Les analyses de viabilité de cellules en culture

Résumé

Les composés thérapeutiques sont souvent d'abord examiné in vitro par des tests de viabilité. Le nombre de cellules aveugles par un observateur humain peuvent être très sensibles à de faibles variations du nombre de cellules mais ne pas évaluer la fonction. Essais de viabilité informatiques, tel que décrit ici, peuvent évaluer à la fois la structure et la fonction d'une manière objective.

Résumé

Le nombre de cellules manuelles sur un microscope sont des moyens sensibles à l'évaluation de la viabilité cellulaire, mais prennent du temps et par conséquent coûteux. Essais de viabilité informatiques sont coûteux en termes d'équipement, mais peut être plus rapide et plus objective que les comptages manuels cellulaires. Le présent rapport décrit l'utilisation de ces trois essais de viabilité. Deux de ces dosages sont l'infrarouge et l'autre est luminescent. Les deux tests infrarouges reposent sur un imageur 16 bits Odyssey. Une analyse infrarouge utilise la tache de DRAQ5 pour les noyaux combinés avec la tache de Sapphire pour cytosol et est visualisé dans le canal 700 nm. L'autre test infrarouge, un In-Cell occidentale, utilise des anticorps contre les protéines du cytosquelette (α-tubuline ou microtubules protéines associées 2) et les étiquettes dans le canal 800 nm. Le troisième test de viabilité est un dosage luminescent couramment utilisé pour l'ATP, mais nous utilisons un quart de la quantité recommandée pour économiser sur les coûts. Ces mesures sont toutes linéaires et sont en corrélation avec le nombre de CElls plaqué, mais varient en sensibilité. Tous les trois essais contourner microscopie temps et déguster l'ensemble bien, ce qui réduit l'erreur d'échantillonnage. Enfin, tous les tests peuvent facilement être achevée dans un délai d'une journée de la fin de l'expérience, ce qui permet un plus grand nombre d'expériences à réaliser dans des délais courts. Cependant, elles reposent toutes sur l'hypothèse que le nombre de cellules restent en proportion de la force du signal après les traitements, une hypothèse qui est parfois pas satisfaite, en particulier pour l'ATP cellulaire. En outre, si les cellules augmentent ou diminuent en taille après le traitement, cela pourrait affecter la force du signal sans affecter le nombre de cellules. Nous concluons que tous les tests de viabilité, y compris les comptages manuels, souffrent d'un certain nombre de réserves, mais que les essais de viabilité informatisés valent bien l'investissement initial. En utilisant les trois dosages donne ainsi une vue d'ensemble de la structure et de la fonction cellulaire.

Introduction

Le test de viabilité la plus courante dans les sciences biologiques implique nombre de cellules. Ceci est démontré par une analyse des meilleurs (les plus récents) de 200 publications parues dans PubMed avec l'un des mots-clés «in vitro» ou «culture» sur 29/04/2013 et 30/04/2013. Parmi ces publications, 23,5% utilisés essais de comptage de cellules, y compris les manuels nombre de cellules chiffres, le nombre de cellules automatisé compte avec un logiciel d'imagerie, et exclusion au bleu Trypan. Le dosage Vivant / Mort a été utilisé dans 1% de ces publications. Le nombre de publications utilisant le MTT (3 - (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényl) test pour la viabilité métabolique était de 11%. Cette revue de la littérature montre également que le nombre de publications en utilisant des tests tels que MTT en conjonction avec les tests de comptage cellulaire n'était que de 3,5%. Malgré la tendance à utiliser un test de viabilité par lui-même, l'évaluation de la fonction cellulaire en combinaison avec le nombre de cellules semble le meilleur choix pour l'évaluation i cellulaireNtegrity. Les comptages cellulaires par eux-mêmes ne sont pas suffisants parce que les cellules restantes ne peuvent pas être fonctionnel ou en bonne santé, même si elles sont présentes dans le puits ^{de 1,2.} A l'inverse, les mesures fonctionnelles telles que l'ATP peut augmenter ou diminuer en l'absence de changements parallèles dans le nombre de cellules. Le découplage de lectures métaboliques du nombre de cellules suggère que l'ATP et MTT essais ne doivent jamais être utilisés comme seul test de viabilité. Dans le présent rapport, trois essais de viabilité, qui sondent les structures cellulaires et la fonction métabolique sont décrits, pour une vision plus globale de l'intégrité cellulaire que n'importe quel test en lui-même ne peut se permettre.

