Kültür hücreleri için Canlılık Tahliller

Özet

Terapötik bileşikler genellikle ilk canlılığı deneyleri ile in vitro incelenmiştir. Bir insan gözlemci tarafından kör hücre sayımları hücre sayısındaki küçük değişikliklere son derece hassas olabilir ama fonksiyonunu değerlendirmek yok. Bilgisayarlı canlılığı deneyleri, burada açıklandığı gibi, objektif bir şekilde yapı ve fonksiyon hem de değerlendirebilir.

Özet

Bir mikroskop Manual hücre sayımları hücre canlılığının değerlendirilmesinde hassas bir yoludur, ancak zaman alıcı ve bu nedenle pahalıdır. Bilgisayarlı canlılığı deneyleri ekipman açısından pahalı ama daha hızlı ve daha objektif manuel hücre sayımları daha olabilir. Bu rapor, bu tür üç canlılığı tahlillerin kullanımını tarif eder. Bu tahlillerin ikisi kızılötesi ve bir parlak olan. Her iki kızılötesi tahlilleri bir 16 bit Odyssey Imager güveniyor. Bir kızılötesi deney sitosol için safir leke ile kombine çekirdekleri için DRAQ5 leke kullanır ve 700 nm kanalında görüntülenmiştir. Diğer kızılötesi deney, bir In-Cell Western, sitoskeletal proteinler (α-tubulin veya mikrotübül ilişkili protein 2) karşı antikorlar kullanır ve 800 nm kanal bunları etiketler. Üçüncü canlılık deneyi ATP için yaygın olarak kullanılan bir ışıldayan deney, ama biz maliyet tasarruf için önerilen hacminin dörtte kullanın. Bu ölçümler her doğrusaldır ve ce sayısı ile ilişkiliLLS kaplama, ancak duyarlılık değişir. Tüm deneyler üç zaman alıcı mikroskobu aşmak ve tüm kaynak örnek, bu şekilde, örnekleme hatasının azaltılması. Son olarak, bütün deneylerde kolayca kısa zaman dilimleri içinde yapılması gereken deney daha fazla sayıda izin veren, deney sonunda bir gün içinde tamamlanabilir. Ancak, hepsi hücre sayıları tedaviler, bazen özellikle hücresel ATP için bir araya geldi değil, bir varsayım sonra sinyal gücü orantılı kalması varsayımına dayanmasıdır. Hücreler artırmak veya tedavi sonrası boyutunda azalma Ayrıca, eğer, bu hücre sayısı etkilemeden sinyal gücünü etkileyebilir. Biz manuel sayıları dahil tüm canlılığı deneyleri, uyarılar bir dizi muzdarip olduğu sonucuna, ancak bilgisayarlı canlılığı deneyleri ilk yatırım değer. Her üç deneyleri kullanılarak birlikte hücresel yapısı ve fonksiyonu kapsamlı bir görünümünü verir.

Giriş

Biyolojik bilimlerde en yaygın canlılığı tahlil hücre sayıları içerir. Bu 2013/04/29 ve 2013/04/30 üzerinde anahtar kelime ya "in vitro" veya "kültür" ile PubMed'de çıktı üst (en son) 200 yayınların analizi ile kanıtlanır. Bu yayınların, manuel hücre sayısı sayımı dahil olmak üzere% 23.5 kullanılan hücre sayımı tahlilleri, otomatik hücre sayısı görüntüleme yazılımı ile sayar ve Trypan mavi dışlama. Canlı / Ölü deney, bu yayınların% 1 kullanılmıştır. MTT (3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolyum bromür) kullanılarak yayın sayısı metabolik canlılığı için tahlil% 11 idi. Edebiyat Bu anket aynı zamanda hücre sayımı tahlilleri ile birlikte böyle MTT gibi analizleri kullanılarak yayın sayısı sadece% 3.5 olduğunu göstermektedir. Hücre sayısı ile birlikte hücresel fonksiyonunun değerlendirilmesinde, tek başına bir canlılık deneyi kullanmak için eğilim hücresel i değerlendirmek için iyi bir seçim gibi görünüyor rağmenntegrity. Geriye kalan hücreler fonksiyonel ya da ^1,2 kuyu içinde mevcut olmasına rağmen sağlıklı olmayabilir, çünkü kendi başına hücre sayımları yeterli değildir. Bunun tersine, ATP gibi fonksiyonel önlemler artırmak veya hücre sayısındaki paralel değişikliklerle yokluğunda azaltabilir. Hücre sayısı metabolik okumalanna ayrılması ATP ve MTT testleri tek canlılık deneyi olarak asla kullanılmamalıdır gerektiğini göstermektedir. Bu raporda, hücresel yapılar ve metabolik fonksiyonu hem de anket üç canlılığı deneyleri gelemez kendisi tarafından herhangi bir tahlil daha hücresel bütünlüğü daha kapsamlı bir görünüm için, tarif edilmektedir.

