Golgi-Cox Boyama ile dendritik morfoloji ve sinaptik bağlantı üzerinde olumlu bir Erken Deneyimi, Tactile uyarılması Etkileri, görselleştirme

Özet

Bu kağıt sıçan yavrularının dokunsal uyarım ve nöronal morfoloji sonraki Golgi-Cox boyama işlemleri anlatılmaktadır. Dokunsal uyarım bir ev silgi ile yavrular okşayarak tarafından perinatal dönemde uygulanır olumlu bir deneyim olduğunu. Golgi-cox boyama tüm nöronların görüntülenmesine olanak güvenilir bir işlemdir.

Özet

Davranışlarında uzun dönemli değişiklikleri oluşturmak için, deneyimleri nöronal morfoloji ve sinaptik bağlantı istikrarlı değişiklikleri üreten gerekir. Tactile stimülasyon taklit yalama ve sıçan damat anne olumlu bir erken deneyimdir. Bu olumlu bir deneyim sıçan yavrular açığa böyle bir ev silgi gibi son derece erişilebilir malzemeler kullanılarak kolayca ve maliyet-etkin bir şekilde tamamlanabilir. Çapraz çöp tasarım kullanarak, yavrular ya 15 dakika, perinatal dönem boyunca, günde üç kez, okşadı veya rahatsız bırakılır. Bu olumlu bir erken deneyimle ilişkili nöroplastik değişiklikleri ölçmek için, beyin dokusunun Golgi-Cox boyama kullanılmaktadır. Golgi-Cox emdirme yerine tüm hücreleri daha nöron ayrı bir dizi leke gerçeği nedeniyle, Golgi-Cox çözeltisi ile kemirgen beyin boyama hücre gövdesi, dendrit aksonlar dahil tüm nöronal elementlerin görselleştirme izin verir, ve dendritik dikenler. Boyama işlemi is birkaç gün içinde yürütülen ve araştırmacı detaylara çok dikkat gerektirir. Boyama tamamlandıktan sonra, ancak, tüm beyin emprenye edilmiş ve devam eden analiz için süresiz muhafaza edilebilir. Bu nedenle, Golgi-Cox boyama deneyim-bağımlı plastisitesini eğitim için değerli bir kaynaktır.

Giriş

Böyle perinatal stres ^1,2, duyusal yoksunluk ³ ve ilaç toksisitesi ⁴ olarak beyin olgunlaşması üzerinde olumsuz erken deneyimlerin incelenmesi için birçok rapor ve kullanılan teknikler olmasına rağmen, olumlu deneyimlerin etkilerini incelemek için kullanılan çok az metodolojileri vardır Bu süre. Yanı sıra, çevre zenginleştirmeden, dokunsal uyarım etkileri gösterdi ⁵ ile tedavi arttırıcı birkaç beyin biridir. Tactile uyarım yalama ve tımar maternal sıçan davranışını taklit eden, deriye duyusal uyarma yöntemidir. Olumlu bir manipülasyon olarak genel kabul dokunsal uyarım prematüre bebeklerde ve yenidoğan ratlarda ⁶ olgunlaşmasını geliştirilmiş belirten çalışmalardan kaynaklanmaktadır. Buna ek olarak, Meaney laboratuarda ⁷ araştırma maternal yalama ve bakım daha yüksek seviyeleri yavru olumlu sonuçlarla bağlantılı olduğunu göstermiştir. T sayesindeHese olumlu etkiler, dokunsal uyarım hızla, anksiyete ⁸ azaltarak beyin hasarı ^9-11 ile ilişkili sonuçların iyileştirilmesi ve uyuşturucu hassasiyete ¹² alçaltarak amaçlayan bir iyileştirici stratejisi haline. Gibi, dokunsal uyarım dramatik nöronal morfoloji ve gelişmekte olan beynin sinaptik bağlantı yeniden düzenlemek için kanıtlanmış yeteneği ile pozitif erken deneyimleri tanıtımı için değerli bir tekniktir.

