培養中の細胞のための生存率アッセイ

要約

治療用化合物は、多くの場合、最初の生存率アッセイとin vitroで調べられます。人間の観察者によってブラインド細胞数は、細胞数の小さな変化に非常に敏感であることができますが、機能を評価しないでください。コンピュータ化された生存率アッセイは、ここで説明するように、客観的に構造および機能の両方を評価することができる。

要約

顕微鏡で手動細胞数は、細胞の生存能力を評価する敏感な手段ですが、時間がかかり、従って高価である。コンピュータ化された生存率アッセイは、設備の面で高価であるが、より速く、より客観的な手動の細胞数よりもすることができます。今回の報告は、3つのそのような生存率アッセイの使用が記載されている。これらのアッセイの二つは、赤外線であり、1つが発光性である。両方の赤外線アッセイは、16ビット·オデッセイイメージャに依存しています。つの赤外線アッセイは、細胞質ゾルのためのサファイア染色と組み合わせる核についてDRAQ5染色を使用し、700 nmのチャネルで可視化される。他の赤外線分析、インセルウェスタン、細胞骨格タンパク質（α-チューブリンまたは微小管結合タンパク質2）に対する抗体を使用し、800 nmのチャネルでそれらにラベルを付けます。第三の生存率アッセイは、ATPのために一般的に使用される発光アッセイであるが、我々はコストを節約するための推奨量の四分の一を使用しています。これらの測定は、すべての線状であり、CEの数と相関LLSメッキが、感度が異なる。 3つ全てのアッセイは、時間のかかる顕微鏡を回避し、それによりサンプリング誤差を低減し、ウェル全体をサンプリングする。最後に、アッセイの全ては、容易に短期間内で実行される実験の大きな数字を可能にする、実験の終了の1日以内に完了することができる。しかしながら、それらはすべて細胞数が治療後の信号強度に比例、時には特にセルラATPのために、満たされていないという仮定に留まるという仮定に依存する。細胞は、治療後に増加又はサイズが減少した場合さらに、これは細胞数に影響を与えることなく、信号強度に影響を与える可能性がある。我々は、手動カウントを含む、すべての生存率アッセイは、いくつか補足説明に苦しむと結論が、コンピュータ化された生存率アッセイは、初期投資の価値があること。一緒にすべての3つのアッセイを使用して、細胞の構造および機能の包括的なビューをもたらす。

概要

生物科学の中で最も一般的な生存率アッセイは、細胞数が含まれます。これは、2013年4月29日およ ​​び2013年4月30日に、キーワードのいずれかを「 インビトロ 」や「文化」とPubMedの中で登場し、トップ（最新の）200の出版物の分析によって証明されている。これらの刊行物の中でも、手動細胞数の計数を含む23.5％用いる細胞計数アッセイは、自動化された細胞数は、イメージングソフトウェアを使用してカウントし、トリパンブルー排除。生/死アッセイは、これらの刊行物の1％で使用した。 MTT（3 - （4,5 - ジメチルチアゾール-2 - イル）-2,5 - ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を用いて、多くの刊行物の代謝生存についてのアッセイは11％であった。文学のこの調査では、細胞数アッセイと組み合わせてMTTなどのアッセイを使用して多くの刊行物はわずか3.5％であったことを示しています。それ自体ずつ生存率アッセイを使用する傾向にもかかわらず、細胞数との組み合わせで細胞機能を評価することは私の細胞を評価するための最良の選択と思われるntegrity。残りの細胞が機能または彼らはよく^、1,2に存在しているにもかかわらず、健康的ではない可能性があるため、それ自体で細胞数が十分ではない。逆に、例えばATPなどの機能措置が増加または細胞の数の並列の変化の非存在下で低下することがある。細胞数から代謝読み出しの脱共役は、ATPおよびMTTアッセイは唯一の生存率アッセイとして使用してはならないことを示唆している。今回の報告では、細胞構造および代謝機能の両方を調査する3生存率アッセイは、それ自体でアッセイは余裕がある任意の1以上の細胞の完全性のより包括的なビューに記載されている。

