Visualización de los Efectos de una experiencia inicial positiva, Estímulo Táctil, sobre dendríticas morfología sináptica y la conectividad con Golgi-Cox tinción

Resumen

En este trabajo se describen los procedimientos para la estimulación táctil de crías de rata y la posterior tinción de Golgi-Cox de la morfología neuronal. Estímulo táctil es una experiencia positiva que se administra en el periodo perinatal por acariciar cachorros con un plumero hogar. Tinción de Golgi-Cox es un procedimiento confiable que permite la visualización de las neuronas enteras.

Resumen

Para generar cambios a largo plazo en el comportamiento, las experiencias deben estar produciendo cambios estables en la morfología neuronal y la conectividad sináptica. La estimulación táctil es una primera experiencia positiva que imita materno lamiendo y aseo en la rata. La exposición de las crías de rata a esta experiencia positiva se puede completar con facilidad y de manera rentable mediante el uso de materiales altamente accesibles, como un plumero hogar. Utilizando un diseño cruzado camada, los cachorros están bien acariciaron o molestar, durante 15 minutos, tres veces al día durante todo el período perinatal. Para medir los cambios neuroplásticos relacionados con esta primera experiencia positiva, se utiliza la tinción de Golgi-Cox del tejido cerebral. Debido al hecho de que de Golgi-Cox impregnación tiñe un número discreto de neuronas en vez de todas las células, la tinción del cerebro de roedores con solución de Golgi-Cox permite la visualización de elementos neuronales enteras, incluyendo el cuerpo celular, las dendritas, axones, y espinas dendríticas. El procedimiento de tinción is lleva a cabo durante varios días y requiere que el investigador prestar mucha atención a los detalles. Sin embargo, una vez que se haya completado la tinción, todo el cerebro se ha impregnado y puede ser conservada indefinidamente para el análisis en curso. Por lo tanto, la tinción de Golgi-Cox es un recurso valioso para el estudio de la experiencia que dependen de la plasticidad.

Introducción

Aunque hay muchas técnicas notificados y utilizados para el examen de las primeras experiencias negativas en la maduración del cerebro, tales como el estrés perinatal ^1,2, la privación sensorial ^3, y la toxicidad de drogas ^4, hay muy pocas metodologías empleadas para examinar los efectos de las experiencias positivas en este período de tiempo. Aparte de enriquecimiento ambiental, estimulación táctil es uno de los pocos cerebro mejora de los tratamientos con efectos demostrados ^5. La estimulación táctil es un método de estimulación sensorial de la piel que imita el comportamiento de las ratas materna, lamiendo y aseo personal. Su aceptación general como una manipulación positiva surge de estudios que indican que la estimulación táctil mejora la maduración de los bebés prematuros y ratas recién nacidas ^6. Además, la investigación en el laboratorio Meaney ⁷ ha demostrado que los niveles más altos de lamido de la madre y el aseo están vinculados a los resultados positivos en los hijos. Debido a Tinfluencias positivas stos, estimulación táctil evolucionaron rápidamente en una estrategia de recuperación destinado a reducir la ansiedad ^8, la mejora de los resultados asociados con lesión cerebral ^9-11, y atenuando la sensibilización de drogas ^12. Como tal, la estimulación táctil es una técnica valiosa para la promoción de las primeras experiencias positivas, con una probada capacidad para reorganizar drásticamente la morfología neuronal y la conectividad sináptica del cerebro en desarrollo.

Con el fin de examinar y cuantificar los cambios en la morfología neuronal, que es necesario para visualizar las neuronas intactas. El procedimiento de tinción de Golgi-Cox es una modificación de la técnica de Camillo Golgi publicado a finales de 1800 que proporciona tinción discreta de un pequeño número de neuronas completas ^13. Aunque el procedimiento parece manchar las neuronas al azar y reproducibilidad se cita comúnmente como principal defecto, el permiso de pequeña tasa de impregnación visualización de todo el elemento neuronal, incluyendo cecuerpos ll, dendritas, espinas dendríticas y axones. Del mismo modo, el tiempo requerido para impregnar un cerebro dado con una solución de Golgi también ha sido citada como una caída. Sin embargo, dado que una vez que la tinción es tejido completa se puede conservar indefinidamente, y el tiempo entre la perfusión del cerebro y la visualización de las neuronas con un microscopio se puede completar en menos de 21 días, el período de tiempo no es irrazonable. Además, con modificaciones menores en el protocolo, la tinción de Golgi-Cox se puede utilizar eficazmente para impregnar cerebros de roedores de todos los rangos de edad. Como los cambios a nivel estructural se han relacionado con las modificaciones persistentes para el funcionamiento conductual y psicológica, la técnica de tinción de Golgi-Cox proporciona a los investigadores una herramienta valiosa para medir la neuroplasticidad.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales y aprobados por la Universidad de Lethbridge, Comité de Cuidado de Animales.

