Visualizar os Efeitos de uma experiência precoce positiva, Tátil Estimulação, em dendríticas Morfologia e Synaptic conectividade com Golgi-Cox Coloração

Resumo

Este documento descreve os procedimentos para a estimulação tátil de filhotes de ratos e posterior coloração de Golgi-Cox da morfologia neuronal. A estimulação tátil é uma experiência positiva que é administrada no período perinatal por acariciar filhotes com um espanador doméstico. Coloração de Golgi-cox é um processo fiável que permite a visualização dos neurónios inteiras.

Resumo

Para gerar mudanças de longo prazo no comportamento, experiências devem ser estáveis ​​produzindo mudanças na morfologia neuronal e conectividade sináptica. A estimulação tátil é uma experiência inicial positiva que imita materna lambendo e aliciamento no rato. Expondo filhotes de ratos para esta experiência positiva pode ser concluída de forma fácil e econômica, utilizando materiais altamente acessíveis, tais como um espanador doméstico. Usando um projeto cross-ninhada, os filhotes são ou acariciou ou deixado em repouso, por 15 minutos, três vezes por dia durante o período perinatal. Para medir as mudanças de neuroplasticidade relacionados com esta experiência inicial positiva, é utilizado Golgi-Cox coloração do tecido cerebral. Devido ao facto de Golgi-Cox impregnação cora um número discreto de neurónios, em vez de todas as células, a coloração do cérebro de roedores com solução de Golgi-Cox permite a visualização de elementos neuronais inteiros, incluindo o corpo da célula, os dendritos, axónios e espinhas dendríticas. O procedimento i coloraçãos realizados ao longo de vários dias e exige que o pesquisador preste muita atenção aos detalhes. No entanto, uma vez que a coloração é concluído, a totalidade do cérebro foi impregnada e pode ser preservado indefinidamente para análise contínua. Portanto, a coloração de Golgi-Cox é um recurso valioso para o estudo de dependentes de experiência plasticidade.

Introdução

Embora existam muitas técnicas relatadas e utilizados para a análise das primeiras experiências negativas na maturação do cérebro, como o stress perinatal ^1,2, privação sensorial ³ e toxicidade de drogas ^4, há muito poucas metodologias empregadas para examinar os efeitos de experiências positivas em este período de tempo. Além de enriquecimento ambiental, estimulação táctil é um dos poucos cérebro, melhorando os tratamentos com efeitos demonstrados ^5. A estimulação tátil é um método de estimulação sensorial para a pele que imita o comportamento de ratos materna, lambendo e aliciamento. Sua aceitação geral como uma manipulação positiva surge a partir de estudos que indicam que a estimulação tátil melhorado maturação de recém-nascidos prematuros e ratos recém-nascidos ^6. Além disso, a pesquisa no laboratório Meaney ⁷ demonstrou que os níveis mais elevados de lamber materna e aliciamento estão ligados a resultados positivos na prole. Devido a tinfluências positivas stas, estimulação tátil evoluiu rapidamente em uma estratégia de remediação que visa reduzir a ansiedade ^8, melhorando os resultados associados com lesão cerebral ^9-11, e atenuação de sensibilização da droga ^12. Como tal, a estimulação tátil é uma técnica valiosa para a promoção de primeiras experiências positivas, com uma capacidade comprovada para reorganizar drasticamente morfologia neuronal e conectividade sináptica do cérebro em desenvolvimento.

De modo a examinar e quantificar as alterações na morfologia neuronal, é necessário visualizar os neurónios intactos. O procedimento de coloração de Golgi-Cox é uma modificação da técnica de Camillo Golgi publicado no final de 1800 que fornece coloração discreta de um pequeno número de neurônios completos ^13. Embora o procedimento parece manchar os neurônios de forma aleatória e reprodutibilidade é comumente citado como grande falha, a visualização permite taxa de impregnação pequena de todo o elemento neuronal, incluindo cecorpos ll, dendritos, espinhas dendríticas e axônios. Da mesma forma, o tempo necessário para impregnar um dado cérebro com solução de Golgi, também tem sido citado como uma queda. No entanto, dado que uma vez que a coloração é tecido completo pode ser preservado indefinidamente, e o tempo entre a perfusão do cérebro e da visualização dos neurónios com um microscópio pode ser completado em menos de 21 dias, o período de tempo não é razoável. Além disso, com pequenas modificações no protocolo, a coloração de Golgi-Cox pode ser efetivamente usado para impregnar cérebros dos roedores de todas as faixas etárias. Como as mudanças no nível estrutural têm sido associados a modificações persistentes para funcionamento comportamental e psicológica, a técnica de coloração de Golgi-Cox fornece aos pesquisadores uma ferramenta valiosa para medir a neuroplasticidade.