Incelemek ve nöronal morfoloji değişiklikleri ölçmek amacıyla, bu sağlam nöronlar görselleştirmek için gereklidir. Golgi-Cox boyama işlemi tamamlandı nöronların ¹³ az sayıda ayrık boyanmasını sağlayan 1800'lerin sonunda yayınlanan Camillo Golgi tekniğinin bir değişikliktir. Prosedür rastgele ve uyarlık yaygın ce de dahil olmak üzere büyük kusur, tüm nöronal elemanın küçük emprenye oranı izinleri görselleştirme, olarak anılan nöronların leke için görünür, ancakll organları, dendritler, dendritik dikenler ve aksonlar. Benzer şekilde, Golgi solüsyonu ile emprenye edilmesi, belirli bir beyin için gereken zaman da bir düşüş olarak atıf edilmiştir. Ancak, boyama, tam doku süresiz korunmuş olabilir, ve bir mikroskop ile nöronların beyin ve görselleştirme perfüzyon arasındaki süre en az 21 gün içinde tamamlanabilir bir kez, süre mantıksız olmadığını verilen. Buna ek olarak, protokol küçük değişikliklerle, Golgi-Cox boyama etkin bir şekilde tüm yaş aralıkları kemirgenler beyinleri emprenye edilmesi için de kullanılabilir. Yapısal düzeyde değişiklikler davranışsal ve psikolojik işleyişi kalıcı değişikliklere bağlı olduğu gibi, Golgi-Cox boyama tekniği nöroplastisiteyi ölçmek için değerli bir araç ile araştırmacılar sağlar.

Protokol

Tüm deneyler Hayvan Bakımı Kanada Konseyi çerçevesinde yürütülen ve Lethbridge Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı.

1.. Damızlık ve Tactile Uyarım

1. Ortak hayvan tedarikçilerden hamile fareler sipariş veya standart laboratuvar üreme prosedürleri kullanarak evde yavrular doğurmak.
2. House, 12:12 saat ışık tutulan bir sıcaklık kontrollü bir yetiştirme odasında (21 ° C), tüm hayvanları: karanlık döngüsü ve yiyecek ve su ad libitum erişim sağlar.
3. ayrı ayrı kendi yavruları ile yavrular doğar, ev dişi sıçanlar.
4. Doğumdan hemen sonra işleme ilişkin ek stres önlemek için, P3 yavruların dokunsal uyarılması başlar.
5. Dokunsal uyarım P3-P21 günde üç kez (09:00, 01:00 ve 16:00) yapılmalıdır ve yavrular P21 annelerinden sütten edilmelidir.
6. Çapraz çöp tasarım kullanırken, yavruların yarısı from her çöp, diğer yarısı kontrol olarak hizmet veren dokunsal uyarım uğrayacaktır. Rastgele her grup erkek ve dişi yavruların eşit numaraları atayabilirsiniz. , Dokunsal uyarım ve kontrolleri geçiren yavrular ayırt onların arka ayakları ve kuyruğu üzerinde kalıcı bir kalem ile yavruların bir grup işaretlemek için. İşaretleme her gün tekrar uygulanmalıdır.

