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요약

bioprinter는 희생 형에 따라 패턴 하이드로 겔을 만드는 데 사용되었다. 폴록 사머 형은 두 번째 히드로 겔로 채워질 그리고 세 번째 하이드로 겔로 채워졌다 빈 공간을 남겨 용출되었다. 이 방법은 생체 고분자의 복잡한 구조를 생성하는 빠른 용출과 폴록 사머의 좋은 인쇄 적성을 사용합니다.

초록

Bioprinting은 신속한 프로토 타입 산업에서 그 기원을 가지고 새로운 기술입니다. 다른 인쇄 공정은 접촉 bioprinting 1-4 (압출, 딥 펜과 소프트 리소그래피), 비접촉식 bioprinting 5-7 (레이저 앞으로 전송, 잉크 제트 증착)와 같은 두 개의 광자 광중합 8로 레이저 기반 기술로 나눌 수 있습니다. 그것은 등 다른 세포 유형 17의 공동 배양의 영향으로 기본적인 생물 학적 질문에 대답하는 등 조직 공학 9-13, 바이오 센서 미세 14-16로와 도구로 많은 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다. 일반적인 포토 리소그래피 나 소프트 리소그래피 방법과는 달리, 압출 bioprinting은 별도의 마스크 나 스탬프를 필요로하지 않는 장점이 있습니다. CAD 소프트웨어를 사용하여 구조의 설계를 신속하게 운영자의 요구 사항에 따라 변경 및 조정될 수있다. 이 리소그래피 기반의보다 유연 bioprinting합니다방법.

여기에 우리가 예를 들어 하이드로 겔 내에서 기둥의 배열을 사용하여 다중 소재 3D 구조를 만들려면 희생 금형의 출력을 보여줍니다. 이 기둥은 신경 가이드 도관 내의 혈관 네트워크 또는 튜브에 대한 중공 구조를 나타낼 수 있습니다. 희생 형을 위해 선택된 재료는 폴록 사머 407, 4에 액체 우수한 인쇄 특성을 가진 thermoresponsive 폴리머이었다 ° C 및 겔화 온도 이상으로 고체 ~ 20 ° C 24.5 % W / V 솔루션 18. 이 속성은 폴록 사머 기반의 희생 금형 수요에 용출 될 수 있으며, 특히 좁은 형상에 대한 고체 물질의 느린 분해에 장점이 있습니다. 폴록 사머를 희생 금형을 만들 현미경 유리 슬라이드에 인쇄되었다. 아가는 금형에 피펫 및 겔화 될 때까지 냉각 하였다. 얼음 냉수에있는 폴록 사머의 용출 한 후, 아가로 오스 금형 보이드 알지네이트 메타 크릴 레이트 SP로 가득 차 있었다FITC 표시 피브리노겐과 iked. 채워진 빈 공간은 다음 UV와 교차 연결되었고, 구조는 에피 형광 현미경으로 몇 군데 있었다.

서문

조직 공학 접근 방법은 인간의 조직과 장기 19,20의 재생과 관련하여 지난 몇 년 동안 많은 진전을 만들었습니다. 그러나, 지금까지 조직 공학의 초점은 종종 단순한 구조 또는 방광 21,22 또는 피부를 23-25으로 작은 치수가 조직에 한정되어있다. 인간의 몸은, 그러나, 세포와 세포 외 기질이 공간적으로 정의 된 방식으로 배열되어 많은 복잡한 3 차원 조직을 포함하고 있습니다. 이러한 조직을 제조하는 기술은 특정 위치에서 3 차원 구조 내에서 세포와 세포 외 기질 발판을 배치 할 수 있어야합니다. Bioprinting는 제조 복잡한 3 차원 조직의 비전 10,11,26-28을 실현 할 수있는 그런 기술이 될 가능성이있다.