Bizim deneylerinin iki 700 ve 800 nm kanallarda floresan ölçen bir enfraruj görüntüleyici gerektirir. Gürültü daha yüksek sinyal-gürültü oranı ³ yol açan, kızılötesi dalga boyu düşüktür. Kullandığımız Odyssey kamera, 4.5 günlük dinamik aralık ve 16, TRANSLATIN bir bit derinliğe sahipkızılötesi 2 ¹⁶ veya 65.536 tonları g. Bu sadece her dalga boyu için renk 2 ⁸ veya 256 tonunu tanıyor 8-bit renk görüntüleme, tezat olabilir. Böylece, 16-bit görüntüleme ince çözünürlüğe sahiptir. Bu orijinal kızılötesi genellikle görsel sunumu için yayınlanmış olan raporlarda (800 nm) ve kırmızı (700 nm), yeşil yalancı olduğu not edilmelidir. Odyssey kameralar genellikle Western blot ve In-Hücre Batılıların ^4-7 hem de kullanılmaktadır. In-Cell formaldehit sabit hücreleri üzerinde Western ilgi duyulan herhangi bir protein karşı birincil antikor kullanımı ve kızıl ötesi floresan ikincil antikorlarla da etiketleyin. Bu teknik, fosforilasyon uç noktalar ⁶ için özellikle yararlı olduğu da bilinmektedir. Bizim In-Cell Western olarak, sitoskeletal proteinler α-tübülin ya da 800 nm kanalda nöronal mikrotübül ilişkili protein 2 (MAP2) için sabit hücreleri boyamak. Bu proteinler yüksek sinyal-gürültü oranı elde etmek için yeteri kadar bol miktarda bulunmaktadır. Biz de 700 yılında bizim plakaları lekeDRAQ5 leke ile ve safir leke ile sitoplazmada için çekirdekleri için nm kanalı. Sitoskeletal proteinler ve DRAQ5 + Sapphire lekeleri Hem böylece hücresel yapılarını yansıtmaktadır.

Üçüncü canlılığı deneyi, metabolik fonksiyonu büyüklüğüne ve adı "Hücre Titer Glo.", Bu lusiferaz bazlı tahlilde, parlaklık değerleri ATP seviyeleri doğrudan orantılıdır. ATP tahliller genel olarak canlı hücreler ^8-12 ölçmek için kullanılır. Hücre başına ATP çıkış toksin tedaviler bir fonksiyonu olarak değişebilir Ancak, tahlilin adına kelime "titre" da dahil olmak üzere bir yanlış isim biraz ve hücre sayısı ⁸ ile orantılı olarak, bu nedenle her zaman değil. ATP düzeyleri de sirkadyan ritim ¹³ ve ^14, hücre bölünmesi ve hücre farklılaşması ¹⁵ etkilenebilir. ATP metabolik sağlam bir ölçüsüdür çünkü Bununla birlikte, burada gösterilen ATP deneyi gerçekleştirmek için basit ve faydalıdırcanlılığı ^16-21, başına numara hücre değilse. Batılıların bu nedenle tek başına herhangi bir deneyde daha hücresel bütünlüğün daha kapsamlı bir resmini verir In-Cell kızılötesi tamamlamak için bu tahlil kullanma.

Protokol

Protokollerin bir şematik Şekil 1 'de gösterilmiştir.

1.. Hücre Kaplama

Farklı kaplama yoğunlukları (Şekil 2), 96 oyuklu plakalar içinde Plate hücreler. N2a nöroblastom hücre hattı, plaka 2.5K, 5K, 10K, ve 3 veya 6 kuyu / grubunda kuyu başına 15k hücreleri üzerinde doğrusallık kontroller için. Birincil fare kortikal nöronlarda, plaka 25k, 50k, 100K, ve 3 veya 6 kuyu / grubunda kuyu başına 200k hücrelerinde doğrusallık kontroller için. Hücre hatları ya da ilgi duyulan birincil hücre, farklı kaplama yoğunlukları, levha bu hücre tipi için en uygun hücre yoğunluğunda ve çevresinde sağlıklı bakarsak.

Not: Bu çalışmada, N2a hücreler daha düşük buharlaşma için tasarlanmış tabakalarına 200 ul ortam içerisinde 100 ul ortam ve birincil kortikal nöronlarda kaplandı. Hücre işleme, medya, serum, antibiyotik ve toksin tedavisi hakkında ayrıntılı bilgi için, Unnithan ark bakın. N2a cel içinls ⁸ ve posimo et al. Birincil kültürler ²² korteks için.

