골지 콕스 염색과 돌기​​ 형태와 시냅스 연결에 대한 긍정적 인 초기 경험, 촉각 자극의 효과를 시각화

요약

이 논문은 쥐의 새끼의 촉각 자극과 신경 세포의 형태의 후속 골지 - 콕스 염색에 대한 절차를 설명합니다. 촉각 자극은 가정용 먼지 떨이로 새끼를 쓰다듬어하여 주 산기 투여되는 긍정적 인 경험이다. 골지 - 콕스 염색은 전체 신경 세포의 시각화를 허용하는 신뢰할 수있는 절차입니다.

초록

행동의 장기적인 변화를 생성하기 위해, 경험은 신경 세포의 형태와 시냅스 연결의 안정적인 변화를 생산해야합니다. 촉각 자극은 모방이 핥고 쥐에 정리 임산부 긍정적 인 초기 경험이다. 이 긍정적 인 경험에 쥐 새끼를 노출하는 등 가정용 먼지 떨이로 매우 액세스 할 재료를 사용하여 쉽고 비용 효율적으로 완료 할 수 있습니다. 크로스 쓰레기 디자인을 사용하여, 새끼는 하나 15 분, 주 산기 기간 동안 하루에 3 회, 쓰다 또는 그대로 남아 있습니다. 이 긍정적 경험을 일찍 관련된 neuroplastic 변화를 측정하기 위해, 뇌 조직의 골지 - 콕스 염색법이 이용된다. 골지 - 콕스 함침 오히려 모든 셀보다 뉴런의 이산 개수 얼룩이 있다는 사실로 인해, 골지체-콕스 용액 설치류 뇌 염색 세포체, 수상 돌기, 축색 포함한 전체의 연결 요소의 시각화를 가능하게하고, 돌기 쪽. 염색 절차 나의 몇 일 동안 실시하고, 연구자가 세부 사항에주의해야합니다. 염색이 완료되면 그러나, 뇌 전체가 함침되어 지속적인 분석 무기한 보존 될 수있다. 따라서, 골지 - 콕스 염색 경험에 의존하는 가소성 연구를위한 귀중한 자원이다.

서문

같은 주 산기 스트레스 ^{1, 2,} 감각 박탈 ^3, 약물 독성 ^4와 같은 뇌의 성숙에 부정적인 초기 경험의 시험에 대한 많은보고 및 활용 기술이 있지만, 긍정적 인 경험의 영향을 조사하기 위해 고용 거의 방법이 있습니다 이 기간. 이외에도 환경 농축에서, 촉각 자극 효과를 입증 ^5와 치료를 강화하는 몇 가지 두뇌의 하나입니다. 촉각 자극은 핥는 정리, 산모 쥐의 동작을 모방 피부에 감각 자극하는 방법입니다. 긍정적 인 조작 등의 일반적인 수용은 촉각 자극이 미숙아 및 신생아 쥐 ^(6)의 성숙을 향상 것을 나타내는 연구에서 발생한다. 또한, Meaney 연구소 ⁷ 연구는 산모 핥아과 정리의 높은 수준이 자식의 긍정적 인 결과에 연결되어 있음을 보여 주었다. t으로 인해HESE 긍정적 인 영향은, 촉각 자극은 빠르게, 불안 ⁸ 감소 뇌 손상 ^9-11과 관련된 결과를 개선, 약물 과민 반응 ^(12)을 감쇠하기위한 치료 전략으로 발전. 이와 같이, 촉각 자극은 크게 신경 세포의 형태와 개발 두뇌의 시냅스 연결을 재구성 할 수있는 입증 된 능력을 가진 긍정적 인 초기 경험의 증진을위한 귀중한 기술이다.

