Die Lebensfähigkeit Assays für Zellen in Kultur

Zusammenfassung

Therapeutische Verbindungen werden oft zunächst in vitro-Lebensfähigkeitstests untersucht. Blindzellzählungen durch einen menschlichen Betrachter sehr empfindlich auf kleine Änderungen in der Zellzahl, aber nicht beurteilen Funktion. Computergestützte Lebensfähigkeitstests, wie hier beschrieben, kann sowohl die Struktur und Funktion in einer objektiven Weise zu beurteilen.

Zusammenfassung

Manuelle Zellzahlen auf einem Mikroskop sind ein empfindliches Mittel zur Bewertung zelluläre Lebensfähigkeit aber zeitaufwendig und daher teuer. Computergestützte Lebensfähigkeitstests sind teuer in Bezug auf Ausrüstung, aber schneller und objektiver als die manuelle Zellzahlen sein. Der vorliegende Bericht beschreibt die Verwendung von drei solcher Lebensfähigkeitstests. Zwei dieser Assays sind Infrarot und einem lumineszierend. Beide Infrarot-Assays basieren auf einer 16-Bit-Odyssey Imager. Eine Infrarot-Assay verwendet den Farbstoff für DRAQ5 Kernen kombiniert mit dem Saphir-Färbung für Cytosol und in den Kanal 700 nm sichtbar gemacht. Die andere Infrarot-Assay, ein In-Cell Western nutzt Antikörper gegen Proteine ​​des Zytoskeletts (α-Tubulin-oder Mikrotubuli-assoziierten Protein 2) und kennzeichnet sie in der 800 nm-Kanal. Die dritte Lebensfähigkeitstest ist eine häufig verwendete Leucht Assay für ATP, aber wir verwenden ein Viertel der empfohlenen Volumens um Kosten zu sparen. Diese Messungen sind lineare und korrelieren mit der Anzahl von cells zogen, aber unterschiedlich in der Empfindlichkeit. Alle drei Tests zu umgehen zeitraub Mikroskopie und probieren Sie die gesamte Wohl, wodurch Stichprobenfehler zu reduzieren. Schließlich können alle Assays leicht innerhalb eines Tages nach dem Ende des Experiments durchgeführt werden, so dass eine größere Anzahl von Versuchen, um in kurzen Zeiträumen durchgeführt werden. Sie beruhen jedoch alle auf der Annahme, dass die Zellzahlen im Verhältnis zur Stärke Signal nach Behandlungen, eine Annahme, die manchmal nicht erfüllt, insbesondere für zelluläre ATP bleiben. Außerdem, wenn Zellen zu erhöhen oder zu verringern in der Größe nach der Behandlung, könnte dies die Signalstärke beeinflussen, ohne die Zellzahl. Wir schließen daraus, dass alle Lebensfähigkeitstests, einschließlich Handbuch zählt, leiden unter einer Reihe von Vorbehalten, aber, dass computergestützte Lebensfähigkeitstests sind auch die anfängliche Investition wert. Mit allen drei Assays zusammen ergibt sich ein umfassendes Bild der zellulären Struktur und Funktion.

Einleitung

Die häufigste Lebensfähigkeitstest in den biologischen Wissenschaften beinhaltet Zellzahlen. Dies wird durch eine Analyse der Top (jüngste) 200 Publikationen, die in PubMed mit einem der Schlüsselwörter "in vitro" oder "Kultur" auf 2013.04.29 und 2013.04.30 erschien belegt. Von diesen Publikationen, 23,5% verwendeten Zellzahl-Assays, einschließlich der manuellen Zellzahl zählt, zählt die automatisierte Zellzahl mit Imaging-Software, und Trypanblau-Ausschluss. Die Live / Dead-Assay wurde in 1% dieser Publikationen verwendet. Die Anzahl von Publikationen mit dem MTT (3 - (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-Assay für metabolische Lebensfähigkeit betrug 11%. Dieser Überblick über die Literatur zeigt auch, dass die Anzahl von Publikationen mit dem MTT-Assays, wie in Verbindung mit der Zellzahl Assays war nur 3,5%. Trotz der Trend zu einer Lebensfähigkeitstest für sich zu nutzen, die Beurteilung zelluläre Funktion in Kombination mit der Zellzahl scheint die beste Wahl für die Beurteilung der Zell integrity. Zellzahlen allein nicht ausreichend, da die verbleibenden Zellen nicht funktionell oder gesund, obwohl sie in der gut ^1,2 vorhanden sind. Umgekehrt kann die funktionelle Maßnahmen wie ATP erhöhen oder verringern in Abwesenheit von parallelen Veränderungen in der Anzahl der Zellen. Die Entkopplung von Stoffwechselanzeigen von Zellzahl zeigt, dass ATP und MTT-Assays sollten niemals als alleinige Lebensfähigkeitstest verwendet werden. In dem vorliegenden Bericht werden drei Lebensfähigkeitstests, die sowohl zelluläre Strukturen und Stoffwechselfunktion Umfrage beschrieben, für eine umfassendere Sicht der zellulären Integrität als einem Test von selbst leisten können.

