pour le système et souffler les liquides résiduels de la vanne installée et l'aiguille avec de l'air comprimé. Pour les petits diamètres d'aiguilles, il est recommandé d'avoir un filtre (commune filtre seringue, 0,45 um taille des pores) installé à la sortie de l'air comprimé pour éviter l'entrée de petites particules qui pourraient obstruer l'aiguille.
4. Mettez la pression et installer la cartouche chargée avec le poloxamère. La cartouche doit être sorti du réfrigérateur environ 30 minutes avant le montage de la cartouche de sorte que le poloxamère peut atteindre la température ambiante et un gel.
5. Appliquer une pression de 3 bar dans le système de distribution et de poloxamère jusqu'à ce qu'elle atteigne l'extrémité de l'aiguille et est extrudée en un boudin continu.

3. Optimisation des paramètres d'impression

Pour créer des structures 3D précis, le processus d'impression doit être optimisé pour le matériel choisi et la concentration. En fonction de la viscosité et le système d'impression 3D, chaque matériau va donner un volume de distribution spécifique et l'épaisseur de ligne d'un ensemble fixe de paramètres.

1. Avec un logiciel de CAO approprié (capable de créer des fichiers ISO à partir des dessins), tracer une ligne unique sur la même longueur que la structure que vous souhaitez imprimer.
2. Placez un microscope lame de verre 25 mm x 75 mm x 1mm ou tout autre substrat dans l'imprimante et le fixer en activant le vide.
3. Dans le logiciel d'impression, régler la soupape à solénoïde à une fréquence élevée de 50 Hz et une haute pression de 3 bars.
4. Imprimer une couche d'une seule ligne avec une vitesse de phase de 300 mm / min.
5. Réduire la pression jusqu'à ce que la largeur de ligne souhaitée est atteinte. Vous pouvez également contrôler le volume qui est extrudé par le temps d'ouverture de la vanne.
6. Réduire la fréquence de la soupape jusqu'à ce qu'aucune ligne continue peut plus être imprimé. Choisissez une fréquence supérieure à cette valeur.

Remarque: Une fois que la largeur de ligne souhaitée et lignes continues sont obtenus, déterminer la vitesse de phase optimale et l'épaisseur de la couche à savoir la portance de l'aiguille après une couche imprimée.

7. Imprimez plusieurs couches les unes sur les autres et de voir si l'aiguille est dans la bonne position au-dessus de la couche précédente, après plusieurs couches imprimées. Réglez l'épaisseur de la couche (levée d'aiguille), De sorte que chaque couche est imprimée sur le dessus de la suivante (figure 3).
8. Diminuez la vitesse de phase de l'étape de 300 mm / min par étapes afin que les couches extrudées commencent et se terminent dans les mêmes positions que les précédentes (figure 4). Vitesses trop élevées sur scène provoquent la scène pour se déplacer avant que le matériau extrudé a touché la couche précédente.
9. Pour imprimer les structures de pilier suivez les étapes 3.1.-3.8., Mais au lieu de tirer une seule ligne attirent un seul point. Les paramètres de mise au point quand l'impression des colonnes sont la pression (régule l'épaisseur de couche et le diamètre du pilier de poloxamer), le temps d'ouverture de la soupape (volume extrudé) et le temps de séjour de la tête d'impression à la position où le pilier doit être déposé .
10. Lorsque les paramètres sont optimisés, l'impression de plusieurs couches d'une ligne doit se traduire par une paroi solide, ou dans le cas où des points, un pilier. Enregistrer les paramètres pour une utilisation ultérieure.

4. Impression et élution de la Moule renversé

Utilisez les paramètres trouvés au cours de la procédure d'optimisation partir de ce point.

1. Imprimer la structure interne (ici il s'agit d'un tableau de pilier) sur une lame de microscope en verre et laissez-le sécher pendant la nuit. Cela a) réduit la taille et l'épaisseur des structures et b) offre une meilleure adhérence entre la structure et le substrat, de sorte que le décollage pendant le remblayage peut être évitée.
2. Avec le logiciel de CAO, dessiner une structure qui se compose d'une paroi extérieure entourant la structure que vous comptez avoir élue loin et rempli. Imprimer la structure avec poloxamère. L'impression de la paroi aura 6 min.

