Los ensayos de viabilidad de las células en cultivo

Resumen

Los compuestos terapéuticos a menudo se examinaron por primera vez in vitro con los ensayos de viabilidad. Recuentos de células ciegos por un observador humano puede ser muy sensible a pequeños cambios en el número de células, pero no evaluar la función. Ensayos de viabilidad computarizados, tal como se describe aquí, pueden evaluar tanto la estructura y función de una manera objetiva.

Resumen

Manual de células en un microscopio son un medio sensible de la evaluación de la viabilidad celular, pero consumen mucho tiempo y por lo tanto caro. Ensayos de viabilidad computarizados son costosos en términos de equipo, pero puede ser más rápido y más objetivo que el recuento de células manuales. El presente informe se describe el uso de tres de estos ensayos de viabilidad. Dos de estos ensayos son de infrarrojos y uno es luminiscente. Ambos ensayos infrarrojos se basan en un Imager 16 bits Odyssey. Un ensayo de infrarrojos utiliza la mancha de DRAQ5 para los núcleos combinados con la mancha de zafiro de citosol y se visualiza en el canal de 700 nm. El otro ensayo de infrarrojos, una en la celda Occidental, utiliza anticuerpos contra las proteínas del citoesqueleto (proteína asociada α-tubulina o microtúbulos 2) y los etiqueta en el canal 800 nm. El tercer ensayo de viabilidad es un ensayo luminiscente comúnmente utilizado para el ATP, pero usamos un cuarto del volumen recomendado para ahorrar en coste. Estas mediciones son lineales y se correlacionan con el número de CElls plateado, pero varían en sensibilidad. Todos los tres ensayos de eludir microscopía de tiempo y muestrean todo el pozo, reduciendo así el error de muestreo. Por último, todos los ensayos fácilmente se puede completar en un día del final del experimento, lo que permite un mayor número de experimentos a realizar en plazos cortos. Sin embargo, todos ellos se basan en el supuesto de que el número de células permanecen en proporción a la intensidad de la señal después de los tratamientos, la suposición de que a veces no se cumple, especialmente para ATP celular. Además, si las células aumentan o disminuyen de tamaño después del tratamiento, esto podría afectar la fuerza de la señal sin afectar el número de células. Llegamos a la conclusión de que todos los ensayos de viabilidad, incluidos los recuentos manuales, adolecen de una serie de advertencias, pero que los ensayos de viabilidad computarizados son bien vale la pena la inversión inicial. El uso de los tres ensayos en conjunto da una visión completa de la estructura y la función celular.

Introducción

El ensayo de viabilidad más común en las ciencias biológicas implica el recuento de células. Esto se evidencia por un análisis de los mejores (los más recientes) 200 publicaciones que aparecieron en PubMed con cualquiera de las palabras clave "in vitro" o "cultura" en 29/04/2013 y 30/04/2013. De estas publicaciones, el 23,5% utilizan ensayos de recuento de células, incluyendo recuento de número de células manuales, el número de células automatizado cuenta con software de imágenes, y Trypan exclusión de azul. El ensayo Live / Dead se utilizó en el 1% de estas publicaciones. El número de publicaciones utilizando el MTT (3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio) de ensayo para la viabilidad metabólica era 11%. Esta revisión de la literatura también muestra que el número de publicaciones que utilizan ensayos tales como MTT junto con ensayos de recuento de células fue sólo del 3,5%. A pesar de la tendencia a usar un ensayo de viabilidad por sí mismo, la evaluación de la función celular en combinación con el número de células parece ser la mejor elección para la evaluación de i celularntegridad. Los recuentos de células por sí mismas no son suficientes debido a que las células restantes pueden no ser funcional o sano a pesar de que están presentes en el pocillo ^1,2. A la inversa, las medidas funcionales tales como ATP pueden aumentar o disminuir en ausencia de cambios paralelos en el número de células. El desacoplamiento de las lecturas metabólicas del número de células sugiere que los ensayos de la ATP y MTT nunca debe ser usado como el único ensayo de viabilidad. En el presente informe, tres ensayos de viabilidad control que analicen tanto las estructuras celulares y la función metabólica se describen, por una visión más completa de la integridad celular que cualquier ensayo por sí solo puede permitirse.