1. Cría y Estímulo Táctil

1. Solicite ratas preñadas a proveedores comunes de los animales o de criar cachorros en la casa utilizando los métodos convencionales de mejoramiento de laboratorio.
2. Casa todos los animales en una habitación con temperatura controlada de cría (21 ° C), mantenido en una luz 12:12 hr: oscuridad ciclo y proporcionar acceso a alimento y agua ad libitum.
3. Cuando nacen las crías, la casa de ratas hembras por separado con sus crías.
4. Para evitar el estrés adicional en relación con el manejo de inmediatamente después del parto, comenzará la estimulación táctil de los cachorros en P3.
5. La estimulación táctil debe llevarse a cabo tres veces al día (9:00 am, 13:00 y 16:00) a partir de P3-P21 y cachorros debe ser destetados de sus madres en P21.
6. Cuando se utiliza un diseño de camada cruz, la mitad de las crías de frOM cada camada se someterá a la estimulación táctil con el otro medio que sirve como controles. Asignar aleatoriamente igual número de cachorros machos y hembras a cada grupo. Para diferenciar las crías sometidas a estimulación y los controles táctiles, marcar un grupo de cachorros con un marcador permanente sobre las patas traseras y la cola. Marcado tiene que volver a aplicar cada dos días.

Estímulo Táctil

7. Retire las presas de su jaula y colocarlos en una jaula temporal con comida y agua. Mantenga la presa y la jaula temporal en la sala de cría / vivienda.
8. Pesar crías de ratas como grupo antes de la sesión de estimulación táctil de la mañana (9:00 am). Para cada sesión, rata transporte cachorros sus jaulas a una sala de pruebas independiente para la estimulación táctil. Coloque la jaula de alojamiento en un cojín de la calefacción que se establece en 24 ° C.
9. Use una tabla rígida para dividir la jaula de alojamiento en dos mitades. Coloque las crías de rata en los estimulación grupo uno medio y control cachorros táctiles en la otra mitad.Establecer un temporizador a 15 min.
10. El uso de un plumero de pluma-como suave, cepille todos los cachorros en el grupo de estimulación táctil al mismo tiempo durante 15 minutos consecutivos. Los jóvenes cachorros de rata (~ P3-P12) ususally acurrucan juntos y parecen entrar en un ciclo de sueño profundo por lo que es muy fácil para estimular todos los cachorros a la vez. A medida que la edad de las crías, se vuelven más activas, con algunos cachorros caminar e investigar durante la sesión. El experimentador debe moverse continuamente cachorros errantes en el grupo para asegurar que cada cachorro recibe estímulo igual.
11. Una vez que la sesión de 15 minutos se ha completado, el transporte de las crías de nuevo a la sala de reproducción y volver a la madre a la jaula.
12. Repita este proceso tres veces al día durante los 19 días de la estimulación táctil. Después de la sesión de estimulación táctil final en P21, los cachorros deben ser destetados de sus madres. Los cachorros deben luego ser alojados en jaulas con 5 o 6 otros animales destetados del mismo sexo.
13. Si las ratas son sometidos a ninguna prueba adicional, se deben dejar sinperturbado, en la luz normal: oscuridad ciclo con acceso a alimentos y agua ad libitm (aparte de limpieza de la jaula regular y manipulación) hasta que alcanzan unos 100 días de edad. Si sufrir otras manipulaciones experimentales, los animales deben ser tratados o sometidos a pruebas de conformidad con esos protocolos de laboratorio.

2. Sacrificio y Golgi-Cox tinción

1. Aproximadamente a P100, administrar una sobredosis de pentobarbital de sodio a través de la inyección IP a las ratas y perfunden intracardially con aproximadamente 100 ml de solución salina 0,9%.
2. Extraer el cerebro cuando la perfusión se ha completado. Retire el cerebro del cráneo, cortar el nervio óptico por debajo con esfuerzo para mantener intacto el cerebelo; investigadores pueden optar por mantener o eliminar los bulbos olfatorios. Coloque cerebros extraídos en una botella de Nalgene opaco con 20 ml de solución de Golgi-Cox ^14.
3. Mantener el cerebro en la solución de Golgi-Cox durante 14 días. Después de 14 días, reemplace el Golgi-Csolución de buey con una solución de sacarosa al 30%. Mantener el cerebro en la solución de sacarosa durante 2-5 días antes de la sección.