Deux de nos tests nécessitent un imageur infrarouge qui mesure la fluorescence dans les canaux 700 et 800 nm. Le bruit est faible dans les longueurs d'onde infrarouges, entraînant une hausse des signal-bruit ratios ^3. L'imageur de l'Odyssée que nous utilisons a une gamme dynamique de 4,5 log et une profondeur de bits de 16, Translating à 2 ¹⁶ ou 65 536 nuances de l'infrarouge. Cela peut être comparé à l'imagerie de couleur 8 bits, qui ne donne 2 ⁸ ou 256 nuances de couleur pour chaque longueur d'onde. Ainsi, l'imagerie 16 bits a une résolution plus fine. Il convient de noter que les images infrarouges d'origine sont souvent pseudocolored vert (800 nm) et le rouge (700 nm) dans des rapports publiés pour la présentation. imageurs Odyssey sont couramment utilisés à la fois pour Western blot et In-Cell Westerns ^4-7. In-Cell Westerns sur les cellules fixées au formaldehyde utilisent des anticorps primaires contre toute protéine d'intérêt et de les étiqueter à son tour avec des anticorps secondaires fluorescents infrarouges. Cette technique est connue pour être particulièrement utile pour les points d'extrémité de phosphorylation ^6. Dans notre In-Cell Westerns, nous colorer les cellules fixes de protéines du cytosquelette α-tubuline ou aux microtubules neuronaux de la protéine associée à 2 (MAP2) dans le canal de 800 nm. Ces protéines sont assez abondantes pour donner rapports signal sur bruit. Nous tachons également nos assiettes dans le 700canal nm pour les noyaux avec la tache de DRAQ5 et pour le cytoplasme avec la tache de Sapphire. Tant les protéines du cytosquelette et les DRAQ5 + taches Sapphire reflètent donc des structures cellulaires.

Le troisième test de viabilité de mesurer la fonction métabolique et est appelé "Cell Titer Glo." Pour ce dosage à base de luciférase-, valeurs de luminescence sont en proportion directe avec les taux d'ATP. Essais ATP sont couramment utilisés pour quantifier les cellules viables ^8-12. Cependant, y compris le mot «titre» dans le nom de l'analyse est un peu un abus de langage car la production d'ATP par cellule peut changer en fonction des traitements de toxine et n'est donc pas toujours en proportion du nombre de cellules ^8. Les niveaux d'ATP peuvent également être affectés par les rythmes circadiens ¹³ et par la division cellulaire ¹⁴ et la différenciation des cellules ^15. Néanmoins, le dosage de l'ATP montré ici est simple à réaliser et utile car l'ATP est une mesure robuste métaboliqueviabilité ^16-21, sinon la cellule numéro en soi. L'utilisation de ce test pour compléter l'infrarouge In-Cell Westerns cède donc une image plus complète de l'intégrité cellulaire que tout un test seul.

Protocole

Un schéma des protocoles est illustré sur la figure 1.

Une. Cellule de placage

Cellules de la plaque dans des plaques à 96 puits à des densités différentes de placage (Figure 2). Pour les contrôles de linéarité sur la ligne N2a de cellules de neuroblastome, plaque 2.5k, 5k, 10k, 15k et cellules par puits dans 3 ou 6 puits / groupe. Pour les contrôles de linéarité dans les neurones corticaux de rat primaires, plaque 25k, 50k, 100k, 200k et cellules par puits dans 3 ou 6 puits / groupe. Si les lignées cellulaires ou des cellules primaires d'intérêt semblent en bonne santé à différentes densités de placage, et autour de la plaque à la densité cellulaire optimale pour ce type de cellule.

Remarque: Dans la présente étude, les cellules ont été étalées dans N2a 100 pi médias et les neurones corticaux primaires de 200 médias pi sur des plaques qui sont conçus pour une évaporation plus faible. Pour plus d'informations sur la manipulation des cellules, des médias, des sérums, des antibiotiques et des traitements de toxine, s'il vous plaît voir Unnithan et al. pour N2a cells ⁸ et Posimo et al. pour les cultures de cortex ²² primaires.