Dos de nuestros ensayos requieren una cámara infrarroja que mide la fluorescencia en los 700 y 800 nm canales. El ruido es baja en las longitudes de onda infrarrojas, lo que lleva al aumento de la relación señal-ruido ^3. El generador de imágenes Odyssey que usamos tiene un rango dinámico 4,5 log y una profundidad de bits de 16, Translatinga 2 ¹⁶ o 65.536 tonos de infrarrojos. Esto se puede contrastar con imágenes en color de 8 bits, que sólo ofrece 2 ⁸ o 256 tonos de color para cada longitud de onda. Por lo tanto, de formación de imágenes de 16 bits tiene una resolución más fina. Cabe señalar que las imágenes infrarrojas originales son a menudo pseudocoloreada verde (800 nm) y roja (700 nm) en los informes publicados para la presentación. Cámaras Odyssey son de uso común tanto para Western Blot e In-Cell Westerns ^4-7. Dentro de la célula del Oeste en las células fijadas con formaldehído utilizan anticuerpos primarios contra cualquier proteína de interés y etiquetarlos a su vez con anticuerpos secundarios fluorescentes infrarrojos. Esta técnica es conocida por ser particularmente útil para los puntos finales de fosforilación ^6. En nuestra en la celda del Oeste, que tiñe las células fijadas para las proteínas del citoesqueleto α-tubulina o microtúbulos neuronales proteína asociada 2 (MAP2) en el canal de 800 nm. Estas proteínas son lo suficientemente abundantes para producir alta relación señal-ruido. También tiñe nuestros platos en el 700canal nm para núcleos con la mancha de DRAQ5 y para el citoplasma con la mancha de zafiro. Tanto las proteínas del citoesqueleto y las DRAQ5 + manchas Sapphire por lo tanto reflejan las estructuras celulares.

El tercer ensayo de viabilidad mide la función metabólica y se llama "célula Titulación Glo." En este ensayo basado en la luciferasa, los valores de luminiscencia están en proporción directa a los niveles de ATP. Ensayos de ATP se utilizan comúnmente para cuantificar las células viables ^8-12. Sin embargo, incluyendo la palabra "título" en el nombre del ensayo es algo de un nombre inapropiado porque la producción de ATP por célula puede cambiar como una función de los tratamientos de toxina y es, por tanto, no siempre en proporción al número de células ^8. Los niveles de ATP también pueden verse afectados por los ritmos circadianos ¹³ y por la división celular y la diferenciación celular ^{14 15.} Sin embargo, el ensayo de ATP se muestra aquí es simple de realizar y útil porque ATP es una medida robusta de metabólicaviabilidad ^16-21, si no del teléfono celular número en sí. Utilizando este ensayo para complementar el infrarrojo en la celda del Oeste, por lo tanto se obtiene un panorama más completo de la integridad celular de un ensayo de cualquier solo.

Protocolo

Un diagrama esquemático de los protocolos se ilustra en la Figura 1.

1. Celular Plating

Células de la placa en placas de 96 pocillos a diferentes densidades de chapado (Figura 2). Para comprobaciones de linealidad en la línea celular de neuroblastoma N2a, placa 2.5k, 5k, 10k, 15k y células por pocillo en 3 o 6 pocillos / grupo. Para comprobaciones de linealidad en las neuronas corticales primarias de rata, placa de 25k, 50k, 100k y 200k células por pocillo en 3 o 6 pocillos / grupo. Si las líneas celulares o células primarias de interés se ven saludables a diferentes densidades de placas, la placa en los alrededores de la densidad celular óptima para ese tipo de células.

Nota: En el presente estudio, las células N2a se sembraron en 100 l medios de comunicación y las neuronas corticales primarias en 200 l medio en placas que están diseñadas para baja evaporación. Para obtener información detallada sobre la manipulación de células, medios, sueros, antibióticos y tratamientos de toxina, consulte Unnithan et al. para N2a celLS ⁸ y Posimo et al. para las culturas de la corteza primaria ^22.