Nota: Si el cerebro no pueden ser seccionados dentro de los 14 días de la transferencia de la solución de sacarosa, el investigador tiene que sustituir la sacarosa con un nuevo balance de 30% de sacarosa. El investigador puede sustituir a la sacarosa cada dos semanas durante 4 meses, sin efectos adversos en la tinción.

4. Con el fin de la sección del cerebro, el cerebro debe ser borrado en seco y se fija a la fase de seccionamiento con pegamento cyanocacrylic. Para evitar que se desgarre o seccionamiento desigual, el investigador debe tener cuidado y asegurarse de que todo el cerebro esté bien sujeta a los escenarios.
5. El depósito vibrátomo debe ser llenado con solución de sacarosa al 6% a un nivel que cubre la cuchilla de seccionamiento. Establezca los parámetros vibratome a una velocidad y amplitud a 5, (el punto medio en ambas escalas). Cortar el cerebro en 200 micras secciones y colocar las secciones en un micro gelatinizada 2%diapositiva alcance. Asegúrese de mantener las secciones húmeda durante el curso de la sección.
6. Cuando todas las secciones de interés han sido recogidos, pulse las secciones sobre los portaobjetos mediante la aplicación de presión a las diapositivas con papel secante humedecido. Almacenar los portaobjetos en una rejilla deslizante en la cámara de humedad hasta que estén listos para ser manchado. Deben permanecer en la cámara de humedad durante al menos 12 horas, pero no más de 4 días. Las diapositivas deben estar húmedo y no se debe permitir que se seque.
7. Preparar el regimiento se vea antes de comenzar el proceso de tinción. Etiqueta doce platos de tinción de vidrio (10,7 x 8,5 x 6,8 cm) y de proceso de la siguiente manera:
   1. Agua destilada - 1 min
   2. Hidróxido de amonio - 30 min (en la oscuridad)
   3. Agua destilada - 1 min
   4. Kodak Fix for Film - 30 min (en la oscuridad)
   5. Agua destilada - 1 min
   6. 50% de alcohol - 1 min
   7. 70% de alcohol - 1 min
   8. 95% de alcohol - 1 min
   9. 100% Alcohol - 5 min
   10. 100% Alcohol - 5 min
   11. Solución (1/3 del cloroformo, tercera HemoDe, tercera 100% de alcohol) - 15 min
   12. HemoDe - 15 min

* Xileno se puede utilizar en sustitución de HemoDe. Con el fin de garantizar la calidad de la tinción consistente, las soluciones deben utilizarse para cada parrilla corrediza procesado.

8. A raíz de los últimos 15 min emersión en HemoDe, cubreobjetos las diapositivas con Permount.
9. Deje que los portaobjetos se sequen al aire antes de examinar con un microscopio.

Resultados

Cuando este procedimiento de tinción se ha seguido correctamente, se genera tinción coherente y uniforme de las dendritas y espinas. Ver Figura 1 para una representación de Golgi-Cox tinción neuronal. Este procedimiento produce tinción que es comparable a la recién desarrollado métodos in vitro y puede permitir la visualización de campos dendríticas que son ininterrumpida incrustación de tejido siguiente. La técnica basada vibrátomo para la tinción de Golgi-Cox se ha encontrado que produce tinción más generalizada de ramas terminales y las neuronas piramidales, que la tinción con cualquiera celoidina-incrustado y el tejido criostato-seccionada, ^15. Además, ya que este método de tinción impregna todo el cerebro, todas las secciones pueden ser analizados ya sea inmediatamente o en el futuro. Como la ubicación del cambio morfológico es que no siempre es obvio cuando se genera una hipótesis original, este proceso permite la exploración de regiones cerebrales adicionales und impide la eliminación de tejido que puede ser útil en el futuro.