1. 1. Ikinci bir 96-yuvalı plaka üzerine kaplama tekrarlayın. Bir plaka ATP (Şekil 2A) için analiz edilmiş ve kızılötesi deneyleri (Şekil 2B) ile diğer olacaktır. Hücreler, hücre içi ATP ölçümleri için açık lize edilmesi gerekir, çünkü bir ATP ve kızılötesi deneyleri için aynı plaka kullanamaz.
   2. Optimum kaplama yoğunluğu (; Şekil 2B sütun 2) de kızılötesi deneylerinde arka plan çıkarma için en az 3 ekstra kuyu plaka emin olun.
2. Satırlar A ve H ve sütun 1 ve 12'de dış oyuklara daha ucuz hücreleri olmadan ortam ya da steril su ekleyin. Canlılığı ortam buharlaştırma ve sıcaklık değişimleri etkilerinden daha düşük burada sık sık olduğu gibi, kenarları boyunca kuyulardan verilere dayanarak kaçının. Mikroplakalara ile bu tür sorunlar genellikle kenar efektleri ^23,24 denir. Boş bu kuyuların tutmayınDaha sonra satır B, G ve sütunlar 2 ve 11 kenar etkisine maruz için.
   Kenar etkileri _CO2 inkübatöründe ²⁴ içine transfer edilmeden önce ortam koşullarında, oda sıcaklığında taze tohumlanmış plaka inkübe edilerek azaltılabilir. Ayrıca, Carralot tarafından yeni bir çalışma, tek bir kontrol sütun ²³ mikrotitre plakaları için matematiksel bir düzeltme yöntem açıklanır. Oliver ve arkadaşları termal değişim ²⁵ azaltmak üzere özel olarak tasarlanmış bir cebri hava mikrotitarasyon plaka inkübatör kullanılmıştır. Kenar etkisi önemli endişe ise, mikro stabilite odaları (örneğin BT & C Incorporated), yüksek nem ve hatta sıcaklık değişimleri ile homojen bir mikro-ortam yaratmak için satın alınabilir.
3. Ek reaktif seyreltme ya da daha fazla kaplama yoğunlukları, test edilecek için, Şekil 1 'de gösterilen daha fazla kuyu ihtiyaç varsa, arka plan çıkarma için kenar kuyu kullanın.
4. Eki için bir gece bekleyinhücreler ve deneyi, aşağıda tarif edildiği gibi bir sonraki sabah.