Zwei unserer Tests erfordern eine Infrarotkamera, die Fluoreszenz misst in der 700 und 800 nm-Kanäle. Rauschen in dem Infrarot-Wellenlängen gering, was zu höheren Signal-zu-Rausch-Verhältnisse ^3. Die Odyssee, die wir verwenden Imager hat einen 4,5 log Dynamikbereich und eine Bit-Tiefe von 16, Translating bis 2 ¹⁶ oder 65536 Schattierungen von Infrarot. Dies kann zu einer 8-Bit-Farbbilderzeugung, die nur liefert 2 ⁸ oder 256 Farbtöne für jede Wellenlänge gegenübergestellt werden. So hat 16-Bit-Bild feinere Auflösung. Es sei angemerkt, daß die ursprünglichen Infrarotbilder werden oft grünen (800 nm) und roten (700 nm) in veröffentlichten Berichten zur Darstellung pseudocolored werden. Odyssey Bildkameras werden häufig sowohl für die Western-Blot-und In-Cell Western ^4-7 verwendet. In-Cell Western auf Formaldehyd-fixierten Zellen verwenden primären Antikörper gegen jedes Protein von Interesse und beschriften Sie sie wiederum mit Infrarot-Fluoreszenzsekundärantikörper. Diese Technik ist besonders nützlich für die Phosphorylierung Endpunkte ⁶ sein. In unserer In-Cell Western, färben wir feste Zellen Proteine ​​des Zytoskeletts α-Tubulin oder die neuronale Mikrotubuli-assoziierten Protein 2 (MAP2) in der 800 nm-Kanal. Diese Proteine ​​sind reich genug, um hohen Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erhalten. Wir unseren Platten in der 700 Fleck auchnm-Kanal für Kerne mit dem DRAQ5 Fleck und für das Cytoplasma mit der Sapphire Fleck. Sowohl die Proteine ​​des Zytoskeletts und die DRAQ5 + Sapphire Flecken spiegeln somit zelluläre Strukturen.

Die dritte Lebensfähigkeitstest misst metabolische Funktion und wird als "Zelltiters Glo". In diesem Luciferase-basierenden Assay werden Helligkeitswerte direkt proportional zu der ATP-Spiegel. ATP-Assays werden häufig verwendet, um lebensfähige Zellen zu quantifizieren ^8-12. Einschließlich das Wort "Titer" im Namen des Assays ist jedoch etwas irreführend, da ATP Produktion pro Zelle als eine Funktion der Toxin-Behandlungen zu ändern und kann daher nicht immer im Verhältnis zu Zellzahl ^8. ATP-Spiegel kann auch durch zirkadianen Rhythmen ¹³ und ¹⁴ durch Zellteilung und Zelldifferenzierung ¹⁵ betroffen sein. Dennoch ist die hier gezeigte ATP-Assay leicht durchzuführen und geeignet, da ATP ist ein robusteres Maß des metabolischenLebensfähigkeit ^16-21, wenn nicht Nummer Zelle an sich. Verwendung dieses Tests als Ergänzung zu den Infrarot-In-Cell Western ergibt daher ein umfassenderes Bild der zellulären Integrität als jeder Test allein.

Protokoll

Eine schematische Darstellung der Protokolle ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Handy-Überzug

Platten Zellen in 96-Well-Platten in unterschiedlichen Beschichtungsdichten (Fig. 2). Für Linearitätsprüfungen auf der N2a Neuroblastom-Zelllinie, Platte 2.5k, 5k, 10k, 15k und Zellen pro Vertiefung in 3 oder 6 Wells / Gruppe. Für Linearitätsprüfungen in Ratten primären kortikalen Neuronen, Platte 25k, 50k, 100k, 200k und Zellen pro Vertiefung in 3 oder 6 Wells / Gruppe. Wenn die Zelllinien oder primäre Zellen von Interesse sehen gesund an verschiedenen Beschichtungsdichten Platte an und um die optimale Zelldichte für diesen Zelltyp.

Hinweis: In der vorliegenden Studie wurden N2a-Zellen in 100 ul Medien und primären kortikalen Neuronen in 200 ul Medien auf Platten, die für geringere Verdampfungs ausgelegt sind vergoldet. Für detaillierte Informationen über die Handhabung von Zellen, Medien, Seren, Antibiotika und Toxin-Behandlungen finden Sie Unnithan et al. für N2a cells ⁸ und Posimo et al. für primäre Rinde Kulturen ^22.