검사하고 신경원 형태의 변화를 정량화하기 위해, 뉴런 손상을 시각화하는 것이 필요하다. 골지 콕스 염색 절차가 완료 뉴런 ^(13)의 소수의 개별 염색을 제공하는 1800 년대 후반에 발표 카밀로 골지의 기술의 변형이다. 절차는 임의의 재현성은 일반적으로 CE 등 주요 결함, 전체의 연결 요소의 작은 함침 율을 허용, 시각화, 인용에 신경을 얼룩 것처럼 보이지만LL 기관, 수상 돌기, 돌기 쪽이, 그리고 축삭. 마찬가지로, 골지체 용액으로 관련 뇌를 함침하기 위해 필요한 시간은 또한 낙하로 인용되었다. 그러나, 염색이 완료 티슈 무한정 유지 될 수 있고, 현미경으로 뉴런의 뇌와 시각화 관류 간의 시간 미만 이십일일에서 완료 될 수있다, 일단 시간이 불합리 아니라고 관련. 또한, 프로토콜에 대한 약간의 수정과 함께, 골지 - 콕스의 얼룩을 효과적으로 모든 연령 범위에서 설치류의 뇌를 임신하는 데 사용할 수 있습니다. 구조 수준에서의 변화가 행동과 심리적 기능에 영구적 인 변형에 연결되어있다으로, 골지 - 콕스 염색 기술은 신경 가소성을 측정하는 유용한 도구와 연구자를 제공합니다.

프로토콜

모든 실험 동물 관리의 캐나다 협의회에 따라 수행하고 레스 브리지 대학, 동물 보호위원회에 의해 승인되었다.

1. 사육 및 촉각 자극

1. 일반적인 동물 공급 업체에서 임신 한 쥐를 주문하거나 표준 실험실 사육 절차를 사용하여 사내 새끼를 번식.
2. 집 12시 12분 시간 빛에 유지되는 온도 조절 사육 방 (21 ℃), 모든 동물 : 어두운주기 음식과 물을 임의로에 대한 액세스를 제공합니다.
3. 개별적으로 자손을 새끼가 태어난 집, 여성의 쥐.
4. 출생 후 즉시 처리와 관련된 추가 스트레스를 방지하기 위해, P3에서 새끼의 촉각 자극을 시작.
5. 촉각 자극은 P3-P21에서 하루에 세 번 (오전 1:00 PM, 4:00 PM)에서 실시해야하며, 새끼는 P21에서 자신의 어머니로부터 투약해야한다.
6. 크로스 담가 설계를 사용할 때, 새끼 중 절반은 FR톰 각각의 쓰레기는 다른 절반은 컨트롤 역할과 촉각 자극을 받게 될 것이다. 무작위로 각 그룹에 남성과 여성의 새끼 같은 수를 지정합니다. 촉각 자극과 컨트롤을받은 새끼를 구별 뒷다리와 꼬리에 영구 마커 새끼 하나의 그룹을 표시합니다. 마킹은 매일 다시 적용해야합니다.

촉각 자극

7. 자신의 홈 케이지에서 댐을 제거하고 음식과 물을 임시 케이지에 넣습니다. 사육 / 주택 방에있는 댐 및 임시 케이지를 유지합니다.
8. 전에 아침에 촉각 자극 세션 (오전)에 그룹으로 쥐 새끼의 무게. 각 세션의 전송 쥐 촉각 자극에 대한 별도의 테스트 룸에 자신의 홈 새장을 새끼. 24 ° C로 설정되어 가열 패드의 홈 케이지를 놓습니다
9. 두 개의 반쪽으로 홈 케이지를 나눌 뻣뻣한 보드를 사용합니다. 나머지 절반의 촉각 자극 그룹 반 및 제어 새끼에 쥐 새끼를 놓습니다.15 분에 타이머를 설정합니다.
10. 소프트 깃털 조 스터를 사용하여 연속 15 분간 동시에 촉각 자극 그룹의 모든 새끼 브러싱. 젊은 쥐 새끼 (~ P3-P12)를하는 Ususally 함께 모이과 매우 쉽게 한 번에 모든 새끼를 자극하는 깊은 수면주기를 입력 나타납니다. 새끼 연령, 그들은 어떤 새끼가 걷고 세션 동안 조사와 함께, 더 활성화됩니다. 실험은 지속적으로 각 강아지가 동일한 자극을 수신하기 위해 그룹으로 방황 새끼를 이동해야합니다.
11. 15 분 세션이 완료되면, 다시 사육 방에 새끼를 수송하고 케이지에 어머니를 반환합니다.
12. 촉각 자극의 19 일 동안이 과정을 하루에 세 번을 반복합니다. P21에서 최종 촉각 자극 세션 후, 새끼는 자신의 어머니로부터 투약해야한다. 새끼는 동성의 5 또는 6 다른 이유 된 동물 케이지에 보관해야한다.
13. 쥐가 더 추가 테스트를 진행하지 않으면, 그들은 유엔을 두어야합니다음식과 (옆으로 정기적 인 케이지 청소 및 취급에서) 그들이 나이가 약 100 일에 도달 할 때까지 물 광고 libitm에 액세스 할 수있는 어두운주기 : 일반 조명에 방해. 다른 실험 조작을받은 경우, 동물은 그 실험 프로토콜에 따라 처리 또는 테스트해야합니다.