1. 1. Répéter le placage sur une seconde plaque à 96 puits. Une plaque sera analysé pour déterminer l'ATP (Figure 2A) et l'autre avec les analyses infrarouges (Figure 2B). On ne peut pas utiliser la même plaque pour l'ATP et analyses infrarouge parce que les cellules doivent être lysées ouverte pour les mesures ATP intracellulaires.
   2. Assurez-vous de la plaque au moins 3 puits supplémentaires pour soustraction de fond dans les essais infrarouges à la densité de placage optimal (colonne 2; figure 2B).
2. Ajouter un média sans cellules ou plus, à peu de frais, de l'eau stérile pour les puits extérieurs dans les lignes A et H et dans les colonnes 1 et 12. Éviter de s'appuyer sur des données provenant de puits le long des bords, que la viabilité est souvent plus faible ici des effets de l'évaporation des médias et des gradients de température. Ces problèmes de microplaques sont communément appelés des effets de bord ^23,24. Ne pas garder ces puits videcar alors les lignes B et G et les colonnes 2 et 11 souffrent de l'effet de bord.
   Des effets de bord peuvent être réduits par l'incubation d'une plaque fraîchement ensemencée à la température ambiante dans les conditions ambiantes avant d'être transférés dans l'incubateur à CO ₂ ^24. En outre, une étude récente de Carralot décrit une méthode de correction mathématique pour microplaques en utilisant une colonne de contrôle unique ^23. Oliver et ses collègues ont utilisé une force microtitration d'air plaque incubateur spécialement conçu pour réduire les gradients thermiques ^25. Si l'effet de bord est une préoccupation importante, chambres de stabilité de microplaques (par exemple BT & C Incorporated) peuvent être achetés pour créer un micro-environnement homogène avec une humidité élevée et même des gradients de température.
3. Si plusieurs puits que montré à la figure 1 sont nécessaires parce dilution des réactifs supplémentaires ou plus de la densité de placage seront testés, utiliser les puits de pointe pour soustraction de fond.
4. Attendez le lendemain pour la fixationdosage des cellules et le lendemain matin comme décrit ci-dessous.