Tactile Stimülasyon

7. Onların evde kafes baraj çıkarın ve gıda ve su ile geçici bir kafese koyun. Üreme / konut oda baraj ve geçici kafesini tutun.
8. Önce sabah dokunsal uyarım oturumda (9:00) bir grup olarak sıçan yavrular tartılır. Her oturum için, ulaşım sıçan dokunsal uyarılar için ayrı bir test odası evlerine kafesleri yavrular. 24 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığı ev kafes yerleştirin
9. Iki parçaya ev kafes bölmek için sert bir tahta kullanın. Diğer yarısında dokunsal uyarım grubu bir buçuk ve kontrol yavrular sıçan yavrular yerleştirin.15 dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın.
10. Yumuşak tüy gibi toz bezi kullanarak, 15 dakika boyunca arka arkaya aynı anda uyarma dokunsal gruptaki tüm yavrular fırça. Genç sıçan yavrular (~ P3-P12) ususally bir araya toplamak ve bu çok kolay bir kerede tüm yavrular teşvik yapma derin bir uyku döngüsü girmek için görünür. Yavrular yaş olarak, bazı yavrular yürüyüş ve oturum sırasında soruşturma ile, daha aktif hale gelir. Deneyci sürekli her yavru eşit uyarılması almasını sağlamak için gruba dolaşıp yavrular hareket etmelidir.
11. 15 dk oturumu tamamlandıktan sonra, geri üreme odasına yavrular taşıma ve kafesine anne dönün.
12. Dokunsal stimülasyon 19 gün boyunca bu işlemi, günde üç kez tekrarlayın. P21 de nihai dokunsal uyarım seansından sonra, yavrular annelerinden sütten edilmelidir. Yavrular sonra aynı cinsten 5 ya da 6 sütten başka hayvanlar ile kafeslerde muhafaza edilmelidir.
13. Sıçanlar hiçbir ek test geçiyor, bunlar un bırakılmalıdırgıda ve (bir kenara düzenli kafes temizlik ve taşıma itibaren) onlar yaş yaklaşık 100 gün gelene kadar, su ad libitm erişimi olan karanlık döngüsü: Normal ışık, rahatsız. Diğer deney yapılan manipülasyonlar ise, hayvanların bu laboratuar protokollere uygun olarak tedavi edilebilen veya test edilmelidir.

2. Kurban ve Golgi-Cox Boyama

1. Yaklaşık P100, sıçanlara IP enjeksiyon yoluyla sodyum pentobarbital aşırı dozda uygulanması ve% 0.9 tuzlu su içinde, yaklaşık 100 ml intrakardiyak serpmek.
2. Perfüzyon tamamlandığında beyinleri ekstrakte edin. Sağlam beyincik tutmak için çaba altında optik sinirlerin kesilmesi, kafatası beyin çıkarın; araştırmacılar koku ampuller tutmak veya kaldırmak için seçebilirsiniz. Golgi-Cox solüsyon ¹⁴ 20 ml opak Nalgene şişede ekstre beyinleri yerleştirin.
3. 14 gün için Golgi-Cox çözelti içinde beyinleri tutun. 14 gün sonra, Golgi-C yerine% 30 sukroz çözeltisi ile öküz çözeltisi. Kesit önce 2-5 gün sukroz çözeltisi içinde beyinleri tutun.

Not: beyin sakaroz çözeltisine transferi 14 gün içinde bölümlere edilemiyorsa, araştırmacının% 30 sukroz, yeni bir stok ile sukroz değiştirmek gerekmektedir. Araştırmacı boyama üzerinde hiçbir olumsuz etkisi ile 4 ay boyunca sakaroz iki haftada değiştirebilir.

4. Bölüm beyin için, beyin kuru lekelenir olmalıdır ve cyanocacrylic yapıştırıcı ile kesit aşamasına giderildi. Yırtılma veya düzensiz bölümlendirilmeleri önlemek için, araştırmacı dikkatli olmak ve tüm beyin sıkıca aşamasına güvenli olduğundan emin olmalısınız.
5. Vibratome rezervuar kesit bıçağı kapsayan bir seviyeye% 6 sukroz çözeltisi ile doldurulmalıdır. 5 bir hız ve genlik, (her ikisi de ölçeklerde orta noktası) için vibratome parametrelerini ayarlayın. 200 mikron bölüme beyin dilimleyin ve 2% jelatinleşmiş mikro ilgili bölümleri yerkapsam slayt. Kesit boyunca ıslak bölümleri tutmak için emin olun.
6. Ilgi tüm bölümleri toplanmıştır zaman, nemli emici kağıt ile slaytlar basınç uygulayarak slaytlar üzerine bölümleri basın. Onlar lekeli hazır olana kadar nem odasında bir slayt rafa slaytlar saklayın. Bunlar 4 günden daha fazla, en az 12 saat boyunca nem odasında kalır, ancak olmamalıdır. Slaytlar nemli olması gerekir ve kurumasına izin verilmemelidir.
7. Boyama işlemine başlamadan önce boyama alayını hazırlayın. Etiket on iki cam boyama tabaklar, aşağıdaki şekilde (10.7 x 8.5 x 6.8 cm) ve işlem:
   1. Distile Su - 1 dk
   2. Amonyum hidroksit - 30 dakika (karanlıkta)
   3. Distile Su - 1 dk
   4. (Karanlıkta) - 30 dakika Kodak Film için Fix
   5. Distile Su - 1 dk
   6. % 50 Alkol - 1 dk
   7. % 70 Alkol - 1 dk
   8. % 95 Alkol - 1 dk
   9. % 100 Alcohol - 5 dk
   10. % 100 Alkol - 5 dk
   11. Çözüm (1/3 Kloroform, 1/3 HemoDe, 1/3 100% Alcohol) - 15 dk
   12. HemoDe - 15 dk