2. 희생과 골지 - 콕스 염색

1. 약 P100은, 쥐에 IP 주입을 통해 펜 토바 비탈 나트륨의 과다 복용을 관리하고 0.9 %의 식염수를 약 100 ㎖로 intracardially perfuse.
2. 관류가 완료되면 두뇌의 압축을 풉니 다. 그대로 소뇌를 유지하기 위해 노력 아래 시신경을 절단, 두개골에서 뇌를 제거합니다 연구원은 후각 전구를 유지하거나 제거 할 수 있습니다. 골지 콕스 솔루션 ⁽¹⁴⁾ 20 ㎖로 불투명 나르 겐 병에서 추출 두뇌를 놓습니다.
3. 14 일 동안 골지 - 콕스 솔루션에 머리를 유지합니다. 14 일 후에, 골지-C을 대체30 % 자당 용액 황소 솔루션입니다. 절편 전에 2 ~ 5 일 자당 용액에 머리를 유지합니다.

주 : 뇌가 자당 용액에 전달 후 14 일 이내에 절개 할 수없는 경우, 연구자가 30 % 자당의 새로운 콘텐츠로 자당을 대체 할 필요가있다. 연구원은 염색에 대한 부작용없이 4 개월 자당 매 2 주 대체 할 수있다.

4. 섹션 뇌 위하여, 뇌 건조 도말되어야하고 cyanocacrylic 접착제 단면 스테이지에 고정된다. 찢어 얼룩이나 절편을 방지하기 위해, 연구원은 신중해야하고, 전체 뇌가 단단히 단계에 고정되어 있는지 확인해야합니다.
5. vibratome 저수지는 단면의 칼날을 커버하는 수준으로 6 % 자당 용액으로 가득해야합니다. 5 속도와 진폭, (두 규모에서 중간 점)에 vibratome 매개 변수를 설정합니다. 200 μm의 섹션으로 뇌를 슬라이스 2 % 젤라틴 화 마이크로에 섹션을 배치범위를 슬라이드. 절편의 과정 동안 젖은 부분을 유지해야합니다.
6. 관심의 모든 섹션이 수집되었을 때, 습 술을 좋아하는 종이 슬라이드에 압력을 적용하여 슬라이드에 섹션을 누릅니다. 그들이 염색 할 준비가 될 때까지 습도 챔버에서 슬라이드 랙에 슬라이드를 저장합니다. 그들은 4 일 이상 더 이상 최소 12 시간 동안 습도 챔버에 남아 있지만 수 없습니다. 슬라이드는 촉촉해야하고 건조하도록 허용 할 수 없습니다.
7. 염색 과정을 시작하기 전에 염색 연대를 준비합니다. 라벨 열두 유리 염색 요리 다음과 같은 방법으로 (10.7 X 8.5 X 6.8 cm) 공정 :
   1. 증류수 - 1 분
   2. 수산화 암모늄 - 30 분 (어둠 속에서)
   3. 증류수 - 1 분
   4. (어둠 속에서) 30 분 - 코닥은 필름에 대한 수정
   5. 증류수 - 1 분
   6. 50 % 알코올 - 1 분
   7. 70 % 알코올 - 1 분
   8. 95 % 알코올 - 1 분
   9. 100 % Alcoh올 - 5 분
   10. 100 % 알코올 - 5 분
   11. 용액 (1 / 3 클로로포름, 1 / 3 HemoDe, 1 / 3 100 % 주류) - 15 분
   12. HemoDe - 15 분