Protocolo

Todas as experiências foram realizadas em conformidade com o Conselho Canadiano de Tratamento Animal e aprovado pela Universidade de Lethbridge, Comité Animal Care.

1. Criação e Tátil Estimulação

1. Encomende ratas prenhes de animais fornecedores comuns ou raça filhotes em casa usando os procedimentos de criação de laboratório padrão.
2. Casa todos os animais em uma sala com temperatura controlada de criação (21 ° C), mantida em uma luz 12:12 hr: ciclo escuro e fornecer acesso a comida e água ad libitum.
3. Quando os filhotes nascem, ratos casa, individualmente com os seus descendentes.
4. Para evitar estresse adicional relacionado com a manipulação imediatamente após o nascimento, começar a estimulação tátil dos filhotes ao P3.
5. Estimulação tátil deve ser realizado três vezes por dia (09:00, 01:00 e 16:00) a partir de P3-P21 e os filhotes devem ser desmamados de suas mães no P21.
6. Quando se utiliza um design ninhada cruz, metade dos filhotes from cada ninhada será submetido a estimulação tátil com a outra metade servindo como controle. Aleatoriamente atribuir um número igual de filhotes machos e fêmeas para cada grupo. Para diferenciar filhotes submetidas a estimulação e controles táteis, marcar um grupo de filhotes de cachorro com um marcador permanente sobre as patas traseiras e cauda. Marcação tem que ser reaplicado a cada dois dias.

Tátil Estimulação

7. Remover barragens de sua gaiola e colocá-los em uma gaiola temporária com comida e água. Mantenha a represa e gaiola temporária na sala de criação / habitação.
8. Pesar os filhotes de rato como um grupo, antes da sessão de estimulação táctil manhã (09:00). Para cada sessão, rato transporte filhotes suas gaiolas de casa para uma sala de ensaio separado para a estimulação tátil. Coloque a gaiola em uma almofada de aquecimento que está definido para 24 ° C.
9. Use uma placa rígida para dividir a gaiola em duas metades. Coloque filhotes de ratos nas táteis estimulação grupo um meio de controle e filhotes a outra metade.Definir um temporizador de 15 min.
10. Usando um espanador-like macio e escovar todos os filhotes do grupo estimulação tátil, ao mesmo tempo, durante 15 minutos consecutivos. Os filhotes de ratos jovens (~ P3-P12) usualmente se amontoam e parecem entrar em um ciclo de sono profundo que torna muito fácil para estimular todos os filhotes de uma só vez. Como a idade filhotes, eles se tornam mais ativas, com alguns filhotes andando e investigar durante a sessão. O experimentador deve se mover continuamente crias errantes no grupo para garantir que cada filhote recebe igual estimulação.
11. Uma vez que a 15 min de sessão é completa, transportar os filhotes de volta para a sala de reprodução e retornar a mãe para a jaula.
12. Repita este processo três vezes por dia, durante os 19 dias de estimulação tátil. Após a sessão de estimulação tátil final no P21, os filhotes devem ser desmamados de suas mães. Os filhotes devem ser alojados em gaiolas com 5 ou 6 outros animais desmamados do mesmo sexo.
13. Se os ratos são submetidos a nenhum teste adicional, que deve ser deixado unperturbada, na luz normal: ciclo escuro com acesso a comida e água ad libitm (além de limpeza gaiola regular e manipulação) até atingirem cerca de 100 dias de idade. Se passando por outras manipulações experimentais, os animais devem ser tratados ou testados de acordo com esses protocolos de laboratório.