* Ksilen HemoDe bölgesinin yerine kullanılabilir. Sürekli boyama kalitesini sağlamak amacıyla, taze solüsyon işlenen her bir slayt raf için kullanılmalıdır.

8. HemoDe son 15 dakika emersion ardından, Permount ile slaytlar lamel.
9. Mikroskopla inceleyerek önce kuru hava slaytlar izin verin.

Sonuçlar

Bu boyama işlemi uygun takip edildiğinde, tutarlı ve düzgün dendritler boyama ve dikenleri oluşturulur. Golgi-Cox nöronal lekelenme bir temsili için Şekil 1'e bakınız. Bu prosedür kesintisiz şu doku gömme dendritik alanların yeni in vitro yöntemler geliştirilmiş ve izin verebilir görselleştirme karşılaştırılabilir boyanma üretir. Golgi-Cox boyanması için vibratome temelli bir yöntem ile boyanarak göre terminal şube ve piramidal nöronlar daha yaygın boyama üretmek için bulunmuştur ya celloidin gömülmüş ve kriyostat kesit doku, ^15. Boyanma bu yöntem tüm beyin impregnates çünkü Ayrıca, tüm bölümleri hemen ya da ileride analiz edilebilir. Morfolojik değişim yeri özgün bir hipotez oluşturma sırasında her zaman açık değildir gibi, bu işlem ek beyin bölgelerinde keşif için izin veren bird gelecekte yararlı olabilir doku bertaraf önler.

Bu boyama yöntemi herhangi bir yaşlı sıçan beyinlerinde (P0-yaşlılık) güvenilir boyanması için kullanılabilir. Genç beyinleri (<1 gram) boyama, ancak, beyin yalnızca yerine yetişkin beyin için tavsiye edilen 14 gün, 6 gün için Golgi-Cox çözelti içinde kalması gerekir, tüm diğer işlemler sabit tutulur. Bu Golgi-Cox boyama işlemi sırasında karşılaşılabilecek ana zorluk talamus dahil olmak üzere merkezi beyin bölgelerinde, yüksek kaliteli boyamayı üretmek için yetersizliğidir. Tüm beyin aynı anda emprenye edilmiş olduğu gibi, orta bölgelerinde leke ideal konsantrasyonları alamazlar. Bu bulguya rağmen, Golgi-Cox teknik, hipokampus ve striatum gibi subkortikal bölgelerin olağanüstü boyama üretir. Prosedürün son bir sınırlama perfüzyon işlemi sırasında beyin kan tamamlanmamış ayrılması ile ortaya çıkar. Kan beyin dokusunda eserler üretebilirBu zor nöronlar fotoğraflamak ve iz yapar.

Golgi-Cox boyama teknikleri nöronal düzeyde değişiklikleri incelemek için tasarlanmış çalışmaların geniş bir yelpazede için yararlıdır dendritik morfoloji ve nöroanatomisi güvenilir bir ölçüsünü sağlar. Erken doğum sonrası dönemde dokunsal stimülasyonunu izleyen prefrontal kortekste nöronal yapısı incelendiğinde, Golgi-Cox boyama dendritik karmaşıklığı dramatik bir artış ortaya koymuştur. Erken dokunma uyarısına ilgili anatomik değişimler (bkz. Şekil 1) dokunma uyarım uygulanan bir sıçandan piramidal nöronlar için bir kontrol sıçan piramidal nöronların omurga yoğunluğu karşılaştırılarak görsel olarak gösterilebilir. Buna ek olarak, bu tür dendritik arborization, dendritik uzunluğu ve omurga yoğunluk gibi parametreler hesaplanmıştır ve hayvanlar arasında istatistiksel olarak karşılaştırılabilir sürekli veri üretmek için analiz edilebilir. Güvenilir sonuçlar üretmek için, analiz am yapılmalıdırTedavi grubu başına üç hayvan ve hemisfer başına yaklaşık beş nöronların yayilan rastgele analiz edilen her bir beyin bölgesi için seçilmelidir. Şekil 2, bu dendritik karmaşıklığı dokunma stimülasyon olup mi hayvanlar almış olan hayvanların (dendrit dikenleri / um x um) göstermektedir . MPFC (CG3) analiz nöronların hem apikal ve baziler alanlarında, dokunsal nöronal uyarım parametrelerinin çoğalmasına neden olmuştur.