2. Lüminesans ATP Deneyi

1. Tampon maddesi ile alt-tabakanın yeniden oluşturulması ve inkübasyon sürelerinde Hücre Titer Glo imalatçının tevsiyelerini izleyin.
   1. Sırasıyla, kaplama medyanın 100 veya 200 ul 50 veya 150 ul ortamı çıkarın. Biraz daha az 50 ul daha iyi geride kalır. Bir 1:02 seyreltide sütunlar 2-6 (Şekil 2A) için reaktifler (substrat artı tampon) 25 ul ekle.
      Not: kaldırma diferansiyel kuyuları karşısında ATP tahlil belirteçlerinin sulandırmak veya konsantre olabilir sonra medyanın değişen hacimleri geride bıraktı. Tüm çok kanallı pipet uçları sıvı seviyesi eşit olduğundan emin olmak için özen gösterin. Hemen doğruluğunu sağlamak için ATP deney reaktifler ilave edilmeden önce bir pipet ile plaka üzerinde seçme kuyu kalan sıvı ölçün. Yüksek değişkenlik medya Evapor diferansiyel oranları varsaLevhanın yüzeyi boyunca ation, tüm eski ortamını çıkarın ve hemen ATP tahlil belirteçlerin ilave edilmeden önce, tüm oyuklara taze ortam ya da fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde aynı miktarda ekleyin. Plakalar buharlaşma değişken seviyeleri muzdarip, Costar Corning'ten düşük buharlaşma plakaları geçmeyi deneyin. Ikinci plakalar, Şekil 2'de gösterilen 60 iç oyukları, sadece% 0,995 arasında bir ortalama 0.41 ± gece boyunca ortam buharlaşma muzdarip. Deneyin zamanında ortam hacmi içinde önemsiz değişkenlik duyulmaktadır.
   2. Yukarıda ayrıntılı olarak sütunlardaki 7'den 11'e kadar, satırlar B D yoluyla, geride 50 ul bırakmak için yeterli ortamı çıkarın ve 1:1 seyreltme reajanların 50 ul ekleyin.
   3. Sütunlarında 7 11 aracılığıyla, G, E ile satır, 100 ul ortam içinde hücreler bırakın ve 1:1 'lik bir seyreltme yine, reaktiflerin 100 ul ilave edin. Şirket reaktiflerin 100 ul ortam içinde 100 ul içinde 1:1 seyreltilmiştir gerektiğini önerir.
      Not: amacıylamaliyet tasarrufu için, bu hacim ve seyreltme hem de bu öneriler kesmek mümkündür. Bununla birlikte, bunu yapmadan önce, bu deneyinin doğrusallığını ve duyarlılığı azaltmaz emin olun.
   4. Belirli bir hacmi ve reaktiflerin seyreltme faktörü Tatmin edici olduğu bulunan sonra, daha sonraki tüm deneylerde sopa ile. Tatmin edici veriler için kriterler Sonuçlar bölümünde tarif edilmektedir.
   5. Kullanılmayan yeniden reaktifler refrozen ve maliyet tasarrufu için daha sonraki bir tarihte kullanılabilir. Üreticiye göre, yeniden reaktifler aktivitesinin ~% 3 ​​kaybı ile 21 hafta boyunca -20 ° C'de saklanabilir.
2. 2 dakika ya da 10 dakika boyunca bir çalkalayıcı için sallanan bir orbital çalkalayıcıda plakası yerleştirin. Plaka bir parçası farklı ölçüm için tahlil edilmektedir ve çalkalandı olamaz, yalnızca ilgilenilen kuyularda basit aşağı yukarı ve pipetleme ile ortam ajite. Ancak bu adım sırasında oluşan aşırı kabarcıklar Lumi müdahale edeceknescent çıkışı.
   1. 10 dakika sonra, reaktifler ilave edildikten sonra, beyaz 96-yuvalı plakalar içine de içeriğinin 60 ul transfer. Onlar yukarı dedektörün doğru ışığı yansıtır çünkü Lüminesans değerler berrak veya siyah plakalar daha beyaz plakalar yüksektir.
      Not: Bizim tecrübelerimize göre, hücreler, diğer levhalara göre daha net costar plakaları düşük buharlaşma daha iyi hayatta. Bu özel plakalar beyaz duvarlar ile satılmaz. İkincisi, duvarlı-opak ve şeffaf dipli plakaları tamamen açık plakalara göre daha pahalıdır. Biri beyaz plakalar ışıldayan Sıvıyı eğer, beyaz plakalar yıkanabilir ve her deney için yeni beyaz plakalar kullanarak maliyet tasarrufu, yeniden. Sıvının aktarılması ve böylece uzun vadede daha ucuz bir seçenektir.
   2. Önce plastik bir transfer pipeti ampulden gelen basınçlı hava ile, tercihen bir iğne ile plaka okuma ya da herhangi bir hava kabarcığı pop. 1 sn entegrasyon süresi (şirket, önerile ile bir lüminometre üzerinde plaka okuyunnds 0.25-1 sn yeterli entegrasyon zamanı). ATP deneyi, reaktifler ilave edildikten sonra plaka 10-12 dk okuyun. Gilbert ve arkadaşları ²⁶ ile gösterildiği gibi, lüminesan sinyal, biri hızlı boşalma oranı ile geçici olduğu için zamanlama, farklı plakalar arasında karşılaştırma için çok önemlidir.
3. (Bakınız Şekil 3) bir saçılım hücre sayısının bir fonksiyonu olarak, her bir grup ve bir arsa içindeki 3 veya 6 kuyu lüminesan değerlerinin ortalamasını alın. Her gelen veri noktasından (11G - 2G, kuyular 11B - - 11D ve 11E kuyular kuyular 2B) birinci ortalama uygun boş kuyu arka plan aydınlığı değerleri çıkarmak. Bu deney, ilk (Şekil 2A) her bir plaka yoğunluğunda için üç farklı grup olacaktır. ATP seviyeleri, bu grupların doğrusal ya da her bir hücre yoğunluğu ile ilişkili olabilir. Hala maliyet tasarrufu için tatmin edici sonuçlar vermektedir reaktiflerin yüksek seyreltme ile devam edin. Tatmin edici sonuçlar elde etmek için kriterleri açıklanmıştır in Bulgular bölümü.
   Not: Bu çalışmada kullanılan ortam ile, bu testte arka plan değerleri yüksek değildir ve bu boş bir kuyu atlamak mümkündür. Ancak, üretici Promega farklı kültür ortamı ile photoiletkenliğin farklılıkları raporlar. Bu çalışma, Hyclone Fetal Clone III, N2a pil ve kortikal kültürlerde için buzağı serumu için fetal sığır serumu sentetik bir versiyonunu kullanır. Üreticiye göre, dana serum parlaklık değerlerini azaltır ama tahlilin hassasiyetini azaltamaz. Bu önemli bir endişe kaynağıdır Yine de, eğer, deneme zamanına PBS yerine ortam içinde ATP deney reaktif maddelerin seyreltilmesi.
   1. Hücreler gecede sütunlar arasında dengesiz büyümeye görünüyorsa, kaplama 6 saat içinde onları tahlil deneyin. Ancak, testin olağan zamanında (tedaviden sonra örneğin 24 saat) de yoğunluk doğrusallık elde edilmelidir hangi yoğunluk olduğunu akılda tutmak.