2. Luminescent ATP Assay

1. Suivez les recommandations de la Cellule Titer Glo fabricant pour la reconstitution du substrat avec un tampon et pour des temps d'incubation.
   1. Retirer 50 ou 150 médias pi de 100 ou 200 pi de milieu de placage, respectivement. Un peu moins de 50 pl restent derrière dans le puits. Ajouter 25 ul de substrat des réactifs (tampon) ainsi que pour les colonnes 2-6 (figure 2A) à une dilution de 1:02.
      Remarque: les volumes variables de médias laissés après le retrait pourrait diluer ou concentrer les réactifs de dosage de l'ATP différentielle entre les puits. Veillez à ce que le niveau de liquide dans tous les embouts de pipette multicanaux est équivalent. Mesurer le liquide restant dans les puits sélectionnés à travers la plaque avec une pipette immédiatement avant l'addition des réactifs de dosage de l'ATP pour assurer la précision. Si la grande variabilité existe de taux différentiels de EVAPOR des médiastion à travers la surface de la plaque, supprimer tous les anciens supports et ajouter le même volume de milieu frais ou de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à tous les puits immédiatement avant l'addition de réactifs de dosage de l'ATP. Si les plaques souffrent de niveaux variables de l'évaporation, essayez de passer à des plaques de faible évaporation de Costar Corning. Dans les dernières plaques, les 60 puits intérieur de la figure 2 ne souffrent d'une moyenne de 0,995% ± 0,41 médias évaporation pendant la nuit. Il est donc variabilité négligeable du volume des médias au moment de l'analyse.
   2. Dans les colonnes 7 à 11, les lignes B à D, retirer suffisamment de médias à laisser 50 pi derrière, comme détaillé ci-dessus, et ajouter 50 ul de réactifs à une dilution 1:1.
   3. Dans les colonnes 7 à 11, les lignes E à G, laisser les cellules dans 100 ul de milieu et ajouter 100 ul de réactifs, de nouveau à une dilution 1:1. La société recommande à 100 pi de réactifs doivent être dilués 1:1 dans 100 ul de milieu.
      Remarque: Pourà économiser sur les coûts, il est possible de réduire ces recommandations à la fois en volume et en dilution. Cependant, avant de le faire, en sorte que cela ne réduit pas la linéarité et la sensibilité de l'essai.
   4. Une fois un volume spécifique et le facteur de dilution des réactifs sont jugées satisfaisantes, rester avec eux dans toutes les expériences ultérieures. Les critères de données satisfaisantes sont décrits dans la section Résultats.
   5. Réactifs reconstitués non utilisés peuvent être congelés à nouveau et utilisés à une date ultérieure à économiser sur les coûts. Selon le fabricant, des réactifs reconstitués peuvent être conservés à -20 ° C pendant 21 semaines, avec une perte d'activité ~ 3%.
2. Placer la plaque sur un agitateur orbital pendant 2 min ou un agitateur oscillant pendant 10 min. Si une partie de la plaque est en cours d'analyse pour une mesure différente et il ne peut pas être ébranlée, agiter les médias avec une simple pipetage de haut en bas que dans les puits d'intérêt. Cependant, des bulles excessives générées au cours de cette étape d'interférer avec lumiNESCent sortie.
   1. 10 min après l'addition des réactifs, transférer 60 pi de contenu des puits dans des plaques à 96 puits blanches. valeurs de luminescence sont plus élevés en plaques blanches que dans les plaques claires ou noires, car ils reflètent la lumière vers le haut vers le détecteur.
      Remarque: Dans notre expérience, les cellules survivent mieux sur la faible évaporation, plaques Costar clairs que les autres plaques. Ces plaques spécifiques ne sont pas vendus avec des murs blancs. Ensuite, les plaques à parois opaques et clairs à fond sont plus chers que les plaques complètement claires. Si on transfère le liquide luminescent à plaques blanches, les plaques blanches peuvent être lavés et réutilisés, économiser sur le coût de l'utilisation de nouvelles plaques blanches pour chaque expérience. Transfert de liquide est donc l'option la moins chère sur le long terme.
   2. Pop les bulles d'air avant la lecture de la plaque avec une aiguille ou, de préférence, avec de l'air forcé à partir d'une ampoule de transfert de pipette en plastique. Lire la plaque sur un luminomètre avec un temps d'intégration de 1 s (la société de recommends 0,25-1 s temps d'intégration suffisante). Lire la plaque 10-12 minutes après l'addition de réactifs de dosage de l'ATP. Le moment est crucial pour la comparaison entre les différentes plaques, parce que le signal luminescent est transitoire avec un taux de décroissance rapide, comme le montre par Gilbert et ses collègues ^26.
3. Faire la moyenne des valeurs de luminescence à partir des trois ou six puits dans chaque groupe et tracé en fonction du nombre de cellules dans un diagramme de dispersion (voir figure 3). Première soustraire fond valeurs moyennes de luminescence des puits vides appropriées (puits 2B - 2G, puits 11B - 11D, 11E et puits - 11G) de chaque point de données correspondant. Il y aura trois groupes différents pour chaque densité de placage dans cette expérience initiale (figure 2A). Les niveaux d'ATP peuvent être corrélées de façon linéaire avec des densités de cellules dans une ou plusieurs de ces groupes. Procéder à la plus forte dilution des réactifs qui donne toujours des résultats satisfaisants pour économiser sur les coûts. Critères de résultats satisfaisants sont décrits in la section Résultats.
   Remarque: Avec les médias utilisés dans la présente étude, les valeurs de fond avec ce dosage ne sont pas élevés, et il est possible de sauter les puits vierges. Toutefois, le fabricant Promega signale les différences de luminescence avec différents milieux de culture. La présente étude utilise Hyclone fœtale Clone III, une version synthétique de sérum de veau fœtal pour les cellules N2a et sérum de veau pour les cultures corticales primaires. Selon le fabricant, le sérum de veau diminue les valeurs de luminescence mais ne diminue pas la sensibilité du dosage. Néanmoins, si cela est une préoccupation importante, diluer ATP réactifs de dosage dans du PBS à la place des médias au moment de l'analyse.
   1. Si les cellules semblent se développer de manière inégale dans les colonnes nuit, essayez de les doser dans les 6 h de placage. Cependant, gardez à l'esprit que la densité à l'heure habituelle de test (par exemple, 24 heures après le traitement) est la densité à laquelle la linéarité doit être atteint.

