Aislamiento y diferenciación de Th17 Naïve linfocitos T CD4

Resumen

Con funciones efectoras diferenciadas de otros subconjuntos de células T, las células Th17 se han implicado en el centro de la autoinmunidad inflamatoria. Este protocolo de diferenciación in vitro de Th17 en proporciona un medio para determinar si ingenuas linfocitos T CD4 + pueden diferenciarse en células Th17, y para examinar aún más su papel en la autoinmunidad y la respuesta del huésped.

Resumen

Células Th17 son un subconjunto distinto de las células T que se han encontrado para producir interleucina 17 (IL-17), y difieren en función de los otros subconjuntos de células T, incluyendo Th1, Th2, y células T reguladoras. Células Th17 han surgido como un culpable central en las respuestas inmunes inflamatorias exceso de celo asociados con muchos trastornos autoinmunes. En este método purificamos los linfocitos T del bazo y los ganglios linfáticos de ratones C57BL / 6, y estimular a las células T CD4 + purificadas bajo ambientes Th17 inductores de control y. El entorno de Th17-inducir incluye la estimulación en presencia de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, IL-6, y el TGF-β. Después de la incubación durante al menos 72 horas y hasta por cinco días a 37 ° C, las células se analizan posteriormente para la capacidad de producir IL-17 a través de la citometría de flujo, qPCR, y ELISA. Th17 diferenciado las células CD4 + CD25-T pueden ser utilizados para aclarar aún más el papel que juegan las células Th17 en el inicio y la progresión de la autoinmunidad y el anfitrión defensa. Por otra parte, Th17 diferenciación de CD4 + CD25 de los linfocitos de los modelos knockout / enfermedad murinos distintas puede contribuir a nuestra comprensión de la plasticidad del destino celular.

Introducción

Los linfocitos T CD4 + (células T) juegan un papel crítico en la defensa inmunitaria mediada por sistema contra microorganismos infecciosos. Por el contrario, las células T también están íntimamente asociados con la aparición y progresión de las enfermedades autoinmunes como la diabetes tipo 1, el lupus eritematoso sistémico, y artritis reumatoide. Linfocitos T CD4 + se activan a través de una combinación de receptor de células T (TCR) interacciones con el antígeno cognado / complejo mayor de histocompatibilidad II (CMHII) moléculas, y las interacciones de los receptores CD28 con B7.1/B7.2 ligandos ^15. Además de la provisión de la estimulación de TCR y CD28 co-estimulación, las células presentadoras de antígeno también proporcionan un entorno de citoquinas, que determina el estado de diferenciación de los linfocitos T, dirigiendo de ese modo la respuesta del linfocito T al antígeno dado. Interacciones patógeno Distinct / célula presentadora de antígeno crean ambientes de citoquinas distintas, que sesgar los linfocitos T por distintas vías se centraron en la eliminación del patógeno desencadene. Desafortunadamente, T vías efectoras de los linfocitos, originalmente destinadas a eliminar los patógenos invasores, pueden ser erróneamente dirigidos contra los tejidos propios ^15. Por lo tanto, una mejor comprensión del estado de diferenciación cada uno distinto del subconjunto de células T CD4 + es crucial para nuestra comprensión de cómo modular el equilibrio entre la eliminación de patógenos y la tolerancia a la libre.

Además de la Th1, Th2, y T reguladoras vías de diferenciación de células inducibles, linfocitos T vírgenes también pueden ser impulsados ​​por citoquinas por la vía Th17. Mientras que las células Th1 patógenos intracelulares de combate, las células Th2 eliminar los patógenos extracelulares, y las células T reguladoras (Tregs) minimizan las respuestas inflamatorias ^{1, 16;} células Th17 juegan un papel importante en la eliminación de bacterias extracelulares y hongos. Células Th17 se denotan generalmente por la expresión del factor de transcripción específico de linaje RORγT y producción de IL-17A, que promueve la activación de los macrófagos y neutrófilos ^{1, 7.}