3. Infrared Tahliller

1. Kaplama sonra sabah, çeker ocak içinde, oda sıcaklığında, ikinci plaka içindeki hücreleri düzeltmek. Formaldehit kanserojen çünkü bu adım için eldiven giymek ve kimyasal atık olarak fiksatif imha emin olun. 1:1 'lik bir seyreltme var olan ortama 0.1 M fosfat tampon maddesi içinde% 4 formaldehit ve% 4 sukroz ekleyin. Medya da tam güç sabitleştirici sabitleme önce PBS ile yıkanarak olabilir. Ya tekniği iyi çalışıyor.
   1. 20 dakika süreyle tespit sıvısı içerisinde inkübe edin ve daha sonra fiksatif çıkarın ve 200 ul PBS içinde 3 kez yıkayın.
2. Tahlil, aynı gün böyle olmaz ise 4 ° C'de% 0.2 sodyum azid ile PBS içinde plaka saklayın. Aksi takdirde, deneyi devam etmek ve antikorların spesifik olmayan bağlanma en aza indirmek için bloke etme çözeltisi hücreleri yerleştirin.
   1. PBS içinde balık serum Odyssey blok 1:01 seyreltin ve bir hücre permeabilizer olarak% 0.3 Triton-X-100 ilave edin. Yeterince engelleme çözüm yanı sıra birincil ve ikincil Antibo olundy çözelti, 35 | il her bir oyuğa pipetle böylece. Baloncuklar bir sürü pipetleme sırasında gözlenen Ancak, aksi kabarcıklar aşağı bağlama gelen hücre ve blok antikorların içine ulaşmak, her bir kuyu için> 50 ul olun. Aşırı sabunlu kabarcıklar kuyunun ortasında bir boyanmamış dairesel nokta olarak görünür. Bu oluşursa pipetlenmesini ayarlamak için deneyin.
   2. Oda sıcaklığında 30-60 dakika boyunca bu çözelti içinde bloke inkübe edin.
      Not: İkincil antikor olarak aynı türden% 5 sığır serumu albümini ya da normal sera aynı zamanda balık serum bloğun maliyet tasarrufu için çözüm olarak bloke kullanılabilir. Çözümleri engellemek antikorun performansını etkileyebilir. Bu durumda, her bir antikor için uygun blok iyi şekilde ampirik olarak belirlenir.
      Not: Bazı araştırmacılar inkubasyon sırasında sarsıcıların In-Hücre Batı plakaları yerleştirin. Ancak, bu gerekli değildir.
3. Anti-α-tubulin için 1:10,000 seyreltme: Birincil antikor yapmak(Fare monoklonal, Tablo 1) ve anti-MAP2 (fare monoklonal, Tablo 1) için 1:2,000 seyreltme. Bu antikorlar, bu hücresel modellerinde ilgi proteinlere özgü, bir özgüllük immünositokimyasal leke için gereklidir.
   Not: MAP2 nöronlar için bir gösterge ve karışık glial / nöronal kültürler için uygundur. Astrositler sayıları erken neonatal dönemde ^27,28 zirve ile, embriyonik gün 18 ilk görünür, çünkü burada gösterilen doğum sonrası kültürleri de bazı glia (~% 25) içerir. Bir astrositlerde ve nöronların ATP ve DRAQ5 + Sapphire tahliller arasında ayrım yapamaz. , Ayrı ayrı nöronlar ve astrositleri ölçmek Mullett ve arkadaşları ^4,29 tarafından açıklandığı gibi, 800 ve 700 nm kanallarda eşzamanlı MAP2 ve GFAP boyama kullanırım, DRAQ5 + Sapphire bırakarak için. Kültürdeki tüm hücreler değerlendirilmelidir isteyen, ancak bu gibi α-tubulin, β-aktin ya da GAPDH gibi bir pan-hücre işaretleyici kullanın.
   Not: Bu seyreltikleri N2a ve birincil kortikal hücreler için optimize edilmiş ve her model için genelleme değil. Bu nedenle, en az iki primer antikor dilüsyonları, plakanın sol yarısında bir ve sağ yarısında bir (Şekil 2B) deneyin. Alternatif olarak, 3 kuyu her primer antikorların 3-4 dilüsyonlarını deneyin. Örneğin, antikor, uç levha üzerinde tavsiye edilen bir seyreltme iki kat değişiklikleri ile çevrili olabilir. İmmünositokimya için tavsiye edilen seyreltme 1:500 olacaktır, başka bir deyişle, aynı zamanda 1:250 ve 1:1000 seyreltme faktörleri deneyin.
   1. PBS ve% 0.3 Triton-X ekleyin: 01:01 Odyssey blokta antikorlar seyreltin. Maliyet tasarrufu için, inkübasyon sonunda, bu çözelti kaldırarak adım 3.2.1 hücrelere uygulandı bloke çözeltisi içinde antikorların üretilmesi deneyin. Bunu yaparken PBS içinde hücreleri tutun; kurumasını gerekir.
   2. Ya da 1-2 saat oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C 'de primer antikor içinde inkübe Zayıf b içinantikorları ve bol olmayan proteinleri inding, gecede inkubasyon sinyali artırmak yardımcı olabilir.