1. 1. Wiederholen Sie die Beschichtung auf einer zweiten 96-Well-Platte. Eine Platte wird für ATP (2A) untersucht werden und das andere mit der Infrarot-Assays (Fig. 2B). Man kann die gleiche Platte nicht verwenden, für die ATP-und Infrarot-Assays, weil die Zellen müssen offen für die intrazelluläre ATP-Messungen lysiert werden.
   2. Achten Sie darauf, mindestens 3 zusätzliche Brunnen zur Grundabzug in der Infrarot-Assays auf die optimale Beschichtungs-Dichte (Spalte 2, 2B) plattieren.
2. In Medien ohne Zellen oder, kostengünstig, steriles Wasser auf die äußeren Wells in den Reihen A und H und in den Spalten 1 und 12 auf. Verlassen Sie sich auf Daten von Brunnen entlang der Kanten, wie Rentabilität ist hier oft geringer aus Wirkung von Medien Verdunstung und Temperaturgradienten. Solche Probleme mit Mikroplatten werden gewöhnlich als Randeffekte ^23,24. Diese Brunnen Bewahren Sie keine leerenweil dann Reihen B und G und Spalten 2 und 11 leiden an der Randeffekt.
   Kanteneffekte können durch Inkubation einer frisch angeimpft Platte bei Raumtemperatur unter Umgebungsbedingungen vor der Übertragung in die CO _2-Inkubator ²⁴ reduziert werden. Weiterhin ist eine aktuelle Studie von Carralot beschreibt eine mathematische Korrekturverfahren für Mikrotiterplatten mit einem einzigen Steuersäule ^23. Oliver und seine Kollegen verwendeten eine speziell entwickelte Druckluft Mikrotiterplatte Inkubator thermischen Gradienten ²⁵ zu reduzieren. Wenn die Kanteneffekt ist von großer Sorge, können Mikrostabilitätskammern (z. B. BT & C Incorporated) gekauft werden, um eine homogene Mikroumgebung mit hoher Luftfeuchtigkeit und sogar Temperaturgradienten erstellen.
3. Wenn mehr als Brunnen in Abbildung 1 dargestellt sind notwendig, weil zusätzliches Reagenz-Verdünnungen oder mehrere Beschichtungsdichten getestet werden, verwenden Sie die Kante Brunnen für die Hintergrund-Subtraktion.
4. Warten Sie, über Nacht zur BefestigungZellen und Assay am nächsten Morgen, wie unten beschrieben.