3. Infrared dosages

1. Le matin après le placage, fixer les cellules dans la deuxième plaque à la température ambiante dans une hotte de laboratoire. Assurez-vous de porter des gants pour cette étape et disposer du fixateur comme un déchet chimique car le formaldéhyde est cancérogène. Ajouter 4% de formaldéhyde et de 4% de saccharose dans du tampon phosphate 0,1 M pour le support existant à une dilution de 1:01. Les médias peuvent aussi être lavés avec du PBS avant de fixer en pleine force fixateur. Soit technique fonctionne bien.
   1. Incuber dans un fixateur pendant 20 min, puis retirez le fixateur et laver 3x dans 200 pi de PBS.
2. Conservez la plaque dans du PBS avec de l'azoture de sodium à 0,2% à 4 ° C si le test n'aura pas lieu le même jour. Sinon, procéder à l'essai et placer les cellules dans une solution de blocage pour minimiser la liaison non spécifique d'anticorps.
   1. Diluer le sérum Odyssey bloc 1h01 de poisson dans du PBS et ajouter 0,3% de Triton-X 100 comme perméabilisant cellulaire. Faites suffisamment de solution de blocage ainsi que Antibo primaire et secondairesolutions dy de sorte que 35 pi peuvent être déposés à la pipette dans chaque puits. Cependant, si beaucoup de bulles sont observées pendant le pipetage, faire> 50 pi pour chaque bien, sinon les bulles atteignent le bas dans les cellules et d'anticorps de blocs de liaison. Bulles de savon excessifs apparaissent comme une tache tache circulaire au milieu du puits. Essayez de régler le pipetage si cela se produit.
   2. Incuber dans cette solution de blocage pendant 30 à 60 min à température ambiante.
      Note: 5% d'albumine de sérum bovin ou du sérum normal à partir de la même espèce que l'anticorps secondaire peuvent également être utilisés en tant que solutions de blocage pour économiser sur le coût du bloc de sérum de poisson. Blocage des solutions peut affecter les performances de l'anticorps. Ainsi, le bloc optimale pour chaque anticorps est le mieux déterminée de manière empirique.
      Remarque: Certains chercheurs mettent In-Cell plaques occidentaux sur secoueurs pendant les incubations. Cependant, cela n'est pas nécessaire.
3. Faites les anticorps primaires: 1:10.000 dilution pour l'anti-α-tubuline(Anticorps monoclonal de souris, tableau 1) et 1:2000 dilution pour l'anti-MAP2 (anticorps monoclonal de souris, tableau 1). Ces anticorps sont spécifiques aux protéines d'intérêt dans ces modèles cellulaires; spécificité est essentiel pour toute tache immunocytochimique.
   Remarque: MAP2 est un marqueur de neurones et est approprié pour des cultures de neurones / cellules gliales mixtes. Les cultures postnatales présentés ici contiennent également des cellules gliales (~ 25%), parce que les astrocytes apparaissent d'abord le jour embryonnaire 18, avec leurs numéros pic dans la période néonatale précoce ^27,28. On ne peut pas faire la distinction entre les astrocytes et les neurones de l'ATP et DRAQ5 + Sapphire essais. Afin de mesurer les neurones et les astrocytes séparément, utiliser MAP2 simultanée et GFAP coloration dans les canaux nm 800 et 700, comme décrit par Mullett et collègues ^4,29, en laissant de DRAQ5 + Sapphire. Toutefois, si toutes les cellules de la culture souhaitent être évalués, utiliser un marqueur pan-cellulaire tel que α-tubuline, β-actine, ou GAPDH.
   Remarque: Ces dilutions ont été optimisés pour l'N2a et cellules corticales primaires et peuvent ne pas généraliser à tous les modèles. Par conséquent, essayez au moins deux dilutions d'anticorps primaires, l'un sur la partie gauche de la plaque et l'autre sur la moitié droite (voir figure 2B). Sinon, essayez 3-4 dilutions d'anticorps primaires sur 3 puits chacune. Par exemple, la dilution recommandée sur la feuille d'insertion d'anticorps peut être flanqué par des modifications de deux ordres. En d'autres termes, si la dilution recommandée pour immunocytochimie est 1:500, 1:250 et aussi essayer de 1:1000 facteurs de dilution.
   1. Diluer anticorps 01:01 bloc Odyssée: PBS et ajouter 0,3% de Triton-X. Pour économiser sur le coût, essayer la préparation des anticorps dans la solution de blocage qui a été appliquée aux cellules à l'étape 3.2.1 en retirant de cette solution à la fin de l'incubation. Maintenir les cellules dans du PBS pendant cette, ils ne doivent pas se dessécher.
   2. Incuber des anticorps primaires soit 1-2 heures à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C. Pour faiblement brouver anticorps et de protéines qui ne sont pas abondantes, les incubations d'une nuit peuvent aider à augmenter le signal.