* 자일 렌은 HemoDe의 교체에 사용할 수 있습니다. 일관된 염색 품질을 보장​​하기 위해, 새로운 솔루션은 처리 각 슬라이드 랙에 사용되어야한다.

8. HemoDe의 마지막 15 분의 출현에 따라, 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입와 슬라이드를 커버 슬립.
9. 현미경으로 검사하기 전에 건조 공기 슬라이드를 허용합니다.

결과

이 염색 절차가 적절하게 지켜 질 때, 일관성 및 균일 한 수상 돌기의 염색 및 등뼈가 생성됩니다. 골지 - 콕스의 연결 염색의 표현은 그림 1을 참조하십시오. 이 절차는 무정전 다음 조직 끼워 넣기 돌기 필드의 새로 체외 방법의 개발 및 허가 할 수있다 시각화에 필적 염색을 생산하고 있습니다. 골지 콕스 염색의 vibratome 기반 기술로 염색보다, 터미널 지점과 피라미드 뉴런의 더 광범위한 염색을 생산하는 것으로 확인되었습니다 하나 celloidin - 임베디드 및 저온 유지 - 단면 조직, ^15. 염색이 방법은 뇌 전체를 함침 때문에 또한, 모든 섹션은 즉시 또는 나중에 분석 할 수 있습니다. 형태 변화의 위치가 원래의 가설을 생성 할 때 항상 명확하지 않다 바와 같이,이 프로세스는 추가적인 뇌 영역의 탐색을 허용D는 미래에 유용 할 수있는 조직의 처분을 방지 할 수 있습니다.

이 염색법은 세 래트의​​ 뇌 (P0-노년기)의 안정적인 염색에 사용될 수있다. 젊은 두뇌 (<1 그램) 얼룩 그러나 뇌는 오히려 성인의 두뇌에 추천 14 일 이상 6 일 골지 - 콕스 솔루션에 남아 있어야 다른 모든 절차는 일정하게 유지된다. 이 골지 콕스 염색 과정에서 발생할 수있는 가장 큰 어려움은 시상을 포함한 중앙 뇌 영역의 고품질 염색을 생산하는 무능력이다. 뇌 전체가 동시에 함침으로, 중앙 지역은 얼룩의 이상적인 농도를 수신 할 수없는 경우가 있습니다. 이 연구 결과에도 불구하고, 골지 - 콕스 기술은 해마와 피질 선조체 (striatum)와 같은 지역의 뛰어난 염색을 생산하고 있습니다. 절차의 마지막 제한은 재관류 과정에서 뇌에서 혈액의 불완전한 제거로부터 발생한다. 혈액은 뇌 조직에서 이슈를 생성 할 수있다그 어려운 신경을 촬영하고 추적 할 수 있습니다.