Bioprinting은 패터닝 소재 전송 프로세스의 사용 "으로 정의 생물학적으로 상대를 조립합니다evant 재료 - 분자, 세포, 조직, 생분해 성 생체 -. 하나 이상의 생물학적 기능 "4 달성하기 위해 소정의 조직과 그것은 여러 가지 기술을 포함 두 개의 서브 마이크론 해상도에 이르기까지 서로 다른 해상도 및 길이의 비늘에서 작동하는 압출 인쇄 1,12,30위한 420 μM ~ 150 ㎛의 해상도 광자 중합 29. 아니 하나의 재료 또는 재료의 조합이 각각의 방법 (31)의 요구 사항을 만족시킬 것이다. 압출 인쇄의 주요 매개 변수는 점도 겔화 시간이다 높은 점도와 빠른 겔화가 바람직하다 32.

3D 프린팅은 복잡한 형상에게 30,33,34를 만들기위한 희생 금형 쉽게 만들 수있는 기술입니다. 이 과정은 압출 bioprinter 등 신속한 프로토 타이핑 기술을 사용하여 금형의 구조를 기반으로합니다. 만든 희생 형이 사용됩니다그들의 낮은 점도와 느린 겔화 시간으로 인해 인쇄하기 어려운 물질로부터 복잡한 구조를 형성한다. 여기에 제시된 방법은 낮은 온도에서 빠르게 용해하고 정확하게 압출 될 수있는 물질로 이루어진 희생 곰팡이의 생성을 포함한다. 블록 공중 합체 폴리 (에틸렌 글리콜) 99 - 폴리 (프로필렌 글리콜) 67 - 폴리 (에틸렌 글리콜) 99 (또한 플루로 닉 F127 또는 폴록 사머 407라고도 함) 이러한 요구 사항을 충족. 그것은 이미 우리의 지식, 액체 환경에서의 불안정성으로 인해 수정되지 않은 버전의 인쇄에 사용 된 적이 있으며, 압출 인쇄 1 수정 버전에서 사용되었지만. 폴록 사머 407도 반전 열 반응 문제 18 즉, 냉각시 보솔 겔에서이 변화를 보여줍니다. 가장 중요한 것은, 그것은 매우 높은 충실도 복잡한 임의의 곡선 구조로 인쇄 할 수 있습니다. 이렇게하면에서 구조화 된 하이드로 겔의 생성저점도 물질이 경우 느린 겔 아가, 인쇄 희생 금형에 솔루션을 피펫 있습니다. 높은 충실도와 주조 구조화 된 하이드로 젤로부터 빠른 용출 그것은 마스크 또는 자주 리소그래피 방법에서 요구되는 스탬프를 사용하지 않고 다른 형상으로 금형을 만들 수있는 빠르고 유연한 방법을 만들어 함께 희생 형 인쇄의 조합. 주조 구조화 된 하이드로 젤은 더욱 낮은 점도로 인해 압출 인쇄에 적합하지 않은 다른 물질로 채워질 수있다. 이것은 우리의 경우 저점도 알긴산 메타 크릴 레이트 솔루션입니다. 여기에 우리가 기둥 배열의 예제를 사용하여 하이드로 겔 패턴에 대한 thermoresponsive 역 희생 금형의 방법을 제시한다.

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프로토콜

1. 폴록 사머 407 용액의 조제

가능한 경우, 냉장실 (4 ° C)의 폴록 사머 솔루션의 준비를 수행합니다. 사용할 수없는 경우, 얼음처럼 차가운 물이 가득 비커에 유리 병을 놓습니다. 높은 온도에서 폴록 사머가 젤 점 이상이어야하며 제대로 분해되지 않습니다.

