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要約

他のT細胞サブセットとは異なるエフェクター機能を持つ、Th17細胞は、中央炎症性自己免疫に関与している。このインビトロのTh17分化プロトコルは、ナイーブCD4 + Tリンパ球は、Th17細胞に分化することができ、さらに自己免疫および宿主応答におけるそれらの役割を検討するかどうかを決定するための手段を提供する。

要約

Th17細胞は、インターロイキン17（IL-17）を産生することが見出されているT細胞の別個のサブセットである、およびTh1、Th2の、および調節T細胞を含む他のT細胞サブセットの機能が異なる。 Th17細胞は、多くの自己免疫疾患に関連した熱心炎症性免疫応答において中心的な原因として浮上している。この方法では、C57BL / 6マウスの脾臓およびリンパ節からのTリンパ球を精製し、制御およびTh17分化を誘導する環境下での精製されたCD4 + T細胞を刺激する。 Th17分化を誘導する環境を、抗CD3および抗CD28抗体、IL-6、およびTGF-βの存在下での刺激を含む。少なくとも72時間、および37℃で最長5日間インキュベートした後、細胞を、続いてフローサイトメトリー、定量PCRおよびELISAを介してIL-17を産生する能力について分析する。 Th17の分化CD4 + CD25-T細胞はさらに、Th17細胞が自己免疫およびホスト·ドの発症および進行に果たす役割を解明するために利用することができる国防。また、個別のマウスノックアウト/疾患モデルからのCD4 + CD25 - リンパ球のTh17の分化は、細胞運命の可塑性の我々の理解に貢献することができます。

概要

CD4 + Tリンパ球（T細胞）は、感染性微生物に対する免疫系媒介性防御において重要な役割を果たしている。逆に、T細胞はまた、密接に1型糖尿病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチなどの自己免疫疾患の発症および進行に関連している。 CD4 + Tリンパ球は、T細胞受容体、同族抗原/主要組織適合複合体II（MHCII）の分子と（TCR）相互作用の組み合わせによって活性化され、B7.1/B7.2でCD28受容体の相互作用は15リガンド 。 TCR刺激およびCD28共刺激の提供に加えて、抗原提示細胞は、それによって所与の抗原に対するTリンパ球の応答を導く、Tリンパ球の分化状態を決定するサイトカイン環境を提供する。異なる病原体/抗原提示細胞の相互作用は、イーライに焦点を当てた別個の経路をTリンパ球をダウンスキュー異なるサイトカイン環境を作成する開始病原体のmination。残念ながら、元々の病原体を根絶するために設計された侵入するTリンパ球のエフェクター経路は、誤って自己組織15に向けることができる。したがって、各別個のCD4 + T細胞サブセットの分化状態のより良い理解は、病原体の排除と自己に対する寛容とのバランスを調節する方法についての我々の理解に重要である。

のTh1、Th2の、および誘導性調節性T細胞分化経路に加えて、ナイーブTリンパ球はまた、ダウン経路のTh17サイトカインにより駆動することができる。 Th1細胞は細胞内病原体戦闘一方、Th2細胞は、細胞外病原体を排除し、調節性T細胞（Tregs）は、炎症応答1,16を最小限に抑える、Th17細胞は、細胞外細菌および真菌の排除に重要な役割を果たしている。 Th17細胞は、一般に、系統特異的転写因子であるRORγtの発現およびILの産生を付しているマクロファージおよび好中球1,7の活性化を促進-17A、。

Th17細胞は、幾つかの自己免疫疾患、およびそれらに関連するげっ歯類モデルに関与している。例えば、それはIL-23（Th17の表現型を維持するために必要とされる）ことが実証されているではなく、IL-12、実験的自己免疫性脳炎（EAE）におけるMSのための齧歯類疾患モデル中央犯人であった。それは、その後、IL-17産生の減少がEAEの予防2、6、17に相関することが示されている。また、Th17細胞は、関節炎および全身性エリテマトーデス（SLE）10、16を含む他の自己免疫疾患と関連している。 IL-23 のp19欠損- / -マウスTh17細胞の非常に低い数値を有することが示されており、EAEだけでなく、現像に耐性であるが、コラーゲン誘導関節炎、関節リウマチ10,18のモデルをした。加えて、マウスは、後方にIL-17Aの中和抗体で処置小胞体コラーゲン誘導関節炎の発症はまた、関節損傷18の分解能を有することが見出された。なお、最近の研究はまた、1型糖尿病9,11および腸炎症14におけるTh17細胞の保護的役割が示されているような自己免疫疾患の進行におけるTh17細胞の役割は特徴付けされないままであることに留意されたい。これらの研究は、自己免疫におけるTh17の分化の重要性を確認。