2. Leucht ATP-Assay

1. Folgen Sie den Empfehlungen des Zell Titer Glo Herstellers zur Rekonstitution des Substrats mit Puffer und für Inkubationszeiten.
   1. Entfernen 50 oder 150 &mgr; l Medium von den 100 oder 200 ul Plattierungsmedien sind. Etwas weniger als 50 ul hinter in der gut bleiben. Hinzufügen von 25 &mgr; l der Reagentien (Substrat und Puffer), um Spalten 2-6 (2A) in einer Verdünnung von 1:2.
      Hinweis: Unterschiedliche Volumina der Medien hinter sich gelassen nach der Entfernung konnte die ATP-Assay-Reagenzien differentiell über Brunnen verdünnen oder konzentrieren. Achten Sie darauf, dass das Niveau der Flüssigkeit in allen Mehrkanal-Pipettenspitzen ist gleichwertig. Messung der restlichen Flüssigkeit in ausgewählten Vertiefungen in der Platte mit einer Pipette unmittelbar vor der Zugabe der ATP-Assay-Reagenzien, um die Genauigkeit zu gewährleisten. Wenn hohe Variabilität aus unterschiedlichen Raten von Medien Evapor vorhandenation über die Oberfläche der Platte ist, entfernen Sie alle alten Medien und fügen Sie die gleiche Menge an frischem Medium oder Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in alle Vertiefungen unmittelbar vor der Zugabe von ATP-Assay-Reagenzien. Wenn die Platten leiden unter variablen Ebenen der Verdampfung, versuchen Sie es mit den niedrigen Verdampfungsplatten von Costar Corning. In den letzteren Platten, die 60 in Fig. 2 gezeigt Innen Vertiefungen leiden nur von durchschnittlich 0,995 ± 0,41% Medien Verdampfen über Nacht. Es ist somit vernachlässigbar Variabilität Medienvolumen zum Zeitpunkt des Assays.
   2. In den Spalten 7 bis 11, Zeilen B bis D, entfernen Sie genug Medien auf 50 ul hinter sich zu lassen, wie oben beschrieben, und 50 ul von Reagenzien in einer 1:1-Verdünnung.
   3. In den Spalten 7 bis 11, Reihen E bis G, lassen Zellen in 100 ul Medium und 100 &mgr; l von Reagenzien, wieder in einer 1:1-Verdünnung. Das Unternehmen empfiehlt, dass 100 ul Reagenzien 1.01 in 100 ul Medium verdünnt werden.
      Hinweis: Umum Kosten zu sparen, ist es möglich, diese Empfehlungen sowohl im Volumen und in Verdünnung geschnitten. Jedoch bevor diese Weise sicherzustellen, dass sie die Linearität und Empfindlichkeit des Assays nicht verringern.
   4. Sobald ein bestimmtes Volumen und Verdünnungsfaktor der Reagenzien sind als zufriedenstellend befunden, bleiben sie in allen nachfolgenden Experimenten. Die Kriterien für eine zufriedenstellende Daten sind im Abschnitt Ergebnisse beschrieben.
   5. Nicht verwendete rekonstituierte Reagenzien können wieder eingefroren und zu einem späteren Zeitpunkt verwendet werden, um Kosten zu sparen werden. Nach Angaben des Herstellers rekonstituiert Reagenzien bei -20 º C 21 Wochen lang mit ~ 3% Aktivitätsverlust gelagert werden.
2. Legen Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler für 2 min oder einem Taumelschüttler für 10 min. Wenn ein Teil der Platte ist für eine andere Messung untersucht und es nicht erschüttert werden kann, bewegen die Medien mit einfachen Auf-und-Ab-Pipettieren nur in den Vertiefungen von Interesse. Allerdings wird übermäßiges Blasen in diesem Schritt erzeugt mit Leuchten störenzier ausgegeben.
   1. 10 min nach der Zugabe der Reagentien, Transfer 60 &mgr; l in den Wells in weiße 96-Well-Platten. Lumineszenz Werte sind höher als in weißen Platten in klar oder schwarz-Platten, weil sie das Licht reflektieren nach oben in Richtung des Detektors.
      Hinweis: Nach unserer Erfahrung Zellen überleben besser auf die niedrige Verdampfungs, klare Costar-Platten als andere Platten. Diese speziellen Platten nicht mit weißen Wänden verkauft. Zweitens sind die undurchsichtigen Wänden und Bodenplatten deutlich teurer als völlig klar Platten. Wenn man überträgt die lumineszierenden Flüssigkeit auf weiße Platten, können die weißen Platten gewaschen und wiederverwendet, spart über die Kosten der Verwendung von neuen weißen Platten für jedes Experiment werden. Übertragen von Flüssigkeit ist somit die kostengünstigere Option auf lange Sicht.
   2. Pop alle Luftblasen vor dem Ablesen der Platte mit einer Nadel oder vorzugsweise mit Zwangsluft aus einem Kunststoffüberführungspipettenkolben. Lesen Sie die Platte auf einem Luminometer mit einer 1 sec Integrationszeit (das Unternehmen empfnds 0,25-1 Sekunden als ausreichend Integrationszeit). Lesen Sie die Platte 10-12 min nach der Zugabe von ATP-Assay-Reagenzien. Timing ist entscheidend für den Vergleich zwischen verschiedenen Platten, weil die Leuchtsignal ist vorübergehend mit einer schnellen Zerfallsrate, wie von Gilbert und Kollegen ²⁶ gezeigt.
3. Mittelwert der Leuchtwerte aus den 3 oder 6 Vertiefungen in jeder Gruppe und Handlung als Funktion der Zellzahl in einem Streudiagramm (siehe Abbildung 3). Erste subtrahieren durchschnittliche Hinter Lumineszenz-Werte der entsprechenden leeren Brunnen (Brunnen 2B - 2G, Brunnen 11B - 11D, 11E und Brunnen - 11G) von jedem entsprechenden Datenpunkt. Es gibt drei verschiedene Gruppen für jede Beschichtungsdichte in diesem ersten Experiment (Fig. 2A) liegen. ATP-Werte linear mit Zelldichten in einem oder allen dieser Gruppen korreliert. Fahren Sie mit der höchsten Verdünnung von Reagenzien, die immer noch zufriedenstellende Ergebnisse auf Kosten zu sparen. Kriterien für zufriedenstellende Ergebnisse beschrieben in der Abschnitt Ergebnisse.
   Hinweis: Bei den in der vorliegenden Studie verwendeten Medien, Hintergrundwerte mit diesem Test sind nicht hoch und es ist möglich, um die leeren Brunnen zu springen. Allerdings, berichtet der Hersteller Promega Unterschiede in der Lumineszenz mit verschiedenen Kulturmedien. Die vorliegende Studie verwendet Hyclone Fetal Klon III, eine synthetische Version des fetales Rinderserum für N2a-Zellen und Kälberserum für primäre kortikale Kulturen. Laut Hersteller nimmt Kälberserum Helligkeitswerte aber nicht die Empfindlichkeit des Assays zu verringern. Dennoch, wenn dies von signifikanter Bedeutung, verdünnter ATP-Assay-Reagenzien in PBS anstelle von Medien zum Zeitpunkt des Assays.
   1. Wenn die Zellen scheinen ungleichmäßig über Spalten Nacht wachsen, versuchen Testen sie innerhalb von 6 Stunden der Beschichtung. Doch bedenken Sie, dass die Dichte an der üblichen Zeit von Assay (zum Beispiel, 24 Stunden nach der Behandlung) ist die Dichte, mit der Linearität muss erreicht werden.