골지 콕스 염색 기술은 신경 세포 수준에서의 변화를 검토하기 위해 설계 연구의 광범위한 범위에 유용 돌기 형태와 신경 해부학의 안정적인 측정을 제공합니다. 초기 출생 후의 기간에 촉각 자극을 다음과 전두엽 피질에 신경 세포의 구조를 검사 할 때, 골지 - 콕스 염색 돌기의 복잡성에 극적인 증가를 공개했다. 초기 촉각 자극과 관련된 해부학 적 변화는 (도 1 참조) 촉각 자극을받은 쥐에서 뉴런 피라미드하도록 제어 래트에서 피라미드 신경의 척추 밀도를 비교함으로써 시각적으로 증명 될 수있다. 또, 수지상 arborization 수지상 길이 및 척추 밀도 등의 파라미터가 계산되고 통계적 동물간에 비교할 수있는 연속 데이터를 생성하기 위해 분석 될 수있다. 신뢰할 수있는 결과를 생성하기 위해, 분석은 오전에 수행되어야처리 군 당 3 마리와 반구 당 약 5 뉴런의 inimum 무작위로 분석중인 각 뇌 영역을 선택해야합니다. 그림 2 돌기의 복잡성 촉각 자극하지 못한 동물을받은 동물 (수상 돌기의 쪽 / μm의 X μM)을 보여줍니다 . mPFC (CG3)에서 분석 된 뉴런의 두 정점과 기저 필드에 촉각 자극은 신경 매개 변수의 확산의 결과.

그림 1. 골지 - 콕스의 A. 주제의 사진은 개발 과정에서 촉각 자극을받은 쥐의 지역 CG3의 층 III에서 피라미드 신경 세포 스테인드. B. 대표는 CG3의 기저 필드에 터미널 수상 돌기에 돌기 쪽의 (1,000 X) 사진 확대 , 왼쪽에있는 밝은 이미지는 대조군 쥐와 RI의 어두운 이미지입니다GHT는 촉각 자극을받은 쥐에서입니다.

그림 2. 하나 (* P <0.01)를 개발 중에 촉각 자극을 받았거나하지 않았다 성인 쥐에서 CG3 지역에있는 신경 세포의 평균 정점과 기저 돌기의 복잡성 (쪽 / μm의 X μM)의 예시적인 표현입니다.

토론

개발 두뇌의 명백한 가소성 때문에, 그것은 초기 경험을 포함하는 실험 절차를 철저하게 검토하고 시도가 모두 중간에 변수를 제어하려고하는 것이 중요합니다. 이 때문에, 크로스 담가 디자인 새끼가 개발의 모든 다른 도메인에서 유사한 경​​험을 수신하는 것을 보장하기 위해 촉각 자극 절차 중에 사용된다. 또, 여러 담가에서 체류 새끼가 효과가 하나 혹은 강아지 담가 바이어스에서 발생할 수있는 가능성을 피하기 위해 분석을 위해 선택되는 것 또한 중요하다.

촉각 자극 핥는 자손 개발에 도움이 될 것으로 생각되는, 정리, 자연적으로 발생하는 산모의 동작을 모방하는 것으로 생각됩니다. 이전의 연구는 삶의 첫 주 (P0-P7)는 ^16을 핥는 및 손질을위한 중요한시기로 강조하고 있지만, 변화의 깎아 지른듯한 크기는 TA의 십팔일 다음 확인ctile 자극에 민감한 시간이 존재하지만, 더 이상 노출이 우량하다는 것을 의미 할 수 있습니다. 그것은이 실험 패러다임에 촉각 자극을받은 새끼도 따라서 촉각 자극이 어머니에 의해 관리 정상적인 자극에 추가됩니다, 자신의 어머니에 의해 핥는 손질을 경험 것을주의하는 것이 중요하다. 마지막으로, 하나는 지역에 의존하는 변화를 인식해야합니다. 개발하는 동안 촉각 자극이 전두엽 피질 돌기의 복잡성이 증가하지만, 이것은이 자연의 구조적인 변화는 모든 뇌 영역에서 분명 것이라고 보장하지 않습니다. 그런 두정엽 피질과 같은 다른 뇌 영역의 신경 세포의 형태는, 같은 경험을 현저하게 다른 방식으로 반응 할 것입니다 가능성이 있습니다. 촉각 자극 절차를 쉽게 관리하고 자손 또는 댐에 위험을 제기하지 않기 때문에 그러나, 개발을 개선하기위한 많은 연구 연구를위한 유용한 도구 역할을 할 가능성이있다알은과 결과.