Şekil 1. Golgi Cox A. Temsilcisi fotoğraf geliştirme sırasında dokunsal uyarım alınan bir sıçan alan CG3 tabakası III piramidal nöron boyandı. B. Örnek CG3 baziler alanında Terminal dendritler dendritik dikenler (1.000 X) fotoğraf büyütülmüş , soldaki açık bir görüntü, kontrol grubunda ise bir sıçan ve ri üzerinde koyu bir resim içinGHT dokunsal uyarılmamış bir sıçan değil.

Şekil 2. Ya da (* p <0.01) gelişimi sırasında dokunma stimülasyon alınan veya vermedi yetişkin farelerin CG3 alanında nöronlar için ortalama apikal ve baziler dendritik karmaşıklığı (dikenler / um x um) açıklayıcı gösterimi.

Tartışmalar

Gelişmekte olan beynin açık plastisite nedeniyle, erken deneyimleri içeren deneysel prosedürleri iyice gözden geçirilir ve girişimleri tüm müdahale değişkenler için kontrol yapılmış olması önemlidir. Bu nedenle, bir çapraz çöp tasarım yavruların gelişiminin tüm diğer etki benzer deneyimleri almalarını sağlamak için dokunsal uyarım işlemi sırasında kullanılır. Buna ek olarak, çok sayıda litre birden yavrular etkiler, tek bir yavru veya çöp bir önyargı sonucu olasılığını önlemek için analiz için seçilir olması da önemlidir.

Dokunsal uyarım yalama ve yavru gelişimi için yararlı olduğu düşünülmektedir ki, tımar, doğal olarak oluşan annelik davranışlarını taklit inanılmaktadır. Önceki bir araştırma yaşamın ilk haftası (P0-P7) ¹⁶ yalama ve bakım için kritik bir dönem olduğu vurgulanmaktadır olmasına rağmen, değişim sırf büyüklüğü ta 18 gün sonra tespitctile stimülasyon duyarlı kez bulunmasına rağmen, uzun pozlama üstün olduğunu ima edebilir. Bu deneysel paradigma dokunsal uyarım alan yavrular da dolayısıyla dokunsal uyarım anne tarafından yönetilen normal bir uyarılmaya ek olarak, anneleri tarafından yalama ve damat yaşamaya dikkat etmek de önemlidir. Son olarak, aynı zamanda bölge bağımlı değişikliklerin farkında olmalıdır. Gelişimi sırasında dokunsal uyarım prefrontal korteks dendritik karmaşıklığı artmasına rağmen, bu nitelikteki yapısal değişiklikleri tüm beyin bölgelerinde belirgin olacağını garanti etmez. Bu tür parietal korteks gibi diğer beyin bölgelerinde nöronal morfoloji, aynı deneyimi için çarpıcı farklı bir şekilde tepki olasıdır. Dokunsal uyarım prosedür kolayca uygulanır ve yavrular ya da baraj için hiçbir risk teşkil çünkü Ancak, kalkınmayı geliştirmeyi amaçlayan pek çok araştırma için değerli bir araç olarak hizmet potansiyeline sahiptiral belirsizdir.