Células Th17 han sido implicados en varios trastornos autoinmunes, y sus modelos de roedores asociados. Por ejemplo, se ha demostrado que la IL-23 (que se requiere para mantener el fenotipo Th17), pero no de IL-12, era el culpable central en la encefalitis autoinmune experimental (EAE), el modelo de enfermedad de roedor para MS. Posteriormente, se ha demostrado que la reducción en la producción de IL-17 se correlacionan con la prevención de EAE ^{2, 6, 17.} Por otra parte, las células Th17 se han asociado con otros trastornos autoinmunes como la artritis y el lupus eritematoso sistémico (LES) ^{10, 16.} IL-23 p19 deficientes ^{- / -} ratones mostraron tener números muy bajos de células Th17, y son resistentes al desarrollo de la EAE no sólo, sino también la artritis inducida por colágeno-, un modelo para la artritis reumatoide ^{10, 18.} Además, los ratones tratados con anticuerpos neutralizantes de IL-17A popaer Además, se constató la aparición de la artritis inducida por colágeno para tener la resolución del daño articular ^18. Cabe señalar que el papel de las células Th17 en la progresión de la enfermedad autoinmune aún no se ha caracterizado como la investigación reciente también ha demostrado un papel protector de las células Th17 en la diabetes ^{9, 11} y la inflamación intestinal ¹⁴ Tipo 1. Estos estudios confirman la importancia de la diferenciación de Th17 en la autoinmunidad.

In vitro diferenciación Th17 es un método necesario en la investigación de células T debido a que hay al menos dos preguntas desconcertantes que requieren una mayor investigación: 1) ¿Cómo funciona exactamente la IL-6 regulan el equilibrio entre Treg y Th17 diferenciación, y 2) ¿Cuáles son los mecanismos exactos detrás de la IL-17 inducida-trastornos inflamatorios? Nuestro método emplea células CD4 + CD25-T a partir de los bazos y ganglios linfáticos de los C57BL / 6 de ratón. Es importante señalar que a pesar de que es posible inducir la diferenciación de Th17 utilizando un impuropoblación, la adquisición de al menos un 80% pura CD4 + población de células CD25-T niega cualquier preocupación de la contaminación y asegura más exitosos resultados de la diferenciación Th17. Con el fin de lograr la diferenciación de Th17 adecuada, las células CD4 + CD25-T se incuban en la presencia de anti-CD3 y anti-CD28, que proporcionan las señales de activación, 1 y 2, respectivamente, y la IL-6, y TGF-β. Aunque se ha informado de que la IL-23 solo se puede utilizar para lograr la diferenciación de Th17, más tarde se demostró que la IL-23 es necesaria para la estabilidad de la población de células Th17, pero TGF-β IL-6 y son esenciales para la diferenciación de Th17 ^{3, 18, ​​19.} Estudios murinos han demostrado que el receptor de IL-23 se expresa en células T CD4 + sólo después de que han sido estimuladas con IL-6 y TGF-β ^{13, 18.} Además, las células Th17 desarrollarán con éxito en la presencia de anticuerpos IL-23 de bloqueo, siempre y cuando están presentes ^{18, 19} TGF-β IL-6 y. Como tal, esta diferenciación Th17 protocolo provIDES las condiciones apropiadas para inducir exitosamente Th17 diferenciación. Desarrollo de una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes de Th17 la diferenciación y la IL-17 de producción presentar la oportunidad para el desarrollo de mejores terapias dirigidas a los trastornos autoinmunes ^13.

Protocolo

Todo uso de los animales se realizó de conformidad con los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado de Animales institucional y el uso.

1. Preparación de Mezclas y Medios de Comunicación

1. Estéril de pH de PBS: 7,3 (1 L)
   0,23 g NaH ₂ PO ₄
   1,15 g de Na ₂ HPO ₄
   9,0 g de NaCl
   Recoger el volumen con agua DI. Esterilizar con autoclave.
2. Cultivo Celular Medios (100 ml)
   89 ml de RPMI
   10 ml de 10% de FBS
   1 ml Antibiótico antimicótico (ABAM) 100 mg 50 mM 2-mercaptoetanol (3,5 mg de stock 2-mercaptoetanol a 96,5 mg de PBS)
3. FACS buffer (Fluorescente Activación clasificación de células) (Para ser usado durante la citometría de flujo) FBS al 2% en PBS estéril
4. iTh17 Mix (Basado en el número de muestras, determinar el volumen necesario para todas las mezclas y los medios de comunicación)
   1,5 mg / ml de anti-CD28
   20 ng / ml de IL-6
   5 ng / mlTGF-β

2. Celdas se chapada en triplicado, bajo las siguientes condiciones

1. Placa unido anti-CD3, anti-CD28 (esto es la mezcla de control de activación).
2. iTH17: placa unida anti-CD3, anti-CD28, IL-6, TGF-β.

3. Unido a la placa anti-CD3 (10 g / ml)

Se recomienda que la preparación de placas unidos a la placa anti-CD3 se hace al menos 4 horas antes de la hora células se añaden a las placas.