1. 1. Repita el forro en una segunda placa de 96 pocillos. Una de las placas se sometió a ensayo para el ATP (Figura 2A) y el otro con los ensayos de infrarrojos (Figura 2B). No se puede usar la misma placa para la ATP y los ensayos de infrarrojos, porque las células deben ser lisadas abierto para mediciones de ATP intracelulares.
   2. Asegúrese de placa, al menos, 3 pozos adicionales para la sustracción de fondo en los ensayos de infrarrojos en la densidad de placas óptima (columna 2, Figura 2B).
2. Añadir medio sin células o, más económicamente, agua estéril a los pocillos exteriores en las filas A y H, y en las columnas 1 y 12. Evite confiar en los datos de los pozos a lo largo de los bordes, ya que la viabilidad es a menudo más bajos que aquí los efectos de la evaporación de los medios y los gradientes de temperatura. Tales problemas con microplacas son comúnmente llamados efectos de borde ^23,24. No mantenga estos pozos vacíosporque entonces las filas B y G y las columnas 2 y 11 sufren el efecto de borde.
   Los efectos de borde pueden ser reducidos mediante la incubación de una placa recién sembrada a temperatura ambiente en condiciones ambientales antes de la transferencia en el incubador de _CO2 ^24. Además, un estudio reciente realizado por Carralot describe un método de corrección matemática para microplacas utilizando una columna de control único ^23. Oliver y sus colegas utilizaron una micropipeta aire placa incubadora forzada especialmente diseñado para reducir los gradientes térmicos ^25. Si el efecto de borde es de gran preocupación, cámaras de estabilidad de microplacas (por ejemplo, BT & C Incorporated) se pueden comprar para crear un microambiente homogéneo con alta humedad e incluso los gradientes de temperatura.
3. Si se necesitan más pozos que se muestra en la Figura 1 porque diluciones de reactivos adicionales o más densidades de placas se pondrá a prueba, utilice los pozos de última generación para la sustracción de fondo.
4. Espere toda la noche para la fijaciónde células y ensayo de la mañana siguiente, como se describe a continuación.