3. Infrared Assays

1. Der Morgen nach der Plattierung, fixieren die Zellen in der zweiten Platte bei Raumtemperatur in einem Abzug. Achten Sie darauf, Handschuhe für diesen Schritt tragen und entsorgen Sie das Fixiermittel als chemischer Abfall, weil Formaldehyd ist krebserregend. Hinzufügen von 4% Formaldehyd und 4% Saccharose in 0,1 M Phosphatpuffer in die bestehenden Medien in einer 1:1-Verdünnung. Die Medien können auch mit PBS vor der Befestigung in voller Stärke Fixiermittel gewaschen werden. Entweder Technik funktioniert gut.
   1. Inkubation in Fixiermittel für 20 min und dann die Fixiermittel und waschen 3x in 200 ul PBS.
2. Bewahren Sie die Platte in PBS mit 0,2% Natriumazid bei 4 ° C, wenn der Test nicht am gleichen Tag statt. Andernfalls fahren mit dem Assay und setzen die Zellen in Blockierungslösung unspezifische Bindung von Antikörpern zu minimieren.
   1. Verdünnen Sie die Serum-Fisch Odyssey Block 1.01 in PBS und fügen 0,3% Triton X-100 als Durchlässigkeitszelle. Machen Sie genug Blockierungslösung sowie Primär-und Sekundär Antibody Lösungen, so dass 35 ul gut in jede pipettiert werden. Allerdings, wenn eine Menge von Blasen sind beim Pipettieren beobachtet, machen> 50 ul für jeden gut, da sonst die Luftblasen reichen bis in die Zellen-und Block Antikörper aus der Bindung. Übermäßige Seifenbläschen als ungefärbten kreisförmigen Fleck in der Mitte des gut erscheinen. Versuchen Sie, das Pipettieren anpassen, wenn dies geschieht.
   2. Inkubieren in dieser Blockierlösung für 30-60 min bei Raumtemperatur.
      Anmerkung: 5% Rinderserumalbumin oder normales Serum von der gleichen Spezies wie der sekundäre Antikörper kann auch als Blockierungslösungen auf Kosten des Fischserum Block speichern verwendet werden. Blocking-Lösungen kann die Leistung des Antikörpers beeinflussen. Somit ist der optimale Block für jeden Antikörper am besten empirisch bestimmt.
      Hinweis: Einige Forscher setzen In-Cell Western-Platten auf Schüttler bei Inkubationen. Dies ist jedoch nicht notwendig.
3. Stellen Sie die primären Antikörper: 1:10.000-Verdünnung für Anti-α-Tubulin-(Maus-monoklonal, Tabelle 1) und 1:2000 Verdünnung anti-MAP2 (monoklonaler Maus, Tabelle 1). Diese Antikörper sind spezifisch für die interessierenden Proteine ​​in diesen zellulären Modellen; Spezifität ist für jede immunzytochemische Fleck.
   Hinweis: MAP2 ist ein Marker für Neuronen und neuronalen Misch / Gliakulturen geeignet ist. Die hier gezeigten postnatale Kulturen enthalten auch einige Glia (~ 25%), da Astrozyten erscheinen zuerst an embryonalen Tag 18, mit ihren Nummern Höhepunkt in der frühen Neugeborenenperiode ^27,28. Man kann nicht zwischen Astrozyten und Neuronen in der ATP-und DRAQ5 + Sapphire Assays unterscheiden. Um Neuronen und Astrozyten getrennt zu messen, verwenden Sie gleichzeitige MAP2 und GFAP Färbung in den 800 und 700 nm Kanäle, wie Mullett ^4,29 und Kollegen beschrieben, so dass sich DRAQ5 + Sapphire. Wenn jedoch alle Zellen in der Kultur möchte beurteilt werden, mit einem Schwenk-Zellmarker, wie zB α-Tubulin, β-Actin, GAPDH oder.
   Hinweis: Diese Verdünnungen wurden für die N2a und primären kortikalen Zellen optimiert und müssen nicht auf jedem Modell zu verallgemeinern. Daher versuchen die mindestens zwei primäre Antikörperverdünnungen, eine auf der linken Hälfte der Platte und eine auf der rechten Hälfte (siehe Fig. 2B). Alternativ versuchen 3-4 Verdünnungen der primären Antikörper auf jeweils 3 Brunnen. Zum Beispiel kann die empfohlene Verdünnung des Antikörpers Einlageblatt mit zweifachen Veränderungen flankiert werden. In anderen Worten, wenn die empfohlene Verdünnung für Immunzytochemie ist 1:500, 1:250 und auch versuchen 1:1.000 Verdünnungsfaktoren.
   1. Antikörper verdünnt in 1:1-Odyssey-Block: PBS und fügen 0,3% Triton-X. Um Kosten zu sparen, versuchen Sie, die Antikörper in der Blockierungslösung, die auf die Zellen in Schritt 3.2.1, indem diese Lösung am Ende der Inkubationszeit aufgetragen. Halten Sie die Zellen in PBS während dies zu tun, sie müssen nicht austrocknet.
   2. Inkubation in Primärantikörper entweder 1-2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C Für schwach binding Antikörper und Proteine, die nicht reich sind, können dazu beitragen, über Nacht Inkubationen Signal.