다음과 같이 뇌 조직의 골지 - 콕스 염색에 대해, 신경 세포를 성공적으로 시각화를위한 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 생리 식염수와 뇌의 적절한 관류가 있어야합니다. 또한 스테인드 뉴런을 촬영하는 기능을 복잡하면서 어려워 실제로, 혈관의 미로를 통해 신경 세포를 시각화 할 수 있도록 혈관 아티팩트의 뇌 조직 결과의 부적절하거나 불충분 관류. 2) 관류 뇌는 골지체 - 콕스 솔루션과 어둠 속에서 자당 용액에 보관해야합니다. 어둠 속에서 뇌 조직을 저장하면 다시 성공적 품질 신경 세포를 시각화 가능성을 증가 조직의 백그라운드 염색을 감소시킨다. 3) 뇌 조직은 골지체-콕스 용액에 14 일간 저장 다음 자당 용액에 기억된다. 조직이 2 ~ 5 일 30 % 자당 용액에 침지하면, 뇌는 산산조각 및 섹션의 찢어 방지하는 더 유연 할 때절단. 그것은 (자당 솔루션을 지속적으로 신선한 솔루션으로 대체되지 않는 한) 자당의 장기간 보관이 얼룩 질을 감소시키기 때문에 증가 기간에 대한 자당 용액에 남아있는 뇌 조직을 방지하는 것이 중요합니다. 슬라이드를 염색 한 커버 미끄러 일단 4) 마지막으로, 그들은 현미경으로 시각화하기 전에 건조하는 충분한 시간을 부여해야합니다. 슬라이드가 적절하게 건조 공기를 허용하지 않을 경우, 조직은 대뇌 피질의 신경 세포를 성공적으로 시각화를 줄이고, 어두워 질 수 있습니다.

경험에 대한 응답으로 발생하는 심리적 기능과 행동 반응의 안정적 변화는 신경 세포의 형태와 시냅스 연결 ^(17)의 재구성에 의해 촉진 될 것으로 생각된다. 이러한 구조적인 변화는 환경 의존적 가소성 측정 자료를 제공하기 때문에, 안정적인 염색 절차의 사용은 중요하다. 이 vibratome 기반 골지 - 콕스 염색 절차는 신뢰할 수있는 얼룩을 제공합니다이러한 celloidin 임베딩와 같은 다른 프로토콜 분명하지 않을 수 있습니다 좋은 지점과 돌기 쪽의 ING. 골지 콕스 절차의 특수성은 긴 거리에 대한 하나의 뉴런의 추적을 허용하는 신경 요소 (1 ~ 10 %)의 작은 부분을 염색하는 능력에서 유래한다. 뉴런의 단지 작은 분획이 스며 함침된다는 사실에도 불구하고, 가시 렌더링되는 세포는 세포체, 수상 돌기, 축색 돌기 쪽 및 포함한 모든 기능을 유지한다. 다른 대뇌 피질의 구조는 흠없는 투명 남아 있기 때문에 또한, 염색 절차가 제대로 수행 될 때, 염색 된 세포는 투명한 배경에 대해 분명하고 뚜렷하게 눈에 띄는. 외부 기능에 영구적 인 변화가 신경계의 가소성과 관련이 있어야 실현에 의해, 그 구조 및 연결을 수정하는 신경의 기능 즉, 골지 - 콕스 염색 절차는 연구자를 제공하는이 가소성을 시각화하고 정량화하는 신뢰할 수있는 기술.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium Dichromate	Fisher	P188
Mercuric Chloride	Fisher	M1561
Potassium Chromate	Fisher	P220
Ammonium Hydroxide	Fisher	A669-500
Kodak Rapid Fix	Vistek	Kodak 146 4016
EtOH-95 & Anhydrous	Commercial Alcohols	No Cat Numbers	All other Et-OH are dilutions
Swiffers- Soft Feather-Like dusters	Safeway		Can be found at most grocery stores
Sucrose	Sigma-Aldrich	S-9378
HemoDe	Electron Microscopy Sciences	23410
Permount	Fisher	Sp15
Slides	VWR	160004-365
Coverslips	VWR	062011-9