1. Añadir 30 l anti-CD3 a los pocillos (anti-CD3 se diluye en PBS estéril) de un nuevo de 96 pocillos de fondo en U Microtest placa de cultivo de tejidos, y toque los lados de la placa para asegurar una cobertura uniforme de los pozos. Se incuba a 37 ° C durante 4 horas y luego refrigerar hasta que sea el momento de añadir las mezclas y las células a la placa.

4. Ratón Disección

1. Este protocolo se basa en el uso de ratones C57BL / 6 micrófonoe, de 3-8 meses de edad, y comprado de El Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME).
2. Sacrificio de ratón utilizando asfixia de CO _2, y confirmar la muerte con dislocación cervical posterior.
3. Esterilizar ratones herramientas de disección y área de la incisión con etanol al 70% y comenzar la disección.
4. Desde el punto de vista ventral, agarra la piel que es anterior a la abertura de la uretra y comenzar a cortar con tijeras hasta la línea media ventral hasta llegar a la zona de la barbilla. Tome precauciones para no desgarrar o cortar en el revestimiento de la pared peritoneal.
5. Tire hacia atrás de la piel y de definir para permitir el acceso cómodo a los ganglios linfáticos durante la extracción.
6. Los ganglios linfáticos y bazos recogidos todos serán retirados con pinzas, y se colocan en una placa de Petri estéril que contiene 5 ml de tampón de autoMACS compró de Miltenyi Biotec (refiérase a las Figuras 2 y 3 para los ganglios linfáticos y los diagramas de la extirpación del bazo).
   1. Retire los ganglios linfáticos axilares que estánencontrado cerca de la axila (axila) detrás de los músculos pectorales de cada ratón.
   2. Retire los ganglios linfáticos braquial que se encuentran en los tejidos conectivos situados cerca de cada axila.
   3. Retire los ganglios linfáticos cervicales superficiales que se encuentran en el cuello de cada ratón.
   4. Retire los ganglios linfáticos inguinales que se encuentran en la región de la cadera en la conjunción de los 3 vasos sanguíneos.
   5. Para acceder a los ganglios linfáticos mesentéricos, cortados a través de la membrana peritoneal hasta la línea media ventral. Los ganglios linfáticos mesentéricos se encuentran en el tejido conectivo que mantiene juntos los intestinos. Se encuentran generalmente en una serie de 4-8 nudos, y pueden aparecer como un "collar de perlas". Asegúrese de sacar toda la cadena.
   6. El bazo se encuentra en la zona abdominal, detrás del estómago y los intestinos. Retírelo tirando y lo extraiga de páncreas.
7. Moler órganos bajo una campana estéril utilizando 2 preparaciones microscópicas esmerilado. Coloca los ganglios linfáticos o el bazo enel lado esmerilado de un portaobjetos de microscopio, y frotar con el lado mate de la segunda diapositiva hasta desintegrado. Repita hasta que todos los ganglios linfáticos y el bazo se han molido.

Nota: Se recomienda comenzar con los ganglios linfáticos y terminar con el bazo, mientras que la sangre será más difícil ver los ganglios linfáticos restantes en el búfer autoMACS.

9. Para filtrar los órganos de tierra en una suspensión de células individuales, empezar por plegado de una pieza de 40 m de nylon material varias veces, y colocando en la parte superior de un tubo de centrífuga de 15 ml. El material de nylon debe ser aproximadamente 3 x 3 cm
10. Utilice una jeringa de 5 ml y aguja de 21 G para aspirar los 5 ml de autoMACS Operando órganos de amortiguamiento y de tierra. Dispensar lentamente en el material de nylon plegado. Tenga cuidado de no perforar el material con la aguja.

Nota: Una vez que se consigue suspensión de células individuales, la solución debe aparecer como una solución pálida, consistente con ninguna Visible pedazos de tejido sólido. Si se mantienen sólidos, vuelva a aspirar y dispensar a través de una nueva pieza plegada de nylon colocada en un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml.

11. Siempre mantenga las células en hielo cuando no esté en uso.

5. Separación Celular

1. Para obtener resultados óptimos, obtener al menos un 80% pura CD4 + población de células CD25 través autoMACS separador celular Pro usando el MACS CD4 + CD25 + T reguladoras kit de aislamiento de células, el ratón. El protocolo para la retención negativo de la población de células CD25 + CD4 se obtiene a través de Miltenyi Biotec.