      Hinweis: Lassen Sie mindestens 3 Brunnen in Blocking-Lösung für die Hintergrund Subtraktion bei jedem sekundären Antikörperkonzentration (Brunnen 2B-2D und 2E-Brunnen 2G in Abbildung 2B). Sie nicht, diese Brunnen zu jedem primären Antikörper haupt aussetzen. Sie zeigen das Ausmaß der unspezifischen Bindung von dem sekundären Antikörper und sind nützlich für die Berechnung des Signal-Rausch-Verhältnisse. Wenn es ein Problem, dass die sekundären Antikörper zu hohen unspezifischen Bindung führen, sind: Kontrollvertiefungen, die nicht mit entweder primären oder sekundären Antikörper ausgesetzt werden, erhalten aber die gleiche Anzahl von Wäschen. Der Unterschied zwischen diesen Brunnen und den "Sekundär nur" Brunnen wird das Ausmaß der unspezifischen Bindung durch den sekundären Antikörper allein verursacht offenbaren. In unserem Test auf Maus N2a Zellen, Signalintensität mit Anti-Maus-Sekundärantikörper allein war 0,557 ± 0,032, Signal mit anti-Kaninchensekundären Antikörper allein war 0,533 ± 0,041, Signal ohne sekundäre Antikörper wurde 0,357 ± 0,003 und Signal mit Primär-und Sekundärantikörper war 11,867 ± 0,911. Damit haben wir nicht beobachtet hohe unspezifische Bindung auch bei Verwendung von Anti-Maus-Sekundärantikörper auf Mauszellen. Es gibt mehrere Hersteller für Infrarot-Sekundärantikörper, wir empfehlen nur den Kauf der hochQuer adsorbiert diejenigen. Beachten Sie, dass die Konzentration des sekundären IgG-Antikörper können in Abhängigkeit von der Quelle variieren.
4. Abwaschen primären Antikörper mit 3 Waschungen von 200 ul PBS pro Vertiefung jeweils 10 min. Primäre Antikörper können bei 4 ° C für ein paar Wochen in 0,2% Natriumazid gespeichert und wiederverwendet, bis winzige Schmutzflecken werden deutlich, wenn die Lösungen bis zu Licht gehalten werden. Dies wird nur durchgeführt, um Kosten zu sparen. Wenn die Kosten nicht ein Problem ist, machen frische Antikörper für jeden Gebrauch.
5. Verdünnen Sie die sekundären Antikörper von 1:1000 oder 1:2000 in 1:1-Odyssey-Block: PBS mit 0,3% Trit-X (Fig. 2B). Fügen Sie die 1:1000 Verdünnung auf die obere Hälfte der Platte und 1:2.000 in die untere Hälfte der Platte. Diese Konzentrationen könnte weiter reduziert werden, um Kosten zu sparen, sondern prüfen Sie für Linearität, bevor sich auf diese.
   Hinweis: Achten Sie darauf, den entsprechenden sekundären Antikörperlösung auf die Hintergrund-Subtraktion Brunnen (Spalte 2 in 2B) hinzufügen.
   1. Wenn ein zweites Protein wird an Stelle von DRAQ5 + Saphir-, Etiketten-Zellen, die für α-Tubulin-oder MAP2 mit 700 nm Ziege-Anti-Maus-IgG und das zweite Protein in der 800 nm-Kanal mit primären Antikörpern aus einer anderen als der Maus-Spezies untersucht werden. Die 800 nm-Kanal hat weniger Hintergrund als die 700 nm-Kanal und sollte für die meisten kritischen Protein von Interesse reserviert werden.
   2. Inkubation in Sekundärantikörper für 1 h bei Raumtemperatur in einer Schublade weg vom Licht.
6. Abwaschen Sekundärantikörper mit 3 Waschungen von 200 ul PBS pro Vertiefung jeweils 10 min.
7. Nehmen Sie die DRAQ5 + Saphir-Lösungen. Für die linke Hälfte der Platte verdünnt 1:10.000 DRAQ5 (0,5 &mgr; M Endkonzentration) und Saphir 1:1000 in PBS mit 0,3% Triton-X-(Spalten 3 - 6, Fig. 2B). Für die rechte Hälfte der Platte, verdünnte DRAQ5 1:20.000 (0,25 uM) und Sapphire 1:2000 (Spalten 7-10, Fig. 2B).
   Hinweis: DRAQ5 verwendet werden, um bei einer 1 mM Stamm statt einer 5 mM Lager verkauft werden. Einige bisher veröffentlichten Berichte daher verwendet werden, 1:4000 oder 1:2000 Verdünnungen DRAQ5 ^8.
   1. Um Kosten zu sparen, wenn zwei Platten gleichzeitig untersucht wird, kann der gleiche DRAQ5 + Sapphire Lösungen auf zwei Platten in der Reihenfolge verwendet werden, Pipettieren es von der ersten Platte und Hinzufügen zu der zweiten. Wenn die gleichen Lösungen werden zweimal in dieser Weise verwendet werden, verwenden Sie sie innerhalb von einem Tag. Verdünnt DRAQ5 + Sapphire Lösungen nicht bei 4 º C gespeichert werden oder zur späteren Verwendung eingefroren werden.
   2. Inkubation in diesen Lösungen für 30 Minuten bei Raumtemperatur weg from Licht. Wenn die Zeit knapp und die DRAQ5 + Sapphire Lösungen werden nicht auf anderen Platten mit verschiedenen Sekundärwiederverwendet werden, fügen Sie diese Flecken mit den Sekundärantikörperlösungen in Schritt 3,5 und Inkubation für 1 Stunde.
      Hinweis: Sie DRAQ5 + Sapphire Lösung für die Hintergrund-Subtraktion Brunnen (Spalte 2 in 2B) nicht hinzufügen, da diese Brunnen sollten nicht in der 700 nm-Kanal gefärbt werden.
8. Waschen Sie die Platte 3x mit 200 ul PBS pro Vertiefung für jeweils 10 Minuten. Legen 0,2% Natrium-Azid in der letzten PBS waschen, wenn die Platte gehen, um mit anderen sichtbaren Bereich sekundären Antikörpern gefärbt nach der Infrarot-Bildgebung abgeschlossen ist.