我々のアッセイのうちの2つは、700および800nm​​のチャネルで蛍光を測定する赤外線撮像装置を必要とする。ノイズは、より高い信号対雑音比³につながる、赤外線波長が低い。我々は4.5ログダイナミックレンジと16のビット深度、translatinを持って使用オデッセイイメージャ赤外線の2 ¹⁶または65,536色合いにグラム。これは、波長ごとに色の2 ⁸または256階調を与える8ビットのカラー画像に対比することができる。したがって、16ビットのイメージングは​​、より微細な分解能を有する。これは、元の赤外線画像は、多くの場合、プレゼンテーションのための公表された報告では緑色（800 nm）を赤（700 nm）を疑似カラーしていることに留意すべきである。オデッセイのイメージャは、一般的に西部劇^4-7ウエスタンブロット法のためにと、セル内の両方に使用されます。セル内のホルムアルデヒド固定した細胞上の西部劇は、対象となる任意のタンパク質に対する一次抗体を使用し、赤外蛍光二次抗体で順番にそれらにラベルを付ける。この技術は、リンエンドポイント⁶のために特に有用であることが知られている。私たちにはセル西部劇では、細胞骨格タンパク質α-チューブリンまたは800 nmのチャネル内の神経細胞の微小管関連タンパク質2（MAP2）のための固定した細胞を染色する。これらのタンパク質は、高い信号対雑音比を得るために十分豊富である。また、700で私たちのプレートを染色DRAQ5染色でサファイア染色で細胞質の核のためのnmのチャネル。細胞骨格タンパク質とDRAQ5 +サファイアの汚れの両方は、このように細胞構造を反映している。

第三の生存率アッセイは、代謝機能を測定し、呼ばれて「セルタイターグロ。「このルシフェラーゼベースのアッセイにおいて、発光値がATPレベルに比例している。 ATPアッセイは一般に^8-12生存細胞^を定量するために使用される。細胞当たりのATP出力が毒素処置の関数として変化する可能性があるため、アッセイの名の下に単語「力価」を含むことは幾分誤った名称であり、セル番号⁸に比例して、したがって必ずしもである。 ATPレベルはまた^、13概日リズムによって、細胞分裂および¹⁴細胞分化¹⁵によって影響され得る。 ATPは代謝の堅牢な尺度であるので、それにもかかわらず、ここに示されているATPアッセイは実施が簡単で便利です。西部劇はそのためだけではいずれか1アッセイよりも細胞の完全性のより包括的な画像を生成するセル内の赤外線を補完するために、このアッセイを使用して。それ自体が数をセルでない場合は、生存率^{16〜21、。}

プロトコル

プロトコルの概略を図1に示す。

1。細胞播種

異なるめっき密度（ 図2）で、96ウェルプレート中の細胞をプレート。 N2aの神経芽腫細胞株、プレート2.5K、5K、10K、および3または6ウェル/グループのウェルあたり15K細胞上の直線性チェックのために。ラット初代皮質ニューロン、プレート25K、50K、100K、および3または6ウェル/グループのウェルあたり20万細胞での直線性チェックのために。細胞株または目的の初代細胞は、その細胞型のための最適細胞密度でかつ周囲に、異なるめっき密度でプレートを健康な見れば。

注：本研究では、N2a細胞下部の蒸発のために設計されているプレート上で200μlの培地中の100μlの培地および一次皮質ニューロンにプレーティングした。細胞処理、メディア、血清、抗生物質、および毒素治療の詳細については、Unnithan らを参照してください。 N2aはCELのためLS ⁸とPosimo ら 。一次皮質培養^22。