      Not: her bir ikincil antikor konsantrasyonu (kuyu 2B-2B ve kuyu Şekil 2B'de 2E-2G) ile arka plân çıkarma için bloke etme çözeltisi olarak en az 3 kuyu bırakın. Herhangi bir primer antikor için bu kuyuların maruz bırakmayın. Bu ikincil antikor ile spesifik olmayan bağlama kapsamını ortaya çıkarmak ve sinyal-gürültü oranı hesaplamaları için yararlıdır. İkincil antikorlar, spesifik olmayan bağlanma yüksek düzeyde yol açacaktır bir endişe var ise, aynı zamanda, birincil veya ikincil antikoruna maruz ama yıkama ile aynı sayıda değildir alma kontrol kuyuları içermektedir. Bu kuyu ve "ikincil tek" kuyu arasındaki fark, tek başına ikincil antikor ile spesifik olmayan bağlanma neden olduğu ölçüde ortaya çıkaracaktır. Fare N2a hücreleri üzerindeki testte, tek başına olan anti-fare ikincil antikoru ile sinyal yoğunluğu 0.557 ± 0.032, anti-tavşan ile sinyalyalnız ikincil antikor ikincil antikor ile sinyal, 0.357 ± 0.003 0.533 ± 0.041 idi ve primer ve sekonder antikor ile sinyal 11.867 ± 0.911 idi. Fare hücreleri üzerinde anti-fare ikincil antikorlar kullanılarak bile Dolayısıyla spesifik olmayan bağlanma yüksek düzeyde gözlenmiştir değil. Birçok üretici kızılötesi ikincil antikorlar için vardır, biz sadece yüksek düzeyde çapraz emdirilmiş olanları satın öneririz. İkinci IgG antikorlarının konsantrasyonu kaynağına bağlı olarak farklı olabileceğini not edin.
4. Iyi, 10 dakika her biri başına 200 ul PBS 3 yıkar primer antikorlar yıkayınız. Birincil antikorlar% 0,2 sodyumazid birkaç hafta boyunca 4 ° C'de kaydedilir ve çözümleri ışığa tutulduğunda enkaz küçük lekeler belirgin hale gelene kadar tekrar edilebilir. Bu sadece maliyet tasarrufu için yapılır. Maliyeti bir sorun değilse, her kullanım için taze antikorlar yapmak.
5. 01:01 Odyssey blok 1:1,000 veya 1:2,000 ile ikincil antikor seyreltin:% 0.3 Tri ile PBSton-X (Şekil 2B). Plakanın alt yarısına plaka ve 1:2,000 üst yarısına 1:1000 seyreltme ekleyin. Bu konsantrasyonlar daha fazla maliyet tasarrufu, ancak bu işlemeden önce doğrusallık kontrol etmek için azaltılmış olabilir.
   Not: Arka plan çıkarma kuyuları (Şekil 2B sütun 2) için uygun ikincil antikor çözüm eklemek için emin olun.
   1. Ikinci bir protein DRAQ5 + safir, fare dışında başka bir türden primer antikorlar ile 800 nm kanal 700 nm keçi anti-fare IgG ve ikinci protein ile α-tübülin ya da MAP2 için etiket hücreleri yerine tahlil edilecektir. 800 nm kanal 700 nm kanaldan daha az bir geçmişe sahiptir ve ilgi en kritik protein için ayrılmış olmalıdır.
   2. Işıktan uzakta bir çekmece içerisinde oda sıcaklığında 1 saat boyunca ikincil antikorlar inkübe edin.
6. Iyi, 10 dakika her biri başına 200 ul PBS 3 yıkar ile ikincil antikorlar yıkayınız.
7. DRAQ5 + Sapphire çözümler olun. Plakanın sol yarısında, DRAQ5 1:10,000 (0.5 uM nihai konsantrasyon) seyreltilmesi ve PBS içinde 1:1000 safir% 0.3 Triton-X ile (sütunlar 3-6, Şekil 2B). Plakanın sağ yarısında, DRAQ5 1:20,000 (0.25 mikron) sulandırmak ve Sapphire 1:2000 (sütunlar 7-10; Şekil 2B).
   Not: yerine 5 mM stok 1 mM stok satılacak kullanılır DRAQ5. Bazı raporlar, bu nedenle daha önce yayınlanmış DRAQ5 ⁸ 1:4,000 veya 1:2,000 seyreltilmiş numuneleri kullanılır.
   1. Iki tabak aynı anda test ediliyor ise, maliyet tasarruf etmek için, aynı DRAQ5 + Sapphire çözümleri ilk plaka kapalı pipetleme ve ikinci ekleyerek, sırayla iki tabak kullanılabilir. Aynı çözümleri bu şekilde iki defa kullanılacak ise, bir gün içinde onları kullanabilirsiniz. Sulandırılmış DRAQ5 + Safir çözümleri 4 ° C'de kaydedilen veya daha sonra kullanılmak üzere dondurulabilir olamaz.
   2. Uzak f oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bu çözeltilerde inküberom ışığı. Zaman kısa ve DRAQ5 + Sapphire çözümler adımda 3,5 sekonder antikor çözümleri bu lekeleri ekleyin ve 1 saat boyunca inkübe, farklı secondaries diğer plakalar üzerinde yeniden olmayacak eğer.
      Not: Bu kuyular 700 nm kanalda lekeli olmamalıdır gibi arka plan çıkarma kuyuları (Şekil 2B sütun 2) için DRAQ5 + Sapphire çözüm katmayın.