2. Ensayo luminiscente ATP

1. Siga las recomendaciones de la célula Titulación Glo del fabricante para la reconstitución del sustrato con tampón y para tiempos de incubación.
   1. Retire 50 o 150 l de medios de los 100 o 200 l de medio de siembra, respectivamente. Algo menos de 50 l permanecerán detrás en el pozo. Añadir 25 l de los reactivos (sustratos además de amortiguamiento) a las columnas 2-6 (Figura 2A) en una dilución de 1:02.
      Nota: Las diferentes volúmenes de los medios de comunicación dejaron atrás después de la eliminación podría diluir o concentrar los reactivos de ensayo ATP diferencialmente a través de pozos. Tenga cuidado de asegurarse de que el nivel de líquido en todas las puntas de pipeta multicanal es equivalente. Mida el líquido restante en algunos pozos a través de la placa con una pipeta inmediatamente antes de la adición de los reactivos de ensayo de ATP para asegurar la exactitud. Si existe una alta variabilidad de las tasas diferenciales de evapor mediosación través de la superficie de la placa, eliminar todos los viejos medios de comunicación y añadir el mismo volumen de medio fresco o solución salina tamponada de fosfato (PBS) a todos los pocillos inmediatamente antes de la adición de reactivos de ensayo de ATP. Si las placas sufren de niveles variables de evaporación, trate de cambiar a los bajos placas de evaporación de Costar Corning. En los últimos placas, los 60 pozos interiores mostrados en la Figura 2 sólo sufren de un promedio de 0,995% ± 0.41 medios de evaporación durante la noche. No es por lo tanto la variabilidad insignificante en volumen de los medios en el momento de ensayo.
   2. En las columnas 7 a 11, las filas B a D, eliminar suficientes medios para salir de 50 l atrás, como se detalla más arriba, y añadir 50 l de reactivos en una dilución de 1:01.
   3. En las columnas 7 a través de 11, filas E a G, dejar las células en 100 l de los medios de comunicación y añadir 100 l de reactivos, de nuevo en una dilución 1:01. La compañía recomienda que 100 l de los reactivos deben ser diluidos 1:01 en 100 l de medios de comunicación.
      Nota: Con el finpara ahorrar en costos, es posible cortar estas recomendaciones, tanto en volumen como en la dilución. Sin embargo, antes de hacer esto, asegúrese de que no reduce la linealidad y sensibilidad del ensayo.
   4. Una vez que un volumen específico y factor de dilución de los reactivos se encuentran para ser satisfactorio, seguir con ellos en todos los experimentos posteriores. Los criterios de datos satisfactorios se describen en la sección Resultados.
   5. Reactivos reconstituidos no utilizados se pueden volver a congelarse y utilizarse en el futuro para ahorrar en costes. Según el fabricante, los reactivos reconstituidos se pueden almacenar a -20 ° C durante 21 semanas, con la pérdida de ~ 3% de la actividad.
2. Coloque la placa en un agitador orbital durante 2 min o un agitador oscilante durante 10 min. Si una parte de la placa se está ensayando para una medición diferente y no puede ser sacudida, agitar los medios de comunicación con una simple pipeta hacia arriba y hacia abajo sólo en los pozos de interés. Sin embargo, las burbujas excesivos generados durante este paso va a interferir con lumisalida NESCent.
   1. 10 min después de la adición de los reactivos, transferir 60 l de los contenidos del pocillo en placas de 96 pocillos blancas. Valores de luminiscencia son más altos en las placas blancas que en las placas transparentes o negros porque reflejan la luz hacia arriba, hacia el detector.
      Nota: En nuestra experiencia, las células sobreviven mejor en la baja evaporación, placas Costar claras que otras placas. Estas placas específicas que no se venden con paredes blancas. En segundo lugar, las placas-opacos de paredes y fondo transparente son más caros que las placas completamente claras. Si se transfiere el líquido luminiscente para placas blancas, las placas de color blanco se pueden lavar y volver a utilizar, el ahorro en el costo de la utilización de las nuevas placas blancas para cada experimento. Transferencia de líquido es, pues, la opción más barata en el largo plazo.
   2. Pop las burbujas de aire antes de leer la placa con una aguja o, preferentemente, con aire forzado de un bulbo de pipeta de transferencia de plástico. Leer la placa en un luminómetro con un tiempo de integración de 1 segundo (el recomme empresands 0,25-1 seg tiempo de integración suficiente). Leer la placa 10-12 min después de la adición de reactivos de ensayo de ATP. El momento es crítico para la comparación a través de diferentes placas, debido a que la señal luminiscente es transitoria con una tasa de decaimiento rápido, como se muestra por Gilbert y sus colegas ^26.
3. La media de los valores luminiscentes de los 3 o 6 pocillos en cada grupo y la trama como una función del número de células en un diagrama de dispersión (véase la Figura 3). En primer lugar restar fondo promedio valores de luminiscencia de los pozos vacíos apropiados (pozos 2B - 2G, pozos 11B - 11D, 11E y pozos - 11G) de cada punto de datos correspondiente. Habrá tres grupos diferentes para cada densidad de placas en este experimento (Figura 2A) inicial. Los niveles de ATP pueden ser correlacionados linealmente con densidades de células en uno o todos de estos grupos. Proceda con la mayor dilución de los reactivos que todavía da resultados satisfactorios para ahorrar en costes. Criterios para resultados satisfactorios se describen in la sección Resultados.
   Nota: Con los medios utilizados en el presente estudio, los valores de fondo con este ensayo no son altos y es posible saltarse los pocillos de blanco. Sin embargo, el fabricante Promega reporta diferencias en luminiscencia con diferentes medios de cultivo. El presente estudio utiliza Hyclone Fetal Clone III, una versión sintética de suero fetal bovino para las células N2a y suero de ternera bovina para cultivos corticales primarias. Según el fabricante, de suero de ternera disminuye los valores de luminiscencia, pero no disminuye la sensibilidad del ensayo. Sin embargo, si esto es de preocupación significativa, diluir ATP reactivos de ensayo en PBS en lugar de los medios de comunicación en el momento de ensayo.
   1. Si las células parecen crecer de manera desigual entre las columnas durante la noche, trate de someter a ensayo dentro de las 6 horas de la siembra. Sin embargo, tenga en cuenta que la densidad en el horario habitual de ensayo (por ejemplo, 24 horas después del tratamiento) es la densidad con la que se debe lograr la linealidad.