2. Sacrifício e Golgi-Cox Coloração

1. Em aproximadamente P100, administrar uma dose excessiva de pentobarbital de sódio através de injecção IP aos ratos e perfundir intracardial com aproximadamente 100 ml de solução salina 0,9%.
2. Extraia o cérebro quando a perfusão for concluída. Remover o cérebro do crânio, o corte do nervo óptico por baixo com um esforço para manter o cerebelo intactas; os pesquisadores podem optar por manter ou remover os bulbos olfatórios. Coloque cérebros extraídos em uma garrafa Nalgene opaco com 20 ml de solução de Golgi-Cox ^14.
3. Mantenha o cérebro em solução de Golgi-Cox por 14 dias. Após 14 dias, substituir o Golgi-Cboi solução com uma solução de sacarose a 30%. Mantenha o cérebro na solução de sacarose por 2-5 dias antes do corte.

Nota: Se o cérebro não pode ser seccionado dentro de 14 dias da transferência para a solução de sacarose, o pesquisador precisa substituir a sacarose com um novo estoque de 30% de sacarose. O pesquisador pode substituir a sacarose a cada duas semanas durante quatro meses, sem efeitos adversos sobre a coloração.

4. A fim de secção do cérebro, o cérebro deve ser seco com papel absorvente e fixo para o palco seccionamento com cola cyanocacrylic. Para evitar a ruptura ou corte irregular, o pesquisador deve ser cauteloso e garantir que todo o cérebro está bem presa ao palco.
5. O reservatório vibratome deve ser preenchido com uma solução de sacarose a 6% para um nível que cobre a lâmina de corte. Defina os parâmetros vibratome a uma velocidade e amplitude a 5, (o ponto médio em ambas as escalas). Fatie o cérebro em 200 mM seções e coloque as seções em um micro gelatinizado 2%slides escopo. Certifique-se de manter as seções molhado durante o curso de corte.
6. Quando todas as seções de interesse foram coletadas, pressione as seções para os slides, aplicando pressão para as lâminas com papel absorvente umedecido. Armazenar os slides em uma porta-lâminas na câmara de umidade até que eles estejam prontos para ser manchada. Eles devem permanecer na câmara úmida por pelo menos 12 horas, mas não mais do que 4 dias. Os slides precisa ser úmido e não devem ser autorizados a secar.
7. Prepare o regimento coloração antes de iniciar o processo de coloração. Etiqueta doze pratos de coloração de vidro (10,7 x 8,5 x 6,8 centímetros) e de processo da seguinte forma:
   1. Água destilada - 1 min
   2. Hidróxido de amónio - 30 min (no escuro)
   3. Água destilada - 1 min
   4. Kodak Correção para Film - 30 min (no escuro)
   5. Água destilada - 1 min
   6. 50% de álcool - 1 min
   7. 70% de álcool - 1 min
   8. 95% de álcool - 1 min
   9. 100% Alcohol - 5 min
   10. 100% de álcool - 5 min
   11. Solução (1/3 do clorofórmio, 1/3 HemoDe, 1/3 100% de álcool) - 15 min
   12. HemoDe - 15 min

* Xileno pode ser utilizado em substituição de HemoDe. A fim de garantir a qualidade da coloração consistente, soluções frescos devem ser utilizados para cada porta-lâminas processado.

8. Após o último 15 min emersão em HemoDe, lamela as lâminas com Permount.
9. Permitir que as lâminas para o ar seco antes de examinar com um microscópio.

Resultados

Quando este processo de coloração foi seguido de forma adequada, a coloração consistente e uniforme de dendritos e espinhas é gerado. Ver Figura 1 para uma representação de coloração neuronal Golgi-Cox. Este procedimento produz coloração que é comparável à visualização dos campos dendríticas que são ininterrupta embutindo tecido seguinte recentemente desenvolvido métodos in vitro e podem permitir. A técnica baseada vibratome para a coloração de Golgi-Cox foi encontrado para produzir coloração mais generalizada de ramos terminais e neurônios piramidais, de coloração com ou incorporado-celoidina e tecido seccionado-criostato ^{de 15.} Além disso, porque este método de coloração impregna todo o cérebro, todas as seções podem ser analisados ​​imediatamente ou no futuro. Como o local da mudança morfológica é que nem sempre é óbvia ao gerar uma hipótese original, este processo permite a exploração de regiões cerebrais adicionais umd impede a eliminação de tecido que pode ser útil no futuro.