  1. 유리 병에 얼음 차가운 PBS 용액 60 mL를 추가하고 자석 교반기를 사용하여 적극적으로 저어.
  2. 폴록 사머의 24.5 그램 무게와 차가운 PBS에 소량에 추가합니다. 폴록 사머 부분적으로 더 추가하기 전에 해산 될 때까지 기다립니다.
  3. 모든 폴록 사머이 녹을 때까지 저어.
  4. 100 ML의 최종 볼륨에 도달 할 때까지 차가운 PBS를 추가합니다. 최종 농도는 24.5 % W / V 될 것입니다
  5. 솔루션을 교반 중지하고 ° C가 용액에서 거품과 거품 때까지 사라 4에서 휴식을 할 수 있습니다. 젤 안에 갇혀 거품이 P로 전송됩니다rinter 카트리지 및 인쇄 희생 금형의 결함으로 이어질 것입니다.
  6. 필터 (0.22 μm의 필터) 바늘을 방해 할 수있는 불필요한 입자를 제거하기 위해 직접 인쇄 카트리지에 솔루션을 제공합니다. 필터링 단계 필터 폴록 사머의 겔화를 방지하기 위해 (또는하지 않을 경우 냉각 팁, 필터 등 사용 가능) 추운 방에서 수행해야합니다. ° C까지 30 분 실험을하기 전에 4시에로드 된 카트리지를 보관하십시오.

2. 3D 프린터의 준비

이 작품에 사용되는 3D 프린터는 regenHU에서 "BioFactory"입니다. 시스템의 돌출 부분은 여러 부분으로 구성되어 있습니다. 상단의 압력 카트리지는 루어 잠금 어댑터를 통해 커넥터에 연결합니다. 커넥터는 카트리지의 출구와 솔레노이드 밸브의 입구 사이의 공백을 메워. 솔레노이드 밸브의 출구에서 직경이 다른 바늘을 사용할 수 있습니다. 소재는 하위에 압출진공 청소기를 이용하여 이동하는 단계에 개최되는 strate. 시스템의 주요 부분은 그림 1에 묘사되어 있습니다. 기타 압출 기반 시스템은 인쇄 과정에 사용하고, 최적화 프로세스는 각 시스템에 대해 수행해야 할 수 있습니다.

  1. 초순수로 채워 별도의 1.5 ML 테스트 튜브 솔레노이드 밸브 (노즐 직경 0.3 mm)와 바늘 (내경 0.15 mm) 놓고 30 분 동안 청소하는 가열 초음파 욕조에 넣습니다. 에탄올로 세척 밸브를 세척하고 질소 총을 건조.
  2. 밸브와 니들 프린터뿐만 아니라 빈 카트리지 청소를 설치합니다.
  3. 시스템에 3 줄의 압력을 적용하고 압축 공기로 설치된 밸브와 니들에서 잔여 액체를 날려. 작은 바늘 직경, 그것은 바늘을 방해 할 수있는 작은 입자의 항목을 방지하기 위해 압축 공기의 출구에 설치된 필터 (공통 주사기 필터 0.45 μm의 기공 크기)를 가지고하는 것이 좋습니다.
  4. 폴록 사머와 함께로드 카트리지 압력을 해제하고 설치합니다. 폴록 사머 실내 온도와 겔에 도달 할 수 있도록 카트리지는 카트리지를 설치하기 전에 냉장고에서 약 30 분을 이동해야합니다.
  5. 시스템에 3 줄의 압력을 적용하고 바늘 끝을 도달하고 지속적인 물가에서 돌출 될 때까지 폴록 사머를 분배.

3. 인쇄 매개 변수의 최적화

정확한 3D 구조를 만들려면 인쇄 과정은 선택한 재료와 농도 최적화 할 수 있습니다. 점도와 3D 인쇄 시스템에 따라 각 재료 매개 변수의 고정 세트에 대한 특정 분배 볼륨과 선 두께를 얻을 것입니다.