1. 1. 第96ウェルプレートにプレーを繰り返します。一方のプレートは、赤外線アッセイ（ 図2B）でのATP（ 図2A）、および他のためにアッセイする。細胞は、細胞内のATP測定のために開いて溶解する必要があるため、一つは、ATPと赤外線アッセイのために同じプレートを使用することはできません。
   2. 最適な播種密度（; 図2B列2）の赤外線アッセイにおけるバックグラウンド除去のために少なくとも3余分な井戸をプレートにしてください。
2. 列AとHでの列1および12外側のウェルに、より安価に細胞を含まないメディアや、滅菌水を追加します。生存率は、メディアの蒸発と温度勾配の影響から、ここで、多くの場合、低いほど、エッジに沿ってウェルからのデータに依存することは避けてください。マイクロプレートとのこのような問題は、一般的にエッジ効果^23,24と呼ばれています。空のこれらのウェルは保管しないで[行のBとGと列2と11は、エッジ効果に苦しんでいるため。
   エッジ効果は、CO ₂インキュベーター中²⁴への移行の前に周囲条件で室温にて新たに播種し、プレートをインキュベートすることによって低減することができる。さらに、Carralotによる最近の研究では、単一の制御列^23を使用してマイクロタイタープレートのための数学的な補正方法について説明します。オリバーらは、温度勾配^25を減らすために特別に設計された強制空気マイクロタイタープレートインキュベーターを使用していました。エッジ効果は、重要な関心事である場合、マイクロプレート安定性チャンバー（ 例えば、BT＆C社）は、高湿度および均一な温度勾配を有する均質な微小環境を作成するために購入することができる。
3. 追加の試薬 ​​希釈液又はそれ以上のメッキ密度がテストされるので、 図1に示されているよりも多くのウェルが必要な場合は、バックグラウンド減算のためのエッジウェルを使用。
4. 取り付けのために一晩待つ細胞およびアッセイ以下に説明するように次の日の朝の。

2。発光ATPアッセイ

1. バッファ基板の再構成のためのインキュベーション時間のための細胞タイターグロメーカーの推奨に従ってください。
   1. それぞれ、メッキのメディア100または200μLから50または150μlのメディアを取り出します。わずか50未満μlをウェル内の後ろのままになります。 1:2希釈の列2-6（ 図2A）に試薬（基質を加えた緩衝液）の25を添加する。
      注：除去は差動で、ウェル間でのATPアッセイ試薬を希釈または集中できた後にメディアの変化させるボリュームは残した。すべてのマルチチャンネルピペットチップ内の液体のレベルが同等であることを保証するために注意してください。すぐに正確さを保証するために、ATPアッセイ試薬を加える前に、ピペットを用いて、プレート全体の選択ウェル内の残留液を測定します。高い変動性は、メディアエバポールの差動レートから存在している場合プレートの表面を横切るATION、すべての古い培地を除去し、直ちにATPアッセイ試薬の添加前に、すべてのウェルに新鮮な培地またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の同じボリュームを追加する。プレートは蒸発々のレベルに苦しむ場合、コスター·コーニングからの低蒸発プレートに切り替えてみてください。後者のプレートにおいて、 図2に示す内部60ウェルのみ0.995パーセントの平均値から0.41メディア蒸発晩±苦しむ。アッセイ時の培地容量を無視できる程度にばらつきが存在する。
   2. 列7〜11に、行B〜Dの、上記で詳述したように、背後に50μLを残すために十分なメディアを取り出し、1:1希釈試薬50μlを加える。
   3. 列7〜11に、行からG Eは、100μlの培地で細胞を残して、1:1の希釈で再度、試薬を100μlを加える。同社は、試薬100μlを100μlの培地で1:1に希釈する必要があることを推奨しています。
      注：ためにコストを節約するために、ボリュームに、希釈の両方でこれらの推奨事項を切断することができる。しかし、これを実行する前に、それはアッセイの直線性と感度を低下させないことを確認してください。
   4. 1特定のボリュームおよび試薬の希釈倍率が十分であることが発見されると、すべてのその後の実験でそれらに固執。満足のいくデータの基準は結果セクションで説明します。
   5. 未使用の再構成された試薬は、再凍結とコストを節約するために、後日使用することができます。製造業者によると、再構成試薬は活性の約3％の損失で21週間、-20℃で保存することができる。
2. 2分または10分間章動シェーカーオービタルシェーカー上でプレートを置きます。プレートの一部が異なる測定についてアッセイされて、それを振とうすることができない場合、唯一の関心のウェルに単純な上下·アンド·ピペッティングでメディアを攪拌する。しかし、このステップの間に発生した過剰な気泡がルミに干渉しますルミネセント出力。
   1. 10分試薬の添加後、白色96ウェルプレートにウェル内容物の60μLを移す。彼らは上向きに検出器に向けて光を反射するので、発光値はクリアまたはブラックプレートよりも白のプレートに高い。
      注：我々の経験では、細胞は、他のプレートよりも明確なコースタープレートを低蒸発に優れて生き残る。これらの特定のプレートは、白い壁と一緒に販売されていません。第二に、壁不透明と透明底板は完全に透明プレートよりも高価である。一つは白色プレートにルミネ液体を転送すると、白色プレートはすべての実験のために新たな白色プレートを使用するコストを節約し、洗浄し、再使用することができる。液体を移送することはこのように長期的に安価なオプションです。
   2. 前プラスチック転送ピペットバルブから強制空冷で、好ましくは、針でプレートを読んだりして気泡をポップします。 1秒の積分時間でルミノメーター上でプレートを読み取る（会社recommeNDS 0.25秒として十分な積分時間）。 ATPアッセイ用試薬を加えた後、プレートを10から12分をお読みください。ギルバートと同僚²⁶で示すように、発光シグナルは、高速の減衰率との一時的なものであるので、タイミングが、異なるプレート間での比較のために重要である。
3. 散布図中の細胞数（ 図3参照）の関数としてプロットし、各グループ内の3または6ウェルからの発光値を平均する。対応する各データポイントから（11G - 2G、井戸11B - - 11D、ウェル11E井戸2B）最初に適切な空のウェルの平均バックグラウンド発光値を減算します。この最初の実験（ 図2A）の各播種密度の3つの異なるグループが存在します。 ATPレベルは直線的に1つ以上のこれらの基の全ての細胞密度と相関させることができる。それでも、コストを節約するために満足のいく結果が得られる試薬の最高希釈を進める。満足な結果のための基準が記載されているIN結果セクション。
   注：本研究で使用されるメディアでは、このアッセイでのバックグラウンド値が高くないと、それはブランクウェルをスキップすることが可能である。しかし、製造業者プロメガは異なる培養培地での発光の違いをレポートします。本研究は、ハイクローン胎児クローンIII、N2a細胞および一次皮質培養用のウシ胎児血清のためにウシ胎児血清の合成バージョンを使用しています。製造業者によると、胎児血清は、発光値を低下させるが、アッセイの感度を低下させない。これは重大な関心事である場合には、それにもかかわらず、検定の際に、PBSの代わりにメディア内のATPアッセイ試薬を希釈。
   1. 細胞は、一晩の列にわたって不均一に成長するように見える場合は、メッキの6時間以内にそれらをアッセイしてみてください。しかし、アッセイの通常の時間（治療後例えば、24時間）での密度は直線性を達成しなければならないの密度であることに注意してください。