6. La diferenciación Th17

1. Recoger la población de células CD25 + CD4 después de la separación con el separador de células autoMACS Pro.
2. Contar las células diluidas en una relación de 1:1000 con azul de tripano usando un hemocitómetro.
3. Una vez que la concentración se ha determinado a partir de los recuentos de células, se diluye la suspensión de células a 1 x 10 ⁶ células / ml en medio de cultivo celular.
4. Saque placas de 96 pocillos con plato obligado anti-CD3 después de 4 horas.
5. Lavar los pocillos recubiertos con anti-CD3 con 200 l de PBS. Repite 2 veces.
   1. Para lavar añadir 200 l de PBS estéril a pocillos recubiertos con anti-CD3 y eliminar de PBS en un recipiente de residuos.
6. Añadir 100 l de la mezcla iTh17 o mezcla de control de activación (véase el punto # 2) a los pocillos por triplicado.
7. Añadir 100 l de células a cada pocillo en el que ya sea la mezcla de Th17 o la mezcla de control de activación ha sido colocado.
8. Se incuban las células durante al menos 72 horas o hasta 5 días (diferenciación Th17 puede obtener después de 72 horas o después de 5 días.)
9. La diferenciación de Th17 puede ser evaluada por tinción de citometría de flujo y análisis intracelular, ELISA, o qPCR

7. La activación celular (sólo es necesario para la tinción intracelular)

1. Retire placas de 96 pocillos de incubación al final de cualquiera de las 72 h o 5 días
   1. Recordemos que Th17 differentiation se puede lograr ya sea después de 72 horas o 5 días.
2. Para cada condición (por ejemplo, control de la activación o iTh17), transferir las células que se encuentran en triplicado en un pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Las células para una condición ahora se han agrupado en un pocillo de la placa de cultivo de 24 pocillos, en lugar de ser por triplicado en la placa de cultivo así fondo en U 96.
3. El volumen total de cada pocillo en la placa de cultivo celular de 24 pocillos es ahora 600 l. Elevar el volumen de cada pocillo a 1 ml con medio de cultivo celular.
4. Añadir PMA (acetato miristato de forbol) (50 ng / ml), ionomicina (1 M), y BFA (Brefeldina-A) (10 g / ml) a cada pocillo en la placa de cultivo celular de 24 pocillos a las concentraciones listadas.
5. Incubar a 37 ° C durante 4 h.

8. La tinción intracelular

1. Las células se tiñen con los marcadores extracelulares e intracelulares deseados para el análisis de citometría de flujo. Para detectar la presencia of IL-17, la tinción intracelular se realiza con anticuerpos anti-IL-17A. Marcadores de superficie extracelulares recomendados incluyen CD4, CD8, y CD25.
   1. Utilice el intracelular de citoquinas tinción Starter Kit-Ratón de BD Bioscience para la tinción intracelular de IL-17.
   2. Para cada muestra, las células de pellets, eliminar el sobrenadante, y resuspender el sedimento de células en 200 l de tampón FACS (2% de FBS en PBS).
   3. Transferencia de células resuspendidas a 96 citometría de flujo de células placa.
   4. Haga girar las celdas hacia abajo durante 5 min a 1200 rpm y eliminar el sobrenadante.
   5. Añadir 200 l de tampón FACS PBS, centrifugar durante 5 min a 1200 rpm, y desechar el sobrenadante.
   6. Resuspender las células en 100 l de tampón FACS y se aplican 100 l de anticuerpo extracelular (Ab) de la mezcla (mezcla extracelular Ab se hace en tampón FACS). Incubar durante 15 min a TA, cubiertas con papel de aluminio.
   7. Repita el paso 8.1.4.
   8. Repita el paso 8.1.5 2x.
   9. Resuspender las células en 100 l de BD Cytofix / Cytoperm Buffer. Incubcomió durante 20 min a TA, cubierto con papel de aluminio.
   10. Añadir 100 l de tampón 1x BD Perm / Wash, centrifugar durante 5 min a 1200 rpm y eliminar el sobrenadante. Repita.
   11. Añadir 50 l de mezcla intracelular Ab. (Mezcla intracelular Ab se hace en 1x BD Perm / Wash) Incubar durante 15 min a TA, cubierto con papel de aluminio.
   12. Repita el paso 8.1.10.
   13. Resuspender las células en 200 l de BD tinción Buffer.
   14. Coloque células resuspendidas en citometría de flujo tubos que contienen 200 l BD tinción Buffer (volumen final es de 400 l).
   15. Almacenar a 4 ° C hasta que las muestras están listas para ser leído.

9. Análisis de citometría de flujo

1. Puerta población de células vivas.
2. De la población de células vivas, puerta de CD4 + CD8-población.
3. De la población CD8-CD4 +, la puerta de la IL-17A + población.
   1. En base a los resultados experimentales anteriores, el 100% de la IL-17A + población será CD25 +.