Este método de coloração pode ser usado para a coloração confiável de quaisquer cérebros de ratos idosos (idade P0 de idade). No entanto, quando a coloração cérebros jovens (<1 grama), o cérebro deve apenas permanecem na solução de Golgi-Cox durante 6 dias, em vez dos 14 dias recomendados para cérebros adultos, todos os outros procedimentos são mantidos constantes. A principal dificuldade que pode ser encontrada durante o processo de coloração de Golgi-Cox é a incapacidade de produzir a coloração de regiões cerebrais centrais, incluindo o tálamo de alta qualidade. Como todo o cérebro é impregnado, ao mesmo tempo, as regiões centrais pode não receber concentrações ideais de mancha. Apesar desta descoberta, a técnica de Golgi-Cox produz coloração excepcional das regiões subcorticais, tais como o hipocampo e estriado. Uma limitação final do processo decorre de incompleta remoção de sangue do cérebro durante o processo de perfusão. O sangue pode produzir artefatos no tecido cerebralque torna difícil para fotografar e rastrear os neurônios.

Técnicas de coloração de Golgi-Cox fornecer uma medida confiável da morfologia dendrítica e neuroanatomia que é útil para uma extensa gama de estudos destinados a examinar as mudanças no nível neuronal. Ao examinar a estrutura neuronal no córtex pré-frontal após a estimulação tátil no período pós-natal precoce, coloração Golgi-Cox revelou um aumento dramático na complexidade dendrítica. Alterações anatômicas relacionadas com a estimulação tátil precoce pode ser demonstrada visualmente comparando densidade da coluna de neurônios piramidais de um rato controle para piramidal neurônios de um rato que passou por estimulação tátil (veja a Figura 1). Além disso, os parâmetros tais como a arborização dendrítica, dendrítica comprimento, e densidade de espinha podem ser calculadas e analisadas estatisticamente para gerar dados contínua, que podem ser comparados entre os animais. Para gerar resultados confiáveis, a análise deve ser realizada em amínima de três animais por grupo de tratamento e, aproximadamente, cinco neurónios por hemisfério deve ser seleccionado aleatoriamente para cada região do cérebro em análise. Figura 2 demonstra a complexidade dendrítica (espinhas / mM x mM de dendrite) dos animais que receberam estimulação e animais que não táctil . Em ambos os campos apicais e basilar dos neurônios analisados ​​a partir da mPFC (CG3), estimulação tátil resultou na proliferação de parâmetros neuronais.

Figura 1. A. Representante fotografia de um Golgi-Cox manchado neurônio piramidal da camada III da área CG3 em um rato que recebeu estimulação tátil durante o desenvolvimento. B. Representante ampliada (1.000 X) fotografia de espinhas dendríticas nos dendritos terminais na área basilar da CG3 , a imagem mais clara da esquerda é para um rato no grupo de controle ea imagem mais escuro no right é de um rato que receberam estimulação tátil.

Figura 2. Representação ilustrativa da complexidade dendrítica apical e basilar média (espinhas / mM x mm) para os neurónios na área de CG3 de ratos adultos que receberam estimulação táctil ou durante o desenvolvimento ou não (* p <0,01).

Discussão

Devido à plasticidade ostensiva do cérebro em desenvolvimento, é importante que os procedimentos experimentais envolvendo as primeiras experiências são analisadas e são feitas tentativas para controlar todas as variáveis ​​intervenientes. Por este motivo, uma concepção cruzada maca é utilizada durante o procedimento de estimulação táctil ao garantir que os filhotes são recebem experiências similares em todos os outros domínios de desenvolvimento. Além disso, é também importante que os vários filhotes de ninhadas múltiplas são seleccionadas para análise a fim de evitar a possibilidade de que os efeitos resultar de um desvio num cão ou maca.

Estimulação táctil é acreditado para mimetizar o comportamento maternal que ocorre naturalmente, lamber e preparação, que se pensa ser benéfica para o desenvolvimento de descendência. Embora pesquisas anteriores tem enfatizado a primeira semana de vida (P0-P7) para ser um período crítico para lamber e aliciamento ^16, a magnitude da mudança identificada de acordo com 18 dias de taestimulação ctile pode implicar que, apesar de existir momentos sensíveis, mais tempo de exposição é superior. Também é importante notar que os filhotes receberam estimulação táctil neste paradigma experimental também experimentar lambendo e preparação de suas mães, por conseguinte, a estimulação táctil é, para além da estimulação normal, administrados pela mãe. Finalmente, é preciso também estar ciente das mudanças depende de cada região. Embora a estimulação tátil durante o desenvolvimento do aumento da complexidade dendrítica no córtex pré-frontal, isso não garante que as mudanças estruturais desta natureza será evidente em todas as regiões do cérebro. É possível que a morfologia neuronal em outras regiões do cérebro tais como o córtex parietal, que respondem de uma maneira notavelmente diferente para a mesma experiência. No entanto, porque o procedimento de estimulação tátil é facilmente administrado e não representa qualquer risco para a prole ou barragens, que tem o potencial para servir como uma ferramenta valiosa para muitos estudos de investigação que visam melhorar o desenvolvimentoal resultados.