8. 10 dakika her biri için, oyuk başına 200 ul PBS ile levha 3 kez yıkayın. Plaka kızılötesi görüntüleme tamamlandıktan sonra diğer görünür menzilli sekonder antikor ile boyandı olacak ise son PBS yıkama% 0.2 sodyum azidi koydu.
9. Odyssey Imager üzerinde plaka tarayın. Yoğunluğu 5 ve 169 mm çözünürlükte plakaları tarayarak başlayın. "Orta kalite" veya "düşük kalite" ayarları Ya yeterlidir. Şirket detaylı uyarma / emisyon filtresi bilgi bırakmaz. Fakat, emisyon filtreleri yaklaşık 20 nm çapında olan ve yaklaşık 7 ortalanırÜreticiye göre, 20 ve 820 nm.
   Not: müfettişler diğer belirteçler ile onlara leke devam etmek isteyebilirsiniz gibi hala ıslak iken plakaları taramak mümkündür. Ancak şirket, kuru plakalar daha az iyi-iyi sinyal yayılımına sebep kendi online protokol göstermektedir. Eğer verileri karşılaştırmak için ıslak ve daha sonra kuru hem de bunları taramak ise, buharlaştırma sonra kalan tuzlar kenarlarında yüksek eşiğe yol açabilir, çünkü kuyudan tüm PBS kaldırmak emin olun.
   1. Odyssey Imager kadar tarar ve plaka altından geçerek. Kuyuların alt plakadaki kalınlıklarına ve derinliği değişebilir, çünkü farklı üreticilerin levhalar farklı odak uzaklıklar talep edebilir. Farklı odak uzaklıklar taramayı deneyin ve bakın nerede en yüksek sinyal-gürültü oranı ve crispest (odak çoğu) sinyali elde edilir: 2,5 mm, 3,0 mm, 3,5 mm, 4,0 mm. Findin onaylamak için bir cetvel ile bir plakanın alttan oyuk derinliğini ölçülmesi de deneyinOdyssey gs. Kuyunun dibinde plastik cetvel ölçümlere ek yükseklik ekleyebilirsiniz unutmayın. Bu çalışmada kullanılan costar plakaları 4.0 mm'dir bir odak talep ediyoruz.
   2. Plaka resmin üzerine sağ-boy ızgara yerleştirin ve Microsoft Excel'e veri aktarmak için yazılım In-Hücre Batı işlevini kullanın. Yüksek floresans değerleri bulmak için farklı odak uzaklıklar boyunca aynı kuyuların "entegre yoğunluk" değerleri inceleyin. ("Birincil Negatif kontrol" oyuklara karşı immüno kuyularda sinyali) en yüksek sinyal-gürültü oranı veren ofset odak bundan sonra seçmek için biridir.
   3. Offset bir odak üzerine karar verildikten sonra, küçük artışlarla yeniden tarayın. Parlak sinyal 3.5 ve 4.0 mm idi Örneğin, 3.6, 3.7, 3.8 taramayı deneyin, ve 3.9 mm ve sinyal gücü başka gelişme olup olmadığını görmek. Offset odak yanlış ise, boş bir pl 12 sütun üzerinde sinyal yoğunluklarıyerine düz bir çizgi bir U-biçimli bir eğri gibi görünür (tüm sütunlar eşit bir sinyal olmalıdır zaman) yedik. Bu plastik plakalar ile ilgili bir sorun olmaya devam ederse, altı cam plakalar deneyin.
10. 700 ve 800 nm kanallarda karşılık gelen her bir veri noktasından, arka plan çıkarma oyuklara (2G - - 2D veya kuyu 2E kuyu 2B Şekil 2B) 'de entegre edilmiş yoğunluklarının ortalamasını çıkarın. Daha sonra kuyu her grup için entegre sinyal yoğunluklarını ortalama. Hücre yoğunluğuna karşı bir saçılım olarak veri alanı (Şekil 3).
    1. Birincil ve ikincil antikorlar ve daha sonraki deneyler için, bir seyreltme her yerleşmek DRAQ5 + Safir iki farklı dilüsyon sonuçlarının iki farklı dilüsyon sonuçlarını karşılaştırın. Doğrusallık elde değilse, farklı bir yoğunlukta taramayı deneyin. Yoğunlukları 3 ve 5 yerine 7 ile yeniden taramak ve veriyi tekrar analiz. Veriler bu şiddetlerinde birinde geliştirmek ama eğer, yine de tatmin edici olmadığını yoğunluğu çevresindeki artışlarla yeniden tarayın.
    2. Yazılım kuyularda beyaz lekeler gösteren görüntüleri analiz için dikkatli olun, bu noktalar görüntüleyici aralığının dışında doymuş sinyali anlamına gelir. Bu durumda daha düşük bir yoğunlukta tarayın.
    3. Doğrusallık elde değilse, büyümek ya da bir gecede farklı sütunlarda dengesiz ölebilir çünkü kaplama 6 saat içinde hücreleri düzeltmek için de deneyin. Aynı zamanda farklı kaplama yoğunlukları, farklı tarama yoğunlukları, reaktif seyreltme faktörler, cam tabanlı plakalar, bir çekirdek yalnızca leke olarak kendi DRAQ5, ya da anti-α-tübülin ya da anti-MAP2 dışında farklı antikorların daha iyi duruma deneyin.