3。 InfrareDアッセイ

1. めっき後の朝は、ヒュームフード中、室温で第二のプレートに細胞を固定。ホルムアルデヒドは発がん性物質であるため、このステップのために手袋を着用し、化学廃棄物として固定液を廃棄するようにしてください。 1：01希釈の既存のメディアに0.1 Mリン酸緩衝液中4％ホルムアルデヒドおよび4％スクロースを加える。媒体はまた、完全な強度の固定液中に固定する前にPBSで洗い流すことができる。どちらの技術がうまく動作します。
   1. 20分間固定液中でインキュベートした後、固定液を除去し、200μlのPBSで3回洗う。
2. アッセイは同じ日に行われない場合は、4℃で0.2％のアジ化ナトリウムを含むPBSでプレートを保管してください。そうでなければ、アッセイを進め、抗体の非特異的結合を最小限にするためにブロッキング溶液で細胞を置く。
   1. PBSに魚の血清オデッセイブロック1:1に希釈し、細胞透過剤として0.3％のTriton-X 100を追加します。十分なブロッキング液だけでなく、一次および二次antiboを作る35μlを各ウェルにピペットでできるように、DYソリューションを提供しています。しかし、気泡の多くは、ピペッティングの際に認められた場合に、各ウェルについて> 50μLを行い、そうでない気泡が結合する細胞とブロックする抗体に分解達する。過度の石鹸の泡がウェルの中央に染色されていない円形のスポットとして表示されます。これが発生した場合、ピペッティングを調整してみてください。
   2. 室温で30〜60分間、このブロッキング溶液中でインキュベートする。
      注：二次抗体と同一の種からの5％ウシ血清アルブミンまたは正常血清はまた、魚の血清ブロックのコストを節約するためのソリューションを阻止として使用することができる。溶液をブロックする抗体の性能に影響を与えることができる。したがって、各抗体の最適ブロックが最高の経験的に決定される。
      注：一部の研究者は、インキュベーションの間、シェーカー上でセル内西洋のプレートを配置。しかしながら、これは必要ではない。
3. 抗α-チューブリンのための1:10,000希釈：一次抗体を作る（マウスモノクローナル、 表1）および抗MAP2（マウスモノクローナル、 表1）1:2000希釈。これらの抗体は、これらの細胞モデルにおける目的のタンパク質に特異的である、特異性は、任意の免疫細胞化学染色のために不可欠です。
   注意：MAP2は神経細胞のマーカーである、混合グリア/ニューロン培養に適しています。アストロサイトはその数は、早期新生児期^27,28年をピークに、胎生18日目に最初に表示されるので、ここに示されている出生後の培養も、いくつかのグリア（〜25％）が含まれている。一つは、アストロサイトとニューロンのATPおよびDRAQ5 +サファイアアッセイを区別することはできません。別々に神経細胞とアストロサイトを測定Mullettや同僚^4,29に記載されているように、800および700 nmのチャネル同時MAP2およびGFAP染色を使用して、DRAQ5 +サファイアを除外するためである。培養液中のすべてのセルが評価されることを望む場合は、このようなα-チューブリン、β-アクチン、またはGAPDHなどの汎細胞マーカーを使用しています。
   注：これらの希釈はN2aは、一次皮質細胞のために最適化されており、すべてのモデルに一般化しない場合があります。したがって、少なくとも二つの一次抗体希釈液、プレートの左半分に1つ、右半分に1つ（ 図2B参照 ）を試みる。別の方法として、3つのウェルにそれぞれ一次抗体の希釈液3-4を試してみてください。例えば、抗体インサートシートに推奨される希釈液は、2倍の変化と隣接させることができる。言い換えると、免疫細胞化学のための推奨希釈は1:500である場合には、また、1:250および1:1,000希釈倍率を試してみてください。
   1. 1時01分オデッセイブロックで抗体を希釈：PBSおよび0.3％トリトン-Xを追加します。コストを節約するために、インキュベーションの最後に、この溶液を除去することにより、ステップ3.2.1での細胞に適用したブロッキング溶液中で抗体を作製してみてください。これをやっている間、PBSで細胞を維持する、彼らは乾燥しない必要があります。
   2. 室温または4℃で一晩、一次抗体のいずれか1〜2時間でインキュベート弱いBの豊富ではない抗体およびタンパク質をinding、一晩のインキュベーションは、信号を高めるのを助けることができます。