3. Infrared Ensayos

1. La mañana después de la siembra, fijar las células en la segunda placa a temperatura ambiente en una campana de humos. Asegúrese de usar guantes para este paso y desechar el fijador como residuos químicos porque el formaldehído es un carcinógeno. Añadir 4% de formaldehído y 4% de sacarosa en tampón de fosfato 0,1 M a los medios de comunicación existentes en una dilución 1:01. Los medios de comunicación también se puede lavar con PBS antes de fijar en fijador de fuerza completa. De cualquier técnica funciona bien.
   1. Incubar en fijador durante 20 minutos y luego retirar el fijador y lavar 3 veces en 200 l de PBS.
2. Guarde la placa en PBS con 0,2% de azida de sodio a 4 ° C si el análisis no se llevará a cabo en el mismo día. De lo contrario, continúe con el ensayo y colocar las células en solución de bloqueo para minimizar la unión no específica de los anticuerpos.
   1. Diluir el suero de peces Odyssey bloque de 1:01 en PBS y añadir 0,3% de Triton X-100 como un permeabilizador de células. Haga solución de bloqueo suficiente, así como Antibo primaria y secundariasoluciones dy de manera que 35 l pueden ser pipetearon en cada pocillo. Sin embargo, si se observa una gran cantidad de burbujas durante el pipeteado, hacer> 50 l de cada bien, de lo contrario las burbujas alcanzan hacia abajo en las células y los anticuerpos de bloque de unión. Burbujas de jabón excesivas aparecerá como una mancha circular sin teñir en el centro del pozo. Trate de ajustar la pipeta si esto ocurre.
   2. Incubar en esta solución de bloqueo durante 30-60 minutos a temperatura ambiente.
      Nota: 5% de albúmina de suero bovino o sueros normales de la misma especie como el anticuerpo secundario también se pueden utilizar como el bloqueo de soluciones para ahorrar en coste de el bloque de suero de peces. El bloqueo de las soluciones puede afectar al rendimiento del anticuerpo. Por lo tanto, el bloque óptimo para cada anticuerpo se determina mejor empíricamente.
      Nota: Algunos investigadores colocan dentro de la celda platos occidentales en la coctelera durante las incubaciones. Sin embargo, esto no es necesario.
3. Realice los anticuerpos primarios: 1:10000 dilución de anti-α-tubulina(Monoclonal de ratón, Tabla 1) y 1:2000 dilución de anti-MAP2 (monoclonal de ratón, Tabla 1). Estos anticuerpos son específicos para las proteínas de interés en estos modelos celulares; especificidad es esencial para cualquier mancha inmunocitoquímica.
   Nota: MAP2 es un marcador para las neuronas y es apropiado para cultivos neuronales / gliales mixtos. Las culturas postnatales muestran aquí también contienen algo de la glía (~ 25%), ya que los astrocitos aparecen por primera vez en el día embrionario 18, con sus números de alcanzar un máximo en el período neonatal precoz ^27,28. Uno no puede distinguir entre astrocitos y neuronas en el ATP y ensayos DRAQ5 + Sapphire. Con el fin de medir las neuronas y astrocitos por separado, utilizar MAP2 simultánea y la tinción de GFAP en los 800 y 700 nm canales, como se describe por Mullett y colegas ^4,29, dejando fuera de DRAQ5 + zafiro. Sin embargo, si todas las células en el cultivo desean ser evaluado, utilizar un marcador pan-celular tal como α-tubulina, β-actina, o GAPDH.
   Nota: Estas diluciones se han optimizado para el N2a y células corticales primarias y no pueden generalizar a todos los modelos. Por lo tanto, trate al menos dos diluciones de anticuerpos primarios, uno en la mitad izquierda de la placa y el otro en la mitad derecha (ver Figura 2B). Como alternativa, pruebe 3-4 diluciones de anticuerpos primarios en 3 pocillos cada una. Por ejemplo, la dilución recomendada en la hoja de inserción anticuerpo puede ir acompañada de cambios de dos veces. En otras palabras, si la dilución recomendada para inmunocitoquímica es 1:500, 1:250 y también tratar los factores de dilución 1:1.000.
   1. Diluir anticuerpos en 1:01 bloque Odisea: PBS y añadir 0,3% Triton-X. Para ahorrar en coste, trate de hacer los anticuerpos en la solución de bloqueo que se aplicó a las células en la etapa 3.2.1 mediante la eliminación de esta solución al final de la incubación. Mantener las células en PBS mientras se hace esto, sino que no deben secarse.
   2. Incubar en anticuerpos primarios o bien 1-2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. Para débilmente bncontrar anticuerpos y proteínas que no son abundantes, las incubaciones durante la noche puede ayudar a aumentar la señal.