  1. 적합한 CAD 소프트웨어 (그림에서 ISO 파일을 생성 할 수)와 함께, 당신은 인쇄하고자하는 구조로 같은 길이에 대한 하나의 라인을 그립니다.
  2. 현미경 유리 슬라이드 25mm X 75mm X 1 배치mm 또는 프린터에 다른 기판과 진공을 ON하여 고정합니다.
  3. 프린터 소프트웨어에서 50 Hz의 높은 주파수로 솔레노이드 밸브를 설정하고 3 줄의 높은 압력을 설정합니다.
  4. 300mm / 분의 단계 속도를 가진 단 하나 줄 하나의 레이어를 인쇄합니다.
  5. 원하는 라인 폭에 도달 할 때까지 압력을 줄일 수 있습니다. 또한 밸브의 개방 시간을 통해 돌출 볼륨을 제어 할 수 있습니다.
  6. 어떤 연속 선이 더 이상 인쇄 할 수 없습니다 때까지 밸브의 빈도를 줄일 수 있습니다. 이 값 이상의 주파수를 선택합니다.

참고 : 원하는 라인 폭과 지속적인 라인이 달성되면, 하나의 인쇄 층을 한 후 최적의 단계 속도와 바늘의 상승 즉, 층 두께를 결정합니다.

  1. 서로의 상단에 여러 레이어를 인쇄하고 바늘이 여러 인쇄 층 후 이전 레이어 위에 올바른 위치에 있는지 확인합니다. 층의 두께 (바늘 리프트를 조정) 이렇게 각 계층은 다음 중 하나 (그림 3)의 상단에 인쇄되어 있는지 확인합니다.
  2. 300mm / 압출 레이어가 이전의 것들 (그림 4)와 같은 위치에서 시작하고 종료하도록 분 단계적에서 무대의 무대의 속도를 감소시킵니다. 너무 높은 단계의 속도는 압출 재료가 이전 레이어를 터치하기 전에 단계는 이동 될 수.
  3. 인쇄 기둥 구조. 단계 3.1.-3.8를 수행하는 대신 하나의 선 그리기의 단일 지점을 그립니다. 기둥을 인쇄 할 때에 집중하는 매개 변수는 기둥이 입금되어야 위치에서 프린트 헤드의 압력 (층 두께와 폴록 사머의 기둥의 직경을 조절) 밸브의 개방 시간 (압출 볼륨) 및 체류 시간입니다 .
  4. 매개 변수가 최적화 될 때, 라인의 여러 레이어를 인쇄하는 단단한 벽 또는 포인트, 기둥의 경우가 발생합니다. 나중에 사용하기 위해 매개 변수를 저장합니다.

4. 반전 형의 인쇄 및 용출

이 시점에서의 최적화 과정 동안 발견 매개 변수를 사용합니다.

  1. 유리 현미경 슬라이드에 내부 구조 (여기에는 기둥 배열)를 인쇄하고 밤새 건조하자. 이)는 구조물의 크기와 두께를 줄이고 b)는 피할 수 리프트 오프 백필 동안, 그래서 구조와 기판 사이 더 나은 접착력을 제공합니다.
  2. CAD 소프트웨어로, 당신은 멀리 용출 채운하려는 구조를 둘러싼 외벽의 구성 구조를 그려라. 폴록 사머와 구조를 인쇄합니다. 벽의 인쇄 6 분 소요됩니다.

주의 : 벽 때문에 바늘의 크기의 내부 구조로부터 최소 3.5 mm 떨어져 인쇄 할 수 있습니다. 그렇지 않으면 외벽의 인쇄가 내부 구조를 파괴 할 것이다