Sonuçlar

Bu deneylerde oran sınırlayıcı bir faktör ATP deney süresi nispeten kısa olduğu için, kızılötesi boyama olduğunu. Kızılötesi tahlilleri için, sekiz 96-yuvalı plakalar (bkz. Şekil 1) dört plakaların her biri iki seri tarafından şaşırtıcı bir gün içinde, lekeli ve taranabilir tahmin ediyoruz. Bu tahmin, tespit bölgesinin 20 dakika varsayar, yıkama 30 dakika, yıkama 30 dakika, ardından 2 saat primer antikor inkübasyon bloke 30 dakika, yıkama 30 dakika süre ile 1 saat kul...

Tartışmalar

Tüm üç canlılığı deneylerde sinyal gücü, doğrusal ve kaplama yoğunluğu ile ilişkili olduğunu bulmuşlardır. Ancak, tüm deneyler, 2-kat veya kaplama yoğunluğu 1.5 kat değişikliklere karşı eşit ölçüde hassastır. N2a hücreleri için, kızılötesi deneyler özellikle düşük kaplama yoğunluklarında, ATP deneyi daha az duyarlıdır. Kızılötesi deneyler ATP daha az duyarlı olan, ancak DRAQ5 + Safir deneyler ve α-tubulin deneyleri ki bunlar, N-asetil sistein ve yüksek ölçüde koruyucu bi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Titer Glo	Promega	G7572	Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin	Thermo-Shandon	9990244	Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block	LI-COR	927-40003	This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	21568	We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher	S468	One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher	S373	See above
Sodium Azide (250x)	Ricca Chemical Company	7144.8-16	Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin	Sigma-Aldrich	T5168	This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M9942	This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-32210	Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5	Biostatus	DR50200	This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire	LI-COR	928-40022
Luminometer	PerkinElmer	VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager	LI-COR	9201-01
Shaker/Mixer	Research Products International	248555