      Nota: Deje por lo menos 3 pozos en solución de bloqueo durante la sustracción de fondo a cada concentración de anticuerpo secundario (pozos 2B-2D y 2E-2G pozos en la Figura 2B). No exponga estos pozos a cualquier anticuerpo primario que sea. Revelan la medida de la unión no específica por el anticuerpo secundario y son útiles para los cálculos de relaciones de señal a ruido. Si hay una preocupación de que los anticuerpos secundarios dará lugar a altos niveles de unión no específica, también incluir pocillos de control que no están expuestas al anticuerpo, ya sea primaria o secundaria, pero reciben el mismo número de lavados. La diferencia entre estos pozos y los pozos "secundaria" sólo revelará el grado de unión no específica causada por el anticuerpo secundario solo. En nuestra prueba en las células N2a de ratón, intensidad de la señal con anti-ratón anticuerpo secundario solo fue 0,557 ± 0,032, señal con anti-conejoanticuerpo secundario solo fue 0,533 ± 0,041, la señal sin anticuerpo secundario fue 0,357 ± 0,003, y la señal con anticuerpos primarios y secundarios fue de 11.867 ± 0.911. Nosotros por lo tanto no hemos observado altos niveles de unión no específica incluso cuando se utilizan anti-ratón secundaria de anticuerpos en células de ratón. Hay varios fabricantes de para anticuerpos secundarios infrarrojos; se recomienda comprar sólo los muy cruzada adsorbidos. Tenga en cuenta que la concentración de anticuerpos IgG secundarios puede variar dependiendo de la fuente.
4. Lavar anticuerpos primarios con 3 lavados de 200 l de PBS por pocillo, 10 min cada uno. Los anticuerpos primarios se pueden guardar a 4 ° C durante unas pocas semanas en el 0,2% de azida de sodio y se reutilizan hasta pequeñas motas de escombros se hacen evidentes cuando las soluciones se mantienen hasta la luz. Esto sólo se hace para ahorrar en el precio. Si el costo no es un problema, crear anticuerpos frescos para cada uso.
5. Diluir el anticuerpo secundario por 1:1.000 o 1:2.000 en 1:01 bloque Odisea: PBS con 0,3% Triton-X (Figura 2B). Añadir la dilución 1:1.000 a la mitad superior de la placa y 1:2.000 a la media parte inferior de la placa. Estas concentraciones podrían reducirse aún más para ahorrar en costes, sino comprobar la linealidad antes de comprometerse con esto.
   Nota: Asegúrese de añadir la solución de anticuerpo secundario apropiado para el fondo de pozos de sustracción (columna 2 en la Figura 2B).
   1. Si una segunda proteína se sometió a ensayo en lugar de DRAQ5 + zafiro, células de la etiqueta para α-tubulina o MAP2 con 700 nm de cabra anti-IgG de ratón y la segunda proteína en el canal de 800 nm con anticuerpos primarios de una especie distinta de ratón. El canal 800 nm tiene menos fondo que el canal de 700 nm y se debe reservar para la proteína más crítica de interés.
   2. Incubar en secundaria de anticuerpos durante 1 hora a temperatura ambiente en un cajón de la luz.
6. Lavar la zona secundaria de anticuerpos con 3 lavados de 200 l de PBS por pocillo, 10 min cada uno.
7. Haga las soluciones DRAQ5 + Sapphire. Para la mitad izquierda de la placa, diluir DRAQ5 1:10.000 (0,5 M de concentración final) y zafiro 1:1000 en PBS con 0,3% de Triton-X (columnas 3 - 6; Figura 2B). Para la mitad derecha de la placa, diluir DRAQ5 1:20.000 (0,25 M) y Sapphire 1:2000 (columnas 7-10, Figura 2B).
   Nota: DRAQ5 utilizado para ser vendidos en una madre 1 mM en lugar de una madre 5 mM. Por ello, algunos informes publicados previamente utilizados 1:4.000 o 1:2.000 diluciones de DRAQ5 ^8.
   1. Para ahorrar en costes, si dos placas están siendo analizadas simultáneamente, el mismo soluciones Sapphire DRAQ5 + se puede utilizar en dos placas en secuencia, pipetear si fuera la primera placa y de añadir a la segunda. Si se utilizan las mismas soluciones de dos veces de esta manera, utilizar ellos hasta dentro de un día. Soluciones DRAQ5 diluido + Sapphire no se pueden guardar a 4 º C o se congelan para su uso posterior.
   2. Incubar en estas soluciones durante 30 min a temperatura ambiente lejos fluz rom. Si el tiempo es corto y los DRAQ5 + soluciones Sapphire no se volverá a utilizar en otras placas con diferentes secundarias, añadir estas manchas a las soluciones de anticuerpos secundarios en el paso 3.5 e incubar durante 1 hora.
      Nota: No agregue DRAQ5 + solución Sapphire para el fondo de pozos de sustracción (columna 2 en la Figura 2B), ya que estos pozos no deben teñirse en el canal 700 nm.
8. Lavar las placas 3 veces con 200 l de PBS por pocillo durante 10 min cada uno. Poner 0,2% de azida de sodio en el lavado final de PBS si la placa va a ser teñido con otros anticuerpos secundarios visibles alcance después de la formación de imágenes de infrarrojos es completa.