      Remarque: Laissez au moins 3 puits dans une solution de blocage pour soustraction de fond à chaque concentration d'anticorps secondaire (puits 2B-2D et 2E puits-2G à la figure 2B). Ne pas exposer ces puits à tout anticorps primaire que ce soit. Ils révèlent la mesure de la liaison non spécifique par l'anticorps secondaire, et sont utiles pour le calcul de rapports signal sur bruit. Si il est à craindre que les anticorps secondaires mèneront à des niveaux élevés de la liaison non spécifique, incluent également des puits de contrôle qui ne sont pas exposés à des anticorps primaire ou secondaire, mais reçoivent le même nombre de lavages. La différence entre ces puits et les puits "secondaire" ne révélera l'étendue de la liaison non spécifique causée par l'anticorps secondaire seul. Dans notre essai sur des cellules de souris N2a, l'intensité du signal avec un anticorps secondaire anti-souris seul était de 0,032 ± 0,557, un signal avec un anticorps anti-lapinanticorps secondaire seul était de 0,533 ± 0,041, le signal sans anticorps secondaire a été de 0,357 ± 0,003, et le signal avec des anticorps primaires et secondaires était 11,867 ± 0,911. Nous avons donc pas observé des niveaux élevés de liaison non spécifique, même en utilisant des anticorps secondaires anti-souris sur des cellules de souris. Il ya plusieurs fabricant des anticorps secondaires infrarouge, nous recommandons que l'achat de ceux qui sont très contre-adsorbées. A noter que la concentration en anticorps IgG secondaire peut varier en fonction de la source.
4. Laver les anticorps primaires avec 3 lavages de 200 pi de PBS par puits, 10 min chacun. Les anticorps primaires peuvent être sauvegardés à 4 ° C pendant quelques semaines dans l'azoture de sodium à 0,2% et réutilisés jusqu'à de minuscules taches de débris deviennent apparents lorsque les solutions sont retenus à la lumière. Ceci est fait uniquement pour économiser sur les coûts. Si le coût n'est pas un problème, des anticorps frais pour chaque utilisation.
5. Diluer l'anticorps secondaire par 1:1000 ou 1:2000 à 1:01 bloc Odyssée: PBS avec 0,3% Tritonne-X (Figure 2B). Ajouter une dilution de 1:1000 à la moitié supérieure de la plaque et 1:2000 à la moitié inférieure de la plaque. Ces concentrations pourraient être encore réduits à économiser sur les coûts, mais vérifier la linéarité avant de s'engager à ce.
   Note: Soyez sûr d'ajouter la solution appropriée d'anticorps secondaire dans les puits de soustraction de fond (colonne 2 de la figure 2B).
   1. Si une seconde protéine est dosée en place de DRAQ5 + saphir, les cellules de l'étiquette pour α-tubuline ou MAP2 avec 700 nm de chèvre anti-IgG de souris et de la seconde protéine dans le canal 800 nm avec des anticorps primaires provenant d'une espèce autre que la souris. Le canal de 800 nm a moins de fond que le canal 700 nm et devrait être réservé pour la protéine la plus critique d'intérêt.
   2. Incuber des anticorps secondaires pendant 1 heure à température ambiante dans un tiroir de la lumière.
6. Laver Anticorps secondaires avec 3 lavages de 200 pi de PBS par puits, 10 min chacun.
7. Faites les solutions DRAQ5 + Sapphire. Pour la moitié gauche de la plaque, diluer DRAQ5 1:10.000 (0,5 uM de concentration finale) et de saphir 1:1000 dans du PBS avec 0,3% de Triton-X (colonnes 3-6; Figure 2B). Pour la moitié droite de la plaque, diluer DRAQ5 1:20,000 (0,25 M) et Sapphire 1:2000 (colonnes 7-10; figure 2B).
   Remarque: DRAQ5 utilisé pour être vendu à un stock 1 mM au lieu d'un stock 5 mM. Certains rapports publiés précédemment utilisés donc 1:4000 ou 1:2000 dilutions de DRAQ5 ^8.
   1. Pour économiser sur le coût, si les deux plaques sont dosés simultanément, le même DRAQ5 + solutions de saphir peuvent être utilisés sur les deux plaques qui se suivent, il pipetage large de la première plaque et de l'ajouter à la seconde. Si les mêmes solutions seront utilisées deux fois de cette manière, les utiliser en moins d'une journée. Solutions DRAQ5 dilué + Sapphire ne peuvent pas être enregistrés à 4 ° C ou congelés pour une utilisation ultérieure.
   2. Incuber dans ces solutions pendant 30 min à température ambiante à l'abri from lumière. Si le temps est court et les solutions + Sapphire de DRAQ5 ne sera pas réutilisé sur d'autres plaques avec différentes secondaires, ajouter ces taches pour les solutions d'anticorps secondaires dans l'étape 3.5 et incuber pendant 1 heure.
      Remarque: Ne pas ajouter DRAQ5 + solution Sapphire pour les puits de soustraction de fond (colonne 2 de la figure 2B) que ces puits ne doivent pas être colorés dans le canal 700 nm.