Note: La paroi doit être imprimé au moins 3,5 mm de la structure interne en raison des dimensions de l'aiguille. Sinon, l'impression de la paroi extérieure va détruire la structure interne

3. Préparer la solution que vous souhaitez remblayer votre sacrmoule ificial avec (ici 1% d'agarose dans de l'eau déminéralisée). La solution d'agarose doit avoir une température comprise entre 35 ° C et 45 ° C. En dessous de cette température, l'agarose se solidifie trop rapidement; au-dessus de cette température, il pourrait détruire les piliers imprimés car la structure de poloxamère va adoucir.
4. Remplissez lentement le moule sacrificiel avec la solution de remblayage à l'aide d'une pipette. Cela devrait être fait lentement pour éviter la destruction de la structure à l'intérieur du mur.
5. Laisser le gel de solution remblayé ou réticuler il en fonction du polymère utilisé. Dans le cas d'agarose la solidification a eu lieu à 4 ° C pendant 10 min.
6. Placez le moule sacrificiel remblayé dans un bain de glace pendant 10 min pour éluer la structure de poloxamère.
7. Éponger la structure remblayé avec un mouchoir en papier et le placer sur une nouvelle lame de microscope en verre. Appuyez doucement sur la structure sur la lame de microscope en verre pour éviter les fuites de la troisième hydrogel du vide dans l'espace entrela structure remblayée et la lame de microscope en verre.

5. Le remplissage des vides

1. Pour remplir les vides laissés par le poloxamère éluée, remplir la solution de polymère prévue dans une seringue munie d'une aiguille de calibre 30. Dans cet exemple, nous avons utilisé un méthacrylate d'alginate de 1% dans une solution de NaCl 0,15 M avec l'ajout de 0,05% p / v lithium phényl-2, 4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) et de 2,5% v / v d'Alexa-488 conjugué fibrinogène . La Alexa-488 conjugué fibrinogène a été ajouté à des fins de visualisation.
2. Photopolymériser le polymère avec une lampe UV à haute intensité (100 Watt, 365 nm, la distance de substrat était de 3,5 cm) pendant 5 min et l'image de la construire en utilisant un microscope à épifluorescence ou confocal.

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Résultats

Les résultats représentatifs montrent que la technique de moulage de marche arrière (représentée sur la figure 2) va créer un gel structurée pouvant être remplie d'un second matériau. Au début de chaque processus d'impression, les paramètres d'impression sont d'abord optimisés. Ajustements progressive des paramètres se traduira par des constructions multicouches imprimés illustrés à la figure 3 et la figure 4 lorsque les lignes simples so...

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Discussion

Nous présentons ci, pour la première fois, l'utilisation d'un polymère thermosensible pour un moule sacrificiel qui peut être rapidement éluée à l'eau froide due à la transition gel-sol de poloxamère de ~ 20 ° C. La vitesse de l'ensemble du processus fait poloxamère intéressant pour la création rapide des structures de biopolymères qui ne peut être imprimé avec une résolution suffisante. La technique décrite ici peut être utilisé pour la modélisation d'un hydrogel dans une autre ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Poloxamer (Pluronic F127)	Sigma	P2443
PBS	Invitrogen	10010-015
CAD software	regenHU	BioCAD
Alginate methacrylate	Innovent e.V Technologieentwicklung Jena		Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate	Invitrogen	F13191
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	Innovent e.V Technologieentwicklung Jena		Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Agarose	Lonza	50004
EQUIPMENT
Bioprinter	regenHU	Biofactory
Valve	regenHU	300 μm Nozzel Diameter
Needle	regenHU	150 μm Inner Diameter
Zeiss Axioobserver with ApoTome	Zeiss
UV Light Source	UVP	Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp	100 W