Aşağıdaki gibi beyin dokusu Golgi-Cox boyanması ile ilgili olarak, nöronal hücre başarılı bir görünüm için önemli adımlar şunlardır: 1) tuz çözeltisi ile, beynin yeterli perfüzyon olmalıdır. Ayrıca lekeli nöronlar fotoğraflamak için yeteneği zorlaştıran ise zor aslında, kan damarlarının labirent aracılığıyla nöronal hücreleri görselleştirmek için yapmak kan damarı eserler beyin dokusu sonuçlarının yanlış veya yetersiz perfüzyon. 2) perfüze beyinleri Golgi-Cox çözeltisi ve karanlıkta sukroz çözeltisi içinde saklanmalıdır. Karanlıkta beyin dokusu depolanması daha başarılı bir şekilde kaliteli bir nöronal hücrelerini görselleştirme şansı artan doku arka plan boyama azaltır. 3) Beyin dokusu Golgi-Cox çözelti içinde, 14 günlük depolama aşağıdaki sakroz çözeltisi içinde saklanır. Doku 2-5 gün için% 30 sukroz çözeltisi içine daldırıldığında, beyin ve yıkıcı bölme yırtılmasını engeller yumuşadığı zamankesim. Bu (sükroz solüsyonu sürekli olarak taze çözelti ile değiştirildiği sürece) sukroz içinde uzun süreli depolama boyama kalitesini düşürür artış nedeniyle zaman dönemleri için sakroz çözeltisi içinde kalan beyin dokusu önlemek için önemlidir. Slaytlar lekeli edilmiş ve kapağı kayması kez 4) Son olarak, bir mikroskop ile görselleştirme önce kuruması için yeterli zaman verilmelidir. Slaytlar yeterince kuru hava için izin verilmediği takdirde, doku kortikal nöronların başarılı görselleştirme azaltarak, koyulaşabilir.

Deneyimlere tepki olarak ortaya psikolojik işleyişi ve davranışsal tepkilerin istikrarlı değişiklikler nöronal morfoloji ve sinaptik bağlantı ¹⁷ Reorganizasyon kolaylaştırdı olduğuna inanılmaktadır. Bu yapısal değişiklikler deneyim-bağımlı plastisite için ölçülebilir bir kaynak sağlamak gibi, güvenilir bir boyama prosedürünün kullanımı önemlidir. Bu vibratome göre Golgi-Cox boyama işlemi güvenilir bir leke sağlarBöyle celloidin-gömme gibi diğer protokolleri ile belirgin olmayabilir ince dalları ve dendritik dikenler ING. Golgi-Cox prosedürün açıklık sadece uzun mesafeler için tek bir izleme nöronlarının nöronal izin elemanları (% 1-10), küçük bir kısmını leke kapasitesi kaynaklanmaktadır. Nöron sadece küçük bir kısmı leke ile emprenye edilir gerçeğine rağmen, görünür işlenen hücreler, hücre gövdesi, dendrit dendritik dikenler ve akson dahil olmak üzere tüm özellikleri taşır. Diğer kortikal yapılar unstained ve şeffaf kalır çünkü Ayrıca, boyama prosedür doğru yapıldığında, lekeli hücreler şeffaf bir arka plana karşı açık ve seçik olarak göze çarpıyor. Dışa doğru işleyişi kalıcı değişiklikler, sinir sisteminin plastisite ile ilişkili olması gerektiğini gerçekleştirilmesi nedeniyle, yapı ve bağlantı değiştirmek için nöronların yeteneği, yani, Golgi-Cox boyama işlemi ile araştırmacılar sağlayan birBu plastisitesini görselleştirmek ve ölçmek için güvenilir bir tekniktir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium Dichromate	Fisher	P188
Mercuric Chloride	Fisher	M1561
Potassium Chromate	Fisher	P220
Ammonium Hydroxide	Fisher	A669-500
Kodak Rapid Fix	Vistek	Kodak 146 4016
EtOH-95 & Anhydrous	Commercial Alcohols	No Cat Numbers	All other Et-OH are dilutions
Swiffers- Soft Feather-Like dusters	Safeway		Can be found at most grocery stores
Sucrose	Sigma-Aldrich	S-9378
HemoDe	Electron Microscopy Sciences	23410
Permount	Fisher	Sp15
Slides	VWR	160004-365
Coverslips	VWR	062011-9