Este método de tinción se puede utilizar para la tinción fiable de cualquier cerebros de ratas de edad (edad P0 de edad). Sin embargo, cuando la tinción de los cerebros jóvenes (<1 gramo), el cerebro sólo debe permanecer en la solución de Golgi-Cox durante 6 días, en lugar de los 14 días recomendados para el cerebro adulto, todos los demás procedimientos se mantienen constantes. La principal dificultad que se pueden encontrar durante este proceso de tinción de Golgi-Cox es la incapacidad de producir la tinción de alta calidad de regiones centrales del cerebro, incluyendo el tálamo. Como todo el cerebro se impregna al mismo tiempo, las regiones centrales no pueden recibir las concentraciones ideales de mancha. A pesar de este hallazgo, la técnica de Golgi-Cox produce tinción excepcional de regiones subcorticales, tales como el hipocampo y el cuerpo estriado. Una limitación final del procedimiento surge de la eliminación incompleta de la sangre desde el cerebro durante el proceso de perfusión. La sangre puede producir artefactos en el tejido cerebraleso hace que sea difícil de fotografiar y trazar las neuronas.

Técnicas de tinción de Golgi-Cox proporcionan una medida fiable de la morfología dendrítica y neuroanatomía que es útil para una amplia gama de estudios diseñados para examinar los cambios a nivel neuronal. Al examinar la estructura neuronal en la corteza prefrontal después de la estimulación táctil en el periodo postnatal temprano, la tinción de Golgi-Cox reveló un aumento espectacular en la complejidad dendrítica. Los cambios anatómicos relacionados con la estimulación táctil temprana se pueden demostrar visualmente mediante la comparación de la densidad de la espina dorsal de las neuronas piramidales de una rata de control para neuronas piramidales de una rata que se sometió a la estimulación táctil (véase la Figura 1). Además, los parámetros tales como la arborización dendrítica, la longitud dendrítica, y la densidad de la columna vertebral pueden ser calculados y analizados estadísticamente para generar datos continuo que puede ser comparado a través de los animales. Para generar resultados fiables, el análisis debe llevarse a cabo en la mañanainimum de tres animales por grupo de tratamiento y aproximadamente cinco neuronas por hemisferio debe ser seleccionado al azar para cada región del cerebro que se analiza. Figura 2 demuestra la complejidad dendrítica (espinas / m x m de dendritas) de los animales que recibieron la estimulación y los animales que no lo hicieron táctil . En los dos campos apicales y basales de las neuronas analizadas desde el córtex prefrontal medial (CG3), estimulación táctil se tradujo en la proliferación de los parámetros neuronales.

Figura 1. Fotografía A. Representante de Golgi-Cox manchada neurona piramidal de la capa III de la zona CG3 en una rata que recibió estimulación táctil durante el desarrollo. B. Representante amplíe (1.000 X) fotografía de espinas dendríticas en las dendritas de terminales en el campo de la basilar CG3 ; la imagen más clara de la izquierda es para una rata en el grupo de control y la imagen más oscura en la RIght es de una rata que recibió estimulación táctil.

Figura 2. Representación ilustrativa de la complejidad dendrítica apical y basilar media (espinas / m x m) para las neuronas en el área CG3 de ratas adultas que, o bien recibieron estimulación táctil durante el desarrollo o no lo hicieron (* p <0,01).

Discusión

Debido a la plasticidad explícita del cerebro en desarrollo, es importante que los procedimientos experimentales con experiencias tempranas son revisados ​​a fondo y se hacen intentos de controlar todas las variables que intervienen. Por esta razón, un diseño de camada cruz se emplea durante el procedimiento de estimulación táctil para asegurar que los cachorros están recibiendo experiencias similares en todos los demás dominios de desarrollo. Además, también es importante que múltiples crías de varias camadas, se seleccionan para el análisis para evitar la posibilidad de que los efectos son el resultado de un sesgo en una sola cría o arena.

Se cree que la estimulación táctil para imitar el comportamiento de la madre natural, lamiendo y aseo personal, que se cree que es beneficioso para el desarrollo de la descendencia. Aunque investigaciones anteriores han hecho hincapié en la primera semana de vida (P0-P7) es un período crítico para lamer y aseo ^16, la magnitud del cambio se identificará según 18 días de tactile estimulación puede implicar que aunque existen momentos sensibles, la exposición ya es superior. También es importante tener en cuenta que los cachorros que recibieron estimulación táctil en este paradigma experimental también experimentan lamiendo y aseo por sus madres, por lo tanto, la estimulación táctil es en adición a la estimulación normal de administrado por la madre. Por último, también hay que ser conscientes de los cambios de región que dependen. Aunque la estimulación táctil durante el desarrollo de la mayor complejidad dendrítica en la corteza prefrontal, esto no garantiza que los cambios estructurales de esta naturaleza serán evidentes en todas las regiones del cerebro. Es posible que la morfología neuronal en otras regiones del cerebro tales como la corteza parietal, respondería de una manera notablemente diferente a la misma experiencia. Sin embargo, debido a que el procedimiento de estimulación táctil es fácil de administrar y no representa ningún riesgo para la descendencia o presas, tiene el potencial de servir como una herramienta valiosa para muchos estudios de investigación destinados a mejorar el desarrolloAl resultados.