さらなる調査が必要で、少なくとも2困惑の質問があるので、 体外のTh17分化の T細胞の研究に必要なメソッドです。1）どのように正確に、IL-6は、Treg細胞とTh17の分化との間のバランスを調節しないと、2）正確なメカニズムは何ですかIL-17誘導性の炎症性疾患の背後にある？我々の方法は、C57BL / 6マウスの脾臓およびリンパ節からのCD4 + CD25-T細胞を使用する。なお、留意することが重要であることは、不純を使用してTh17の分化を誘導することが可能であるが集団は、少なくとも80％純粋なCD4 + CD25-T細胞の集団を取得することにより、汚染の心配を否定し、より成功のTh17分化の結果を確実にする。適切なTh17の分化を達成するために、CD4 + CD25-T細胞を、それぞれ、抗CD3および抗CD28、活性化シグナルを提供する、1および2の存在下でインキュベートし、IL-6、およびTGF-β。それはIL-23単独ではTh17の分化を達成するために用いることができることが報告されているが、これは後でIL-23がTh17分化細胞集団の安定性のために必要であることが実証されたが、IL-6およびTGF-βは、Th17細胞の分化に必須である3、18、19。マウスの研究は、IL-23受容体は、それらがIL-6およびTGF-β13,18で刺激された後にのみCD4 + T細胞上で発現されることを示した。また、Th17細胞が正常であればIL-6およびTGF-β18,19存在するようなIL-23遮断抗体の存在下で発症する。このように、本のTh17分化プロトコルPROV正常のTh17分化を誘導するために適切な条件をIDES。 Th17の分化のメカニズムのよりよい理解を開発し、IL-17産生が自己免疫疾患13を目的とした、より良い治療法の開発のための機会を提示する。

プロトコル

すべての動物の使用は、施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに従って実施した。

1。ミックスとメディアの準備

  1. 滅菌したPBSのpH：7.3（1リットル）
    0.23グラムのNaH 2 POの4
    1.15グラムのNa 2 HPO 4
    9.0グラムのNaCl
    DI水で音量を上げてください。オートクレーブ滅菌する。
  2. 細胞培養培地（100ミリリットル）
    89ミリリットルのRPMI
    10ミリリットル、10％FBS
    1ミリリットル抗生物質抗真菌（ABAM）100μgを50 mMの2 - メルカプトエタノール（96.5μgのPBSに3.5μgの株式2 - メルカプトエタノール）
  3. FACS緩衝液（蛍光活性化セルソーティング）（フローサイトメトリーの間に使用されるために）、2％FBS、滅菌PBS中
  4. iTh17ミックス （試料の数に基づいて、すべてのミックスとメディアのために必要な容積を決定）
    1.5μg/ mlの抗CD28
    20 ng / mlのIL-6
    5 ng / mlのTGF-β

2。細胞は以下の条件で三重にメッキされます

  1. 抗CD3結合したプレートを、抗CD28（これは起動制御ミックスである）。
  2. iTH17：抗CD3バインドプレート、抗CD28、IL-6、TGF-β。

3。プレートに結合した抗CD3（10μg/ ml）を

これは、プレートに結合した抗CD3プレートの製造は、事前の細胞がプレートに添加される時間に、少なくとも4時間後に行われることをお勧めします。

  1. ウェルに30μlの抗CD3を追加し、新しい96ウェルU底マイクロテスト組織培養プレート（抗CD3を滅菌PBSで希釈）、およびウェルの均一な被覆を確実にするために、プレートの側面をタップする。それはプレートにミックスやセルを追加するための時間になるまで冷蔵し、その後4時間、37℃で培養します。

4。マウスの解剖

  1. このプロトコルは、C57BL / 6マイクの使用に基づいているE、3-8ヶ月齢、ジャクソン研究所（バーハーバー、ME）から購入した。
  2. CO 2窒息を使用して、マウスを犠牲にし、その後の頸椎脱臼で死亡が確認された。
  3. 70％エタノールでマウスの解剖ツールと切開領域を殺菌し、解剖を始める。
  4. 腹側のビューから、尿道口の前方で皮膚をつかんであごの領域に到達するまで、腹側正中までハサミで切断始まる。涙や腹膜壁の粘膜にカットしない予防策を講じる。
  5. 皮膚に引いて、取り外し作業中にリンパ節への快適なアクセスを可能にするために突き止める。
  6. 収集したリンパ節および脾臓を全てピンセットで除去し、バッファミルテニーバイオテク（リンパ節および脾臓の除去の図について図2及び図3を参照）から購入したランニングをautoMACSを5mlを含む滅菌ペトリ皿に置かれます。
    1. アール腋窩リンパ節を取り除く各マウスの胸筋の背後にある腋窩（脇の下）の近くで発見。
    2. 各腋窩の近くに結合組織に配置されている上腕リンパ節を除去します。
    3. 各マウスの首に見られる表面的な頸部リンパ節を除去します。
    4. 3血管の連動で、腰部に配置されて鼠径部リンパ節を除去します。
    5. 腸間膜リンパ節にアクセスするには、腹膜ライニングを通して腹側正中線をカット。腸間膜リンパ節は、腸を一緒に保持する結合組織に見出される。これらは一般的に4〜8ノードの文字列で発見されており、「真珠の文字列」として表示されることがあります。文字列全体を引き出していることを確認してください。
    6. 脾臓、胃や腸の後ろ、腹部領域に位置しています。膵臓からそれを引き出し、取り外して、それを削除します。
  7. 2つや消し顕微鏡スライドを使用して無菌フードの下での臓器を挽く。リンパ節や脾臓にを置く1顕微鏡のスライドのつや消し側、そして崩壊したまで、第2のスライドのつや消し側をこする。すべてのリンパ節や脾臓が接地されるまで繰り返します。