9. Busque en la placa en un Imager Odyssey. Comience explorando las placas a una intensidad 5 y la resolución 169 mm. Cualquiera de "calidad media" o ajustes de "baja calidad" son suficientes. La compañía no divulga información detallada filtro de excitación / emisión. Sin embargo, los filtros de emisión son de aproximadamente 20 nm de ancho y se centran alrededor de 720 y 820 nm, de acuerdo con el fabricante.
   Nota: Es posible escanear placas mientras aún esté húmedo ya que los investigadores pueden desear seguir manchar con otros marcadores. Sin embargo, la compañía sugiere en su protocolo en línea que las placas secas como resultado una menor propagación de la señal del pozo a pozo. Si escanea ambos húmedo y luego secar al comparar los datos, asegúrese de retirar todo el PBS del pozo porque sales restantes después de la evaporación pueden conducir a alta fluorescencia de fondo a lo largo de los bordes.
   1. La Odisea de imágenes escanea hasta y a través de la parte inferior de la placa. Las placas de diferentes fabricantes pueden exigir diferentes compensaciones de enfoque debido a que el fondo de los pozos puede variar en su grosor y la profundidad en la placa. Intente escanear a diferentes desplazamientos de enfoque y ver donde la relación más alta de señal a ruido y nitidez posibles (la mayoría en el foco) se consigue la señal: 2,5 mm, 3,0 mm, 3,5 mm, 4,0 mm. Pruebe también para medir la profundidad del pozo desde el fondo de una placa con una regla para confirmar la Findings en la Odisea. Recuerde que el plástico en el fondo del pozo puede añadir altura adicional para las mediciones con regla. Las placas Costar utilizados en el presente estudio exigen un desplazamiento de 4,0 mm de enfoque.
   2. Utilice la función de Western en la celda en el software para colocar la rejilla del tamaño adecuado a la imagen de la placa y exportar los datos a Microsoft Excel. Examine los valores de intensidad "integrados" de los mismos pozos en los diferentes desplazamientos de enfoque para encontrar los valores más altos de fluorescencia. El desplazamiento de foco que produce la mejor relación señal-ruido (señal en los pozos inmunoteñidas frente a "no hay primarias de control negativo" pozos) es la mejor elección en adelante.
   3. Una vez compensado uno de los focos que se decida, escanear de nuevo en incrementos más pequeños. Por ejemplo, si la señal más brillante fue en el 3,5 y 4,0 mm, intente escanear a 3.6, 3.7, 3.8 y 3.9 mm y ver si hay alguna mejora adicional en la intensidad de la señal. Si el desplazamiento de enfoque es erróneo, intensidad de la señal a través de las 12 columnas en una pl vacíocomió (cuando todas las columnas deben tener igual señal) aparecerá como una curva en lugar de una línea plana en forma de U. Si esto sigue siendo un problema con las placas de plástico, trate placas con fondo de cristal.
10. Reste el promedio de las intensidades integradas en el fondo resta pozos (Figura 2B; pozos 2B - 2D o pozos 2E - 2G) de cada punto de datos correspondiente en los 700 y 800 nm canales. Entonces promediar las intensidades de señal integrados para cada grupo de pozos. Grafica los datos en forma de diagrama de dispersión frente a la densidad celular (ver Figura 3).
    1. Comparar los resultados de las dos diluciones diferentes de anticuerpos primarios y secundarios y los resultados de las dos diluciones diferentes de DRAQ5 + Sapphire para resolver en una dilución de cada uno para los experimentos posteriores. Si no se logra la linealidad, intente escanear con una intensidad diferente. Vuelva a explorar con intensidades 3 y 7 en lugar de 5 y volver a analizar los datos. Si los datos de mejorar en una de esas intensidades perotodavía no es satisfactoria, vuelva a explorar en incrementos de alrededor de esa intensidad.
    2. Tenga cuidado de no analizar imágenes en las que el software muestra manchas blancas en los pozos; esos puntos significan señal saturada fuera del rango de la cámara termográfica. Escanear a una intensidad menor si esto ocurre.
    3. Si no se logra la linealidad, trate también de fijar las células dentro de las 6 horas de la siembra, ya que podría crecer o morir de forma desigual en las diferentes columnas durante la noche. Prueba también diferentes densidades de placas, diferentes intensidades de escaneo, optimizaciones de los factores de dilución de reactivos, placas con fondo de cristal, DRAQ5 por sí mismo como una mancha-núcleo único, o diferentes anticuerpos distintos de anti-α-tubulina o anti-MAP2.