8. Laver les plaque 3x avec 200 ul de PBS par puits pendant 10 min chacun. Mettez de l'azoture de sodium à 0,2% dans le dernier lavage PBS si la plaque va être teinté avec d'autres anticorps secondaires visibles portée après l'imagerie infrarouge est complète.
9. Balayez la plaque sur un imageur Odyssey. Commencez par balayer les plaques à l'intensité 5 et 169 mm de résolution. Soit «qualité moyenne» ou «faible réglages de qualité" sont suffisantes. La société ne communique pas les informations de filtre d'excitation / d'émission détaillées. Cependant, les filtres d'émission est d'environ 20 nm de large et sont centrées autour de sept20 et 820 nm, selon le fabricant.
   Note: Il est possible de numériser des plaques encore humide que les enquêteurs peuvent souhaiter continuer à les colorer avec d'autres marqueurs. Toutefois, la société indique dans son protocole en ligne que les plaques sèches entraînent moins de signal à étalement de puits à puits. Si vous analysez les deux humide et sec pour comparer les données, assurez-vous d'enlever toute la PBS du bien parce que les sels restants après évaporation peuvent conduire à fond haute fluorescence le long des bords.
   1. L'Odyssey Imager numériser jusqu'à et à travers le fond de la plaque. Plaques de différents fabricants peuvent exiger différents décalages de discussion parce que le fond des puits peut varier dans leur épaisseur et de la profondeur de la plaque. Essayez balayage à différents décalages de discussion et de voir où le ratio le plus élevé signal-bruit et la plus nette (plus au point) signal est atteint: 2,5 mm, 3,0 mm, 3,5 mm, 4,0 mm. Essayez aussi de mesurer la profondeur du puits à partir de la partie inférieure d'une plaque avec une règle pour confirmer la findings sur l'Odyssée. Rappelons que la matière plastique dans le fond du puits peut ajouter de la hauteur supplémentaire pour les mesures à la règle. Les plaques Costar utilisées dans la présente étude exigent un décalage de 4,0 mm mise au point.
   2. Utilisez la fonction de l'Ouest In-Cell dans le logiciel pour placer la grille de la bonne taille sur l'image de la plaque et d'exporter les données dans Microsoft Excel. Examiner les "intégrés" intensité valeurs des mêmes puits à travers différents décalages de discussion pour trouver les valeurs de fluorescence les plus élevés. Le décalage de focalisation qui donne le ratio le plus élevé signal-bruit (signal puits immunocolorées contre "aucun contrôle négatif primaires" puits) est celui de choisir par la suite.
   3. Une fois compenser un foyer est décidée, numériser à nouveau par petits incréments. Par exemple, si le signal lumineux était de 3,5 et 4,0 mm, essayez de numériser à 3,6, 3,7, 3,8, et 3,9 mm et de voir s'il ya une amélioration dans la force du signal. Si le décalage de focalisation est erroné, l'intensité des signaux à travers les 12 colonnes sur un pl videmangé (quand toutes les colonnes doivent avoir signal égal) apparaît comme une courbe en forme de U à la place d'une ligne plate. Si cela continue d'être un problème avec des plaques en plastique, essayez plaques de verre à fond.
10. Soustraire la moyenne des intensités intégrées dans le fond soustraction puits (figure 2B; puits 2B - 2D ou 2E puits - 2G) de chaque point de données correspondant dans les canaux 700 et 800 nm. Puis faire la moyenne des intensités de signal intégrés de chaque groupe de puits. Tracer les données sous forme de nuage de points contre la densité cellulaire (voir figure 3).
    1. Comparer les résultats des deux dilutions différentes d'anticorps primaires et secondaires ainsi que les résultats des deux dilutions différentes de DRAQ5 + saphir de s'installer sur une dilution de chacun des expériences ultérieures. Si la linéarité n'est pas atteint, essayez de numériser à une intensité différente. Rescan avec des intensités 3 et 7 au lieu de 5 et réanalyser les données. Si les données à améliorer un de ces intensités maisne sont toujours pas satisfaisants, réanalyser par incréments autour de cette intensité.
    2. Veillez à ne pas analyser les images où le logiciel montre des taches blanches dans les puits; ces taches signifient le signal saturé hors de la portée de l'imageur. Numérisez à une intensité plus faible si cela se produit.
    3. Si la linéarité n'est pas atteint, essayez aussi de fixer les cellules dans les 6 h de placage, car ils pourraient se développer ou de mourir de façon inégale dans les différentes colonnes nuit. Essayez également de différentes densités de placage, différentes intensités de numérisation, d'autres optimisations de facteurs réactifs de dilution, des plaques de verre à fond, DRAQ5 par elle-même comme une tache de noyau uniquement, ou différents anticorps autres que anti-α-tubuline ou anti-MAP2.