      注：各二次抗体濃度（井戸2B〜2Dおよび図2Bの井戸2E-2G）で背景差分のためのブロッキング溶液中で、少なくとも3ウェルのままにしておきます。いかなる一次抗体にこれらのウェルにさらさ​​ないでください。それらは、二次抗体による非特異的結合の程度を明らかにし、信号対雑音比を計算するために有用である。二次抗体の非特異的結合の高いレベルにつながることが懸念される場合には、一次又は二次のいずれかの抗体に曝露はなく洗浄の同じ番号を受信されていないコントロールウェルを含む。これらのウェルと「二次のみ "ウェル間の違いは、二次抗体のみに起因する非特異的結合の程度を明らかにする。マウスN2a細胞に対する我々の試験では、単独で抗マウス二次抗体とのシグナル強度は、抗ウサギの信号0.557±0.032であった二次抗体のみが二次抗体を用いて信号が0.357±0.003 0.533±0.041であったし、一次および二次抗体を用いた信号が11.867±0.911であった。そこで我々は、マウス細胞に対する抗マウス二次抗体を用いても、非特異的結合を高レベルで観察されなかった。いくつかのメーカーの赤外線二次抗体のがありますが、我々は唯一の高架橋吸着したものを買ってお勧めします。二次IgG抗体の濃度は、ソースに応じて変えることができることに注意してください。
4. さて、10分ごとに200μlのPBSで3回洗浄して、一次抗体を洗い流す。一次抗体を、0.2％アジ化ナトリウム中で数週間、4℃で保存され、溶液が光に保持されているときに破片の小さな斑点が明らかとなるまで再利用することができる。これだけのコストを節約するために行われます。コストが問題ではない場合は、使用するたびに新鮮な抗体を作る。
5. 1時01分オデッセイブロックで1:1,000や1:2,000で二次抗体を希釈0.3％のトリを含むPBSトン-X（ 図2B）。プレートの下半分に、天板の半分と1:2,000に1:1,000希釈を追加します。これらの濃度は、一層のコスト節約が、これにコミットする前に直線性をチェックするために減少させることができた。
   注：背景差分ウェル（ 図2Bの列2）に適した二次抗体溶液を追加してください。
   1. 第二のタンパク質は、700 nmのヤギ抗マウスIgGおよびマウス以外の種からの一次抗体と800 nmのチャネルでの第二のタンパク質とα-チューブリンまたはMAP2のためにDRAQ5 +サファイアの代わりに、ラベル細胞でアッセイされます。 800 nmのチャネルは、700 nmのチャネルより少ないバックグラウンドを持ち、関心の最も重要な蛋白質のために確保する必要があります。
   2. 光を避けて引き出しの中に、室温で1時間、二次抗体でインキュベートする。
6. さて、10分ごとに200μlのPBSで3回洗浄した二次抗体を洗い流す。
7. DRAQ5 +サファイア·ソリューションを作る。プレートの左半分のため、0.3％トリトン-X（列3から6、 図2B）でDRAQ5 1:10,000（0.5μM最終濃度）、PBS中のサファイア1:1000希釈する。プレートの右半分は、DRAQ5 1:20,000（0.25μM）を希釈し、サファイア1:2000（列7から10; 図2B）。
   注意：DRAQ5ではなく、5 mMストックの1 mMストックで販売されていました。いくつかの以前に公表された報告は、したがって、DRAQ5 ⁸の1:4,000または1:2,000希釈液を使用していました。
   1. 二つのプレートは、同時にアッセイされている場合、コストを節約するために、同一のDRAQ5 +サファイア溶液は、第1のプレートを離れてそれをピペットで第二に追加し、シーケンス内の2つのプレートに使用することができる。同ソリューションは、このように二度使用された場合は、1日以内にそれらを使用しています。希釈したDRAQ5 +サファイア·ソリューションは、4℃で保存したり、後で使用するために凍結することができません。
   2. 室温離れるfで30分間この溶液中でインキュベートする。ROMライト。時間が短く、DRAQ5 +サファイア·ソリューションは、異なるセカンダリが他のプレート上で再利用されない場合は、ステップ3.5で、二次抗体溶液にこれらの汚れを追加し、1時間インキュベート。
      注：これらのウェルは、700 nmのチャネルで染色してはならないように背景差分ウェル（ 図2Bの列2）にDRAQ5 +サファイアソリューションを追加しないでください。