  1. 당신의 SACR를 백필 할 솔루션을 준비합니다와 ificial 형 (탈 이온수 여기에 1 % 아가로 오스). 아가로 오스 솔루션은 35 ° C와 45 ° C. 사이의 온도를 가지고 있어야 이 온도 아래, 아가가 너무 빨리 응고 것이다 폴록 사머 구조가 부드럽게 때문에이 온도 이상, 그것은 인쇄 된 기둥을 파괴 할 수 있습니다.
  2. 천천히 피펫을 사용하여 되메우기 솔루션을 희생 형을 입력합니다. 이 벽 내부 구조의 파괴를 방지하기 위해 천천히 수행해야합니다.
  3. 채워질 솔루션 젤을하게하거나 사용 폴리머에 따라 가교. 아가의 경우 응고가 10 분 동안 4 ° C에서 열렸다.
  4. 폴록 사머 구조를 용출하는 10 분 동안 얼음 목욕 채워질 희생 형을 놓습니다.
  5. 종이 티슈로 채워질 구조를 몰아 내고 새로운 유리 현미경 슬라이드에 배치합니다. 사이의 공간에 빈에서 세 번째 하이드로 젤의 누설을 방지하기 위해 유리 현미경 슬라이드에주의 구조를 누르면채워질 구조와 유리 현미경 슬라이드.

5. 보이드의 작성

  1. 용출 폴록 사머에 의해 왼쪽 빈 공간을 채우기 위해, 30 G 바늘을 장착 한 주사기로 의도 된 고분자 용액을 채운다. 이 예제에서, 우리는 0.05 %의 추가로 0.15 M 염화나트륨 용액에 1 % 알긴산 메타 크릴 레이트를 사용하여 W / V 리튬 페닐 -2,4,6 - trimethylbenzoylphosphinate (LAP)와 2.5 %의 v / V를 사용 알렉사 - 488 복합 피브리노겐 . 알렉사 - 488 복합 피브리노겐은 시각화 목적을 위해 추가되었습니다.
  2. 5 분 및 이미지에 대한 고강도 UV 램프 (100 와트, 365 nm의 기판에서의 거리 3.5 cm이었다)와 폴리머를 Photopolymerize 에피 형광 또는 공 촛점 현미경을 사용하여 구성.

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결과

대표 결과는 반전 형 기술은 (그림 2) 제 2 물질로 채워질 수 구조화 된 젤을 만드는 것을 보여줍니다. 모든 인쇄 과정의 시작 부분에 인쇄 매개 변수가 먼저 최적화되어 있습니다. 매개 변수의 단계적 조정은 그림 3과 하나의 선이 인쇄 그림 4에 나와 인쇄 다층 구조가 발생합니다. 층의 두께는 (하나의 인쇄 층 후 바늘) 이용하실 너무 낮은 경우, 하나는 바늘이...

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토론

여기에 우리가 처음 제시 빠르게 때문에 ~ 20 ° C의 폴록 사머의 젤 - 졸 전환 차가운 물에 용출 될 수있는 희생 금형 thermoresponsive 폴리머의 사용 전체 프로세스의 속도가 적절한 해상도로 인쇄 할 수 없습니다 생체 고분자 구조의 빠른 생성을위한 폴록 사머 재미 있습니다. 여기에 설명 된 기술은 다른 하이드로 겔 내에서 또는 이전에 다른 물질 35에 대해보고 되었기 때문에 미세 유체 채널...

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공개

저자는 선언 아무 상관이 없다.

감사의 말

우리는 bioprinter에 도움 데보라 STUDER 감사합니다.

작품은 부여 계약을 N에 따라 유럽 연합의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013) ° NMP4-SL-2009-229292에 의해 투자되었다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
Poloxamer (Pluronic F127)SigmaP2443
PBSInvitrogen10010-015
CAD softwareregenHUBioCAD
Alginate methacrylateInnovent e.V Technologieentwicklung JenaSynthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 ConjugateInvitrogenF13191
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)Innovent e.V Technologieentwicklung JenaSynthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
AgaroseLonza50004
EQUIPMENT
BioprinterregenHUBiofactory
ValveregenHU300 μm Nozzel Diameter
NeedleregenHU150 μm Inner Diameter
Zeiss Axioobserver with ApoTomeZeiss
UV Light SourceUVPBlak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp100 W

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