Résultats

Le facteur limitant la vitesse dans ces expériences est la coloration de l'infrarouge, comme le dosage de l'ATP est relativement courte en durée. Pour les tests infrarouges, nous prévoyons que huit plaques à 96 puits peuvent être colorés et analysés dans un jour par échelonnement deux lots de quatre assiettes maximum (voir la figure 1). Cette estimation suppose 20 min de fixation, 30 min de lavage, 30 min de blocage, 2 h primaire incubation d'anticorps puis 30 min de lavages, 1 heure...

Discussion

Nous avons trouvé que la puissance du signal dans les trois essais de viabilité est linéaire et en corrélation avec la densité de placage. Cependant, tous les tests sont également sensibles à 2 fois ou 1,5 fois les changements dans la densité de placage. Pour les cellules N2a, les analyses infrarouges sont moins sensibles que le dosage de l'ATP, en particulier à des densités de plaquage inférieure. Bien que les analyses infrarouges sont moins sensibles que l'ATP, les DRAQ5 + Sapphire tests et les essa...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Titer Glo	Promega	G7572	Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin	Thermo-Shandon	9990244	Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block	LI-COR	927-40003	This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	21568	We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher	S468	One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher	S373	See above
Sodium Azide (250x)	Ricca Chemical Company	7144.8-16	Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin	Sigma-Aldrich	T5168	This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M9942	This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-32210	Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5	Biostatus	DR50200	This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire	LI-COR	928-40022
Luminometer	PerkinElmer	VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager	LI-COR	9201-01
Shaker/Mixer	Research Products International	248555