* Total de los recuentos de células absolutas se obtuvieron después de la puesta en común de los triplicados de muestras
** Número absoluto de células CD4 + CD25 + IL-17A + se determina multiplicando el número total de células en el porcentaje de puerta en vivo y el porcentaje del total de células que llevan los marcadores específicos de linaje, CD4, CD25, y la IL-17A, como determinado por citometría de flujo.

10. qPCR y ELISA

1. Las células de ubicación no se utilizan para el análisis de citometría de flujo en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se centrifuga a 13.000 rpm durante 5-10 min. Las células que se encuentran en el sedimento de células después de la centrifugación se utilizaron para el análisis de qPCR. Se realizó un análisis qPCR utilizando PTC-200 Peltier termociclador (BioRad).
2. Recoger el sobrenadante de los tubos se centrifugaron durante las pruebas ELISA. IL-17A ELISA se realizaron con par de anticuerpos TC11-18h10 (captura, número de catálogo 555068) y TC11-8H4 biotina (detección, número de catálogo 555067) adquirió de BD Biosciences. IL-17A ELISA standards se obtuvieron de eBioscience (número de catálogo 14-8171-80).
3. Después de retirar el sobrenadante, resuspender las células restantes que se utilizarán para qPCR en 175 tampón de lisis de ARN l (usar inmediatamente para la extracción de RNA, síntesis de ADNc, y qPCR, o tienda a -80 ° C para su uso posterior).
   1. Consulte la Tabla II para primer secuencias de IL-17A y actina (gen mantenimiento de la casa)

Resultados

Este protocolo de diferenciación de Th17 comienza con la extracción del bazo y la axilar, braquial, mesentérica, de cuello uterino, y los ganglios linfáticos inguinales. Una representación de las ubicaciones de cada uno se puede encontrar en las Figuras 2 y 3. Las figuras 1 y 5 tanto proporcionan una representación visual de los métodos descritos en este protocolo.

Este protocolo se centra en la diferenciación Th17 de la población d...

Discusión

Aquí hemos descrito el protocolo para lograr la diferenciación in vitro Th17. El estudio de la diferenciación de Th17 es importante, como la diferenciación de los linfocitos T en el subconjunto de Th17 es crítico para la eliminación efectiva de los patógenos humanos ^13. A la inversa, la producción de IL17 se ha asociado con progresión de la enfermedad autoinmune ^13. El método de diferenciación de Th17 es aplicable a muchos entornos de investigación, ya que se puede aplicar a nu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
Sterile Polyestrene Petri Dish	Fisher Scientific	0875713A	60 mm x 15 mm
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
Premium Microscope Slides, Frosted	Fisher Scientific	12-544-3	3" x 1"1 mm
5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle	BD Biosciences	309632
Corning 15 ml Centrifuge Tubes	Sigma-Aldrich	CLS430791
Nylon 40 microns	Miami Aquaculture	Nylon 40/26
Microtest tissue culture plate 96 well U bottom	BD Biosciences	35-3077
Corning Costar 24 well cell culture plates	Sigma-Aldrich	CL3524
Eppendorf Tubes 1.5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e	BD Biosciences	553057
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28	BD Biosciences	553294
Mouse IL-6 Recombinant Protein	eBioscience	14-8061-62
TGFbeta	R&D Systems	240-B-002
Trypan blue solution 0.4 %	Sigma-Aldrich	66H2364
Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4	BD Biosciences	558107
APC Rat Anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	553035
PE Conjugated Anti-mouse CD25	eBioscience	E01155-516
Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17	BD Biosciences	560820
Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse	BD Biosciences	51-2041AK (559311)
MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-091-221
ABAM	Cellgro	30-004-CI
RPMI	Corning, Cellgro	10-040-CM
B 2-MercaptoEthanol	MP Biomedical	194834	Hazardous
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA)
Ionomycin Calcium Salt	Sigma-Aldrich	13909-1ML	Hazardous
Brefeldin A (BFA)	MP Biomedicals	159027
ELISA IL-17A Capture mAb	BD Biosciences	555068
ELISA IL-17A Detection mAb	BD Biosciences	555067
ELISA IL-17A Standard	eBioscience	14-8171-80
IL-2 ELISA Kit	BD Biosciences	555148
TMB Substrate Reagent Set	BD Biosciences	555214
			Equipment
autoMACS Pro Cell Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545
Sorvall Legend RT+ Centrifuge	ThermoScientific
Napco series 8000 WJ CO2 Incubator	ThermoScientific
PTC-200 Peltier Thermal Cycler	Biorad