No que diz respeito ao Golgi-Cox coloração de tecidos do cérebro, os passos críticos para visualização bem-sucedida de células neuronais são como se segue: 1) não tem de ser adequada a perfusão do cérebro com uma solução salina. Perfusão inadequada ou insuficiente dos tecidos cerebrais resultados em artefatos dos vasos sanguíneos que o tornam difícil de realmente visualizar células neuronais através do labirinto de vasos sanguíneos, além de complicar a capacidade de fotografar neurônios manchadas. 2) cérebros perfundido deve ser armazenado em solução de Golgi-Cox e a solução de sacarose no escuro. Armazenar o tecido cerebral no escuro reduz a coloração do tecido base, mais uma vez aumentando a oportunidade de visualizar com sucesso células neuronais qualidade. 3) O tecido cerebral é armazenado em solução de sacarose a seguir a 14 dias de armazenamento em solução de Golgi-Cox. Quando o tecido é imerso na solução de sacarose a 30% durante 2-5 dias, os cérebros são mais flexíveis que impede quebra e rasgamento das secções quandocorte. É importante evitar que o tecido cerebral de que permanece na solução de sacarose, por períodos de tempo aumentados (a não ser que a solução de sacarose é continuamente substituída com solução fresca), porque o armazenamento prolongado em sacarose, reduz a qualidade da coloração. 4) Finalmente, uma vez que as lâminas foram manchadas e tampa deslizado, eles devem ser dado tempo suficiente para secar antes de visualização com um microscópio. Se os slides não são permitidas para o ar seco adequadamente, o tecido pode escurecer, reduzindo a visualização bem-sucedida de neurônios corticais.

Mudanças estáveis ​​no funcionamento psicológico e respostas comportamentais que ocorrem em resposta a experiências são acreditados para ser facilitada pela reorganização da morfologia neuronal e conectividade sináptica ^17. Como estas alterações estruturais proporcionar um recurso para mensurável dependente da experiência plasticidade, a utilização de um procedimento de coloração de confiança é importante. Procedimento de coloração de Golgi-Cox baseado Este vibratome fornece mancha confiáveling de galhos finos e espinhas dendríticas que podem não ser evidentes com outros protocolos como celoidina-incorporação. A peculiaridade do processo de Golgi-Cox decorre de sua capacidade de manchar apenas uma pequena fração dos elementos neuronais (1-10%), o que permite o rastreamento de neurônios individuais para longas distâncias. Apesar do fato de que apenas uma pequena fração dos neurônios são impregnadas com a mancha, as células que são processados ​​visível, manter todos os recursos, incluindo corpo celular, dendritos, espinhas dendríticas e axônios. Além disso, quando o procedimento de coloração é realizado corretamente, as células marcadas destacam-se claramente e distintamente contra um fundo transparente, porque outras estruturas corticais permanecem unstained e transparente. Devido à constatação de que alterações persistentes no funcionamento exterior deve estar relacionada com a plasticidade do sistema nervoso, ou seja, a capacidade dos neurônios para modificar sua estrutura e conectividade, o procedimento de coloração de Golgi-Cox fornece aos pesquisadores umatécnica confiável para visualizar e quantificar essa plasticidade.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium Dichromate	Fisher	P188
Mercuric Chloride	Fisher	M1561
Potassium Chromate	Fisher	P220
Ammonium Hydroxide	Fisher	A669-500
Kodak Rapid Fix	Vistek	Kodak 146 4016
EtOH-95 & Anhydrous	Commercial Alcohols	No Cat Numbers	All other Et-OH are dilutions
Swiffers- Soft Feather-Like dusters	Safeway		Can be found at most grocery stores
Sucrose	Sigma-Aldrich	S-9378
HemoDe	Electron Microscopy Sciences	23410
Permount	Fisher	Sp15
Slides	VWR	160004-365
Coverslips	VWR	062011-9