9. Scannen Sie die Platte auf einer Odyssee Imager. Beginnen Sie mit dem Scannen der Platten an Intensität 5 und 169 mm Auflösung. Entweder "mittlerer Qualität" oder Einstellungen "niedrige Qualität" ausreichend sind. Das Unternehmen gibt keine genauen Anregung / Emissionsfilter Informationen freizugeben. Jedoch sind die Emissionsfilter ungefähr 20 nm breit und etwa 7 zentriert20 und 820 nm, je nach Hersteller.
   Hinweis: Es ist möglich, Platten noch feucht scannen als Ermittler wollen sie weiterhin mit anderen Markern färben. Allerdings schlägt sich das Unternehmen in seinem Online-Protokoll, das Trockenplatten führen zu weniger wohl gut Signal verbreitet. Wenn Sie sie nass und dann trocken, um die Daten vergleichen zu scannen, sicher sein, alle die PBS zu entfernen aus dem Brunnen, weil verbleibende Salze nach der Verdampfung kann zu hohen Hintergrundfluoreszenz an den Rändern führen.
   1. Die Odyssey Imager scannt und durch den Boden der Platte. Platten von verschiedenen Herstellern können unterschiedliche Schwerpunktverschiebungen fordern, da der Boden der Vertiefungen können in ihrer Dicke und Tiefe in der Platte variieren. Versuchen Scannen mit unterschiedlichen Schwerpunktverschiebungen und sehen, wo die höchsten Signal-zu-Rausch-Verhältnis und schärfsten (die meisten im Fokus) Signals erreicht: 2,5 mm, 3,0 mm, 3,5 mm, 4,0 mm. Versuchen Sie auch, um die Tiefe des Brunnens aus dem Boden einer Platte mit einem Lineal messen, um die findin bestätigengs auf der Odyssee. Denken Sie daran, dass der Kunststoff im Boden des Brunnens kann zusätzliche Höhe zu den Herrscher Messungen hinzuzufügen. Die in der vorliegenden Studie verwendet Costar-Platten erfordern ein Fokusversatz von 4,0 mm.
   2. Verwenden Sie die In-Cell Western-Funktion in der Software, um die passende Größe Gitter auf das Bild der Platte legen und exportieren Sie die Daten in Microsoft Excel. Untersuchen Sie die "integrierte Intensität" Werte der gleichen Brunnen in verschiedenen Schwerpunktverschiebungen, die höchsten Fluoreszenzwerte zu finden. Die Fokusversetzungs, die den höchsten Signal-zu-Rausch-Verhältnis (Signal in immun Vertiefungen versus "ohne primäre negative Kontrolle" wells) ergibt die man im folgenden zu wählen.
   3. Sobald ein Schwerpunkt Offset wird beschlossen, erneut zu scannen in kleineren Schritten. Zum Beispiel, wenn das hellste Signal war bei 3,5 und 4,0 mm, versuchen Abtastung bei 3,6, 3,7, 3,8 und 3,9 mm und sehen, ob es eine weitere Verbesserung in der Signalstärke. Wenn der Fokus-Verschiebung ist verkehrt, Signalintensitäten über die 12 Spalten auf einem leeren plaß (wenn alle Spalten gleich Signal haben) wird als U-förmige Kurve statt einer flachen Linie erscheinen. Wenn das so weiter geht, um ein Problem mit Kunststoffplatten, versuchen Glasbodenplatten.
10. Ziehen Sie den Durchschnitt der integrierten Intensitäten in den Hintergrund Subtraktion Brunnen (2B; Brunnen 2B - 2D-oder Brunnen 2E - 2G) von jedem entsprechenden Datenpunkt in der 700 und 800 nm-Kanäle. Dann ist der Mittelwert der integrierten Signalintensitäten für jede Gruppe von Brunnen. Zeichnen Sie die Daten als Streudiagramm gegen Zelldichte (siehe Abbildung 3).
    1. Vergleichen der Ergebnisse der zwei verschiedenen Verdünnungen des primären und sekundären Antikörpern, und die Ergebnisse der zwei verschiedenen Verdünnungen DRAQ5 + Saphir auf jeder Verdünnung für nachfolgende Versuche zu regeln. Wenn Linearität nicht erreicht, versuchen Scannen mit einer anderen Intensität. Rescan mit Intensitäten 3 und 7 statt 5 und erneut analysieren die Daten. Wenn die Daten zu verbessern an einem dieser Intensität abersind immer noch nicht befriedigend, scannen in Schritten um diese Intensität.
    2. Seien Sie vorsichtig, nicht auf Bilder, wo die Software zeigt weiße Flecken in den Vertiefungen zu analysieren; diese Flecken bedeuten gesättigte Signal aus dem Bereich der Bildwandler. Scannen mit einer geringeren Intensität, wenn dies geschieht.
    3. Wenn Linearität nicht erreicht wird, auch versuchen, die Zellen innerhalb von 6 Stunden der Plattierung zu beheben, weil sie vielleicht zu wachsen oder sterben ungleichmäßig in verschiedenen Spalten über Nacht. Versuchen Sie auch verschiedene Beschichtungsdichten, verschiedene Scan-Intensitäten, weitere Optimierungen der Reagenz Verdünnungsfaktoren, Glasbodenplatten, DRAQ5 selbst als Kern-only-Färbung, oder andere als anti-α-Tubulin-oder anti-MAP2 verschiedenen Antikörpern.