Resultados

El factor limitante de la velocidad en estos experimentos es la tinción de infrarrojos, como el ensayo de ATP es relativamente de breve duración. Para los ensayos de infrarrojos, anticipamos que ocho placas de 96 pocillos se pueden teñir y escanean el plazo de un día a la asombrosa cifra de dos lotes de cuatro platos cada una (ver Figura 1). Esta estimación asume 20 min de la fijación, de 30 minutos de lavado, 30 min de bloqueo, 2 horas de incubación del anticuerpo primario seguido de 30 min de l...

Discusión

Hemos encontrado que la intensidad de la señal en los tres ensayos de viabilidad es lineal y se correlacionó con densidad de placas. Sin embargo, no todos los ensayos son igualmente sensibles a 2 veces o cambios 1.5 veces en la densidad de placas. Para las células N2a, los ensayos de infrarrojos son menos sensibles que el ensayo de ATP, particularmente a densidades más bajas de chapado. Aunque los ensayos de infrarrojos son menos sensibles que los ATP, los ensayos DRAQ5 + Zafiro y los ensayos de α-tubulina están e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Titer Glo	Promega	G7572	Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin	Thermo-Shandon	9990244	Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block	LI-COR	927-40003	This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	21568	We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher	S468	One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher	S373	See above
Sodium Azide (250x)	Ricca Chemical Company	7144.8-16	Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin	Sigma-Aldrich	T5168	This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M9942	This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-32210	Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5	Biostatus	DR50200	This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire	LI-COR	928-40022
Luminometer	PerkinElmer	VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager	LI-COR	9201-01
Shaker/Mixer	Research Products International	248555