Con respecto a la tinción de Golgi-Cox de tejido cerebral, los pasos críticos para la visualización con éxito de células neuronales son los siguientes: 1) debe existir una adecuada perfusión del cerebro con solución salina. Perfusión inadecuada o insuficiente de los resultados de tejido cerebral en los artefactos de los vasos sanguíneos que hacen que sea difícil de visualizar en realidad células neuronales a través del laberinto de los vasos sanguíneos, al tiempo que complica la capacidad de fotografiar las neuronas teñidas. 2) cerebros perfundidos se deben almacenar en solución de Golgi-Cox y solución de sacarosa en la oscuridad. Almacenamiento del tejido cerebral en la oscuridad reduce la tinción de fondo del tejido, incrementando de nuevo la oportunidad de visualizar con éxito las células neuronales de calidad. 3) El tejido cerebral se almacena en solución de sacarosa tras el almacenamiento de 14 días en solución de Golgi-Cox. Cuando el tejido se sumerge en la solución de sacarosa al 30% durante 2-5 días, los cerebros son más flexibles que impide rompiendo y el desgarro de las secciones cuandode corte. Es importante evitar que el tejido cerebral de que queda en la solución de sacarosa para el aumento de períodos de tiempo (a menos que la solución de sacarosa se sustituye continuamente con solución fresca) porque el almacenamiento prolongado en sacarosa reduce la calidad de la tinción. 4) Por último, una vez que las diapositivas han sido manchada y cubierta deslizado, se les debe dar suficiente tiempo para secarse antes de la visualización con un microscopio. Si no están permitidas las diapositivas para ventilar adecuadamente seco, el tejido puede oscurecerse, reduciendo la visualización satisfactoria de las neuronas corticales.

Se cree que los cambios estables en funcionamiento psicológico y las respuestas de comportamiento que se producen en respuesta a las experiencias para ser facilitado por la reorganización de la morfología neuronal y conectividad sináptica ^17. Como estos cambios estructurales proporcionan un recurso medible para la plasticidad dependiente de la experiencia, el uso de un procedimiento de tinción fiable es importante. Procedimiento de tinción de Golgi-Cox basado Esta vibratome ofrece mancha fiableción de las ramas finas y las espinas dendríticas que pueden no ser evidentes con otros protocolos como celoidina-incrustación. El distintivo del procedimiento de Golgi-Cox se debe a su capacidad única para teñir una pequeña fracción de los elementos neuronales (1-10%), lo que permite el seguimiento de las neuronas individuales para las largas distancias. A pesar del hecho de que sólo una pequeña fracción de las neuronas están impregnadas con la tinción, las células que se representan visible, mantienen todas las características incluyendo cuerpo celular, dendritas, espinas dendríticas y axones. Por otra parte, cuando el procedimiento de tinción se lleva a cabo correctamente, las células teñidas se destacan con claridad y distinción sobre un fondo transparente, ya otras estructuras corticales permanecen sin teñir y transparente. Debido a la comprensión de que los cambios persistentes en funcionamiento hacia el exterior deben estar relacionados con la plasticidad del sistema nervioso, es decir, la capacidad de las neuronas para modificar su estructura y la conectividad, el procedimiento de tinción de Golgi-Cox proporciona a los investigadores unatécnica fiable para visualizar y cuantificar la plasticidad.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium Dichromate	Fisher	P188
Mercuric Chloride	Fisher	M1561
Potassium Chromate	Fisher	P220
Ammonium Hydroxide	Fisher	A669-500
Kodak Rapid Fix	Vistek	Kodak 146 4016
EtOH-95 & Anhydrous	Commercial Alcohols	No Cat Numbers	All other Et-OH are dilutions
Swiffers- Soft Feather-Like dusters	Safeway		Can be found at most grocery stores
Sucrose	Sigma-Aldrich	S-9378
HemoDe	Electron Microscopy Sciences	23410
Permount	Fisher	Sp15
Slides	VWR	160004-365
Coverslips	VWR	062011-9