Ergebnisse

Der limitierende Faktor bei diesen Versuchen ist die Infrarot-Färbung, wie die ATP-Assay ist in relativ kurzer Dauer. Für die Infrarot-Assays, erwarten wir, dass acht 96-Well-Platten können durch die Staffelung der zwei Gruppen von je vier Platten gefärbt und gescannt werden innerhalb eines Tages (siehe Abbildung 1). Diese Schätzung geht davon aus, 20 min der Fixierung, 30 min Waschen, 30 min zu blockieren, 2 h Inkubation primärer Antikörper, gefolgt von 30 min von Waschanlagen, 1 Stunde sekundä...

Diskussion

Wir haben gefunden, dass die Signalstärke in allen drei Lebensfähigkeitstests ist linear und mit Beschichtungs-Dichte korreliert. Jedoch nicht alle Assays sind gleichermaßen empfindlich auf das 2-fache bzw. 1,5-fache Veränderungen Plattierungsdichte. Für N2a-Zellen, die Infrarot-Tests sind weniger empfindlich als die ATP-Assay, insbesondere bei niedrigeren Beschichtungsdichten. Obwohl die Infrarot-Tests sind weniger empfindlich als ATP, die DRAQ5 + Sapphire-Assays und die α-Tubulin-Assays sind in guter Übereinsti...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Titer Glo	Promega	G7572	Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin	Thermo-Shandon	9990244	Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block	LI-COR	927-40003	This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	21568	We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher	S468	One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher	S373	See above
Sodium Azide (250x)	Ricca Chemical Company	7144.8-16	Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin	Sigma-Aldrich	T5168	This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M9942	This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-32210	Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5	Biostatus	DR50200	This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire	LI-COR	928-40022
Luminometer	PerkinElmer	VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager	LI-COR	9201-01
Shaker/Mixer	Research Products International	248555