8. 10分ごとにウェルあたり200μlのPBSでプレート3回洗浄します。プレートは赤外線撮像が完了した後に他の可視域二次抗体で染色されようとしている場合は、0.2％アジ化ナトリウムは、最終的なPBS洗浄に入れる。
9. オデッセイイメージャ上でプレートをスキャンします。震度5と169ミリメートルの分解能でプレートをスキャンすることから始めます。 「中程度の品質」や「低品質」の設定のどちらかで十分です。同社は詳細な励起/発光フィルタ情報を解放しません。しかしながら、発光フィルタは、約20nm幅であり、7を中心としているメーカーによると20〜820ナノメートル、。
   注：研究者が他のマーカーとそれを染色していきたいと思うかもしれとしてそれがまだ湿っている間、プレートをスキャンすることが可能である。しかし、同社は、乾板はあまりウェル間の信号の広がりにつながる、オンラインプロトコルで示唆している。あなたはデータを比較する湿った後、乾燥の両方にそれらをスキャンすると、蒸発後に残った塩は、エッジに沿って高いバックグラウンド蛍光の原因となる場合があるので井戸からすべてのPBSを削除してください。
   1. オデッセイイメージャは、最大スキャンして、プレートの底部を通って。ウェルの底板にその厚さと深さを変えることができるので、異なるメーカーのプレートが異なる焦点オフセットを要求することができる。異なる焦点オフセットでスキャンを試してみて、参照してくださいどこに最も高い信号対雑音比と最も鮮明（フォーカスで最も）信号が達成され、2.5ミリメートル、3.0ミリメートル、3.5ミリメートル、4.0ミリメートル。 findinを確認する定規でプレートの底から井戸の深さを測定することも試してみてくださいオデッセイにGS。井戸の底にあるプラスチック製の定規の測定値に追加の高さを追加することができますことを覚えておいてください。本研究で使用されるコースタープレートは、4.0ミリメートルの焦点オフセットが求められています。
   2. プレートの画像に適切なサイズのグリッドを配置し、Microsoft Excelにデータをエクスポートするためにソフトウェアではセル西洋関数を使用します。最も高い蛍光値を見つけるために、異なる焦点オフセットで同じ井戸の「積分強度」の値を確認します。最も高い信号対雑音比（「プライマリネガティブコントロール」井戸に対する免疫染色ウェルにおける信号）を生成するフォーカスオフセットは、以下を選択するものです。
   3. オフセット1フォーカス時に決定されると、より小さな単位で再びスキャンします。最も明るい信号が3.5と4.0ミリメートルにあった場合、3.6、3.7、3.8でスキャンを試して、3.9ミリメートルと信号強度の更なる改善があるかどうかを確認。フォーカスオフセットが間違っている場合は、空のPL上の12列にわたってシグナル強度代わりにフラットなラインのU字曲線として表示されます（すべての列が等しい信号を持っている必要がある場合）食べました。これはプラスチック板に問題が継続する場合は、ガラス底のプレートを試してみてください。
10. 700および800nm ​​のチャネル内のすべての対応するデータポイントから、バックグラウンド減算ウェル（2G - - 2D又はウェル2Eウェル2B 図2B）に積分強度の平均値を減算する。次いで、ウェルのグループごとに積算信号強度を平均化する。細胞密度に対する散布図などのデータをプロットします（ 図3を参照）。
    1. 一次および二次抗体と、その後の実験のための1の希釈ごとに決済するDRAQ5 +サファイアの2の異なる希釈の結果の2つの異なる希釈の結果を比較します。線形性が達成されない場合は、別の強度でスキャンをしてみてください。強度3と7の代わりに5を再スキャンし、データを再分析。データは、それらの強度の1に改善される場合が、まだ満足できるものではない、その強さの周りの単位で再スキャン。
    2. ソフトウェアは、ウェル中の白点を示して画像を分析しないように注意してください。これらのスポットは、イメージャの範囲外に飽和した信号を意味する。これが発生した場合、低強度でスキャンします。
    3. 線形性が達成されない場合、彼らが成長または一晩異なる列に偏って死ぬ可能性があるため、メッキの6時間以内に細胞を固定することもしてみてください。また、異なるメッキ密度、異なるスキャン強度、試薬希釈係数、ガラス底板、核のみ染色としてそれ自体でDRAQ5、または抗α-チューブリンまたは抗MAP2以外の異なる抗体のさらなる最適化を試してみてください。

結果

これらの実験における律速因子は、ATPアッセイは、持続時間が比較的短いほど、赤外線染色である。赤外線アッセイのために、我々は、8つの96ウェルプレート4枚のプレートの各々の驚異的な二つのバッチ（ 図1参照）により1日以内に染色し、走査することができると予想している。この推定は、固定の20分を想定し、洗浄30分、洗浄の30分、続いて2時間一次抗体インキュベーショ...

ディスカッション

我々は、すべての3つの生存能力アッセイにおける信号強度が線形でプレーティング密度と相関することを見出した。ただし、すべてのアッセイは、メッキ密度が2倍または1.5倍の変化にも同様に区別されます。 N2a細胞の場合は、赤外線のアッセイは、特に低メッキ密度で、ATPアッセイよりも感度が低い。赤外線アッセイは、ATPよりも感度が低いですが、彼らは、N-アセチルシステインの高度?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Titer Glo	Promega	G7572	Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin	Thermo-Shandon	9990244	Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block	LI-COR	927-40003	This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	21568	We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher	S468	One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher	S373	See above
Sodium Azide (250x)	Ricca Chemical Company	7144.8-16	Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin	Sigma-Aldrich	T5168	This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M9942	This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-32210	Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5	Biostatus	DR50200	This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire	LI-COR	928-40022
Luminometer	PerkinElmer	VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager	LI-COR	9201-01
Shaker/Mixer	Research Products International	248555