注：血はそれが困難なAUTOMACSバッファ内の残りのリンパ節を参照してくださいになりますので、これは、リンパ節で始まり、脾臓で終了することをお勧めします。

  1. 単一細胞懸濁液に粉砕器官をフィルタリングするには、40ミクロ​​ンのナイロン素材のワンピースの上に数回折り畳み、そして15ミリリットルの遠心管の最上部に配置することで始まる。ナイロン素材は、大きく分けて3×3インチでなければなりません
  2. バッファとグラウンド臓器を実行AUTOMACSの5ミリリットルを吸引する5ミリリットルの注射器と21ゲージ針を使用してください。折り畳まれたナイロン素材に徐々に分注する。針で材料を穿刺しないように注意してください。

注：単一細胞懸濁液が達成されると、溶液はvisibなしで淡い、一貫性のあるソリューションとして表示されます固形組織のル·ピース。固体は、再吸引のままであり、新たを15ml遠心管に入れ、ナイロンの新しい折返し片を介して分配する場合。

  1. 使用しないときは、常に氷上で細胞を維持する。

5。細胞分離

  1. 最適な結果を得るために、MACS CD4 + CD25 +調節性T細胞単離キット、マウスを使用して細胞をautoMACS Proのセパレータを介して、少なくとも80％純粋なCD4 + CD25 - 細胞集団を得る。 CD4 + CD25-細胞集団の負の保持のためのプロトコルはミルテニー·バイオテク社を介して得られる。

6。のTh17分化

  1. とautoMACS Proの電池セパレータで分離した後に、CD4 + CD25 - 細胞集団を収集します。
  2. 血球計数器を用いてトリパンブルーで1:1000の割合で希釈した細胞を数える。
  3. 濃度は細胞数から決定されると、細胞培養培地中に1×10 6細胞/ mlの細胞懸濁液を希釈する。
  4. 4時間後に抗CD3バインドプレートと96ウェルプレートを取り出します。
  5. 200μlのPBSで抗CD3でコーティングされたウェルを洗浄します。 2回繰り返します。
    1. 洗浄するために抗CD3でコーティングされたウェルに滅菌PBSを200μlを追加し、廃棄物容器に、PBSを除去します。
  6. 三重でウェルにiTh17ミックスや起動制御ミックスを100μl（ポイント＃2を参照）を追加します。
  7. 各ウェルのTh17ミックスや起動制御ミックスのいずれかが置かれたに細胞100μlを加える。
  8. 少なくとも72時間、または5日間まで細胞をインキュベート（Th17の分化は、72時間後または5日後に得ることができる。）
  9. のTh17分化は、細胞内染色およびフローサイトメトリー分析、ELISA、またはqPCRにより評価することができる

7。細胞の活性化 （細胞内染色のためにのみ必要）

  1. 72時間または5日間のいずれかの端部にインキュベーターから96ウェルプレートを外し
    1. のTh17 differentiatioことを思い出してくださいnが72時間または5日間のいずれかの後に達成することができる。
  2. 各条件（ 例えば起動制御やiTh17）のために、24ウェル細胞培養プレートの1ウェルに三重にあるセルを転送する。 96ウェルU底培養プレートにトリプリケートであることとは対照的に、一つの条件のための細胞は、現在、24ウェル培養プレートの1ウェルにプールされている。
  3. 24ウェル細胞培養プレートの各ウェルの総容積は、現在600μLのである。細胞培養培地で各ウェルに1ミリリットルの音量を上げる。
  4. 記載された濃度で24ウェル細胞培養プレート中の各ウェルにPMA（ホルボールミリステートアセテート）（50 ng / mlの）、イオノマイシン（1μM）、およびBFA（ブレフェルジン-A）（10μg/ mlの）を添加する。
  5. 4時間37℃でインキュベートする。

8。細胞内染色

  1. フローサイトメトリー解析のために必要な細胞外および細胞内マーカーで染色した細胞。 oをプレゼンスを検出するfはIL-17は、細胞内染色は、抗IL-17A抗体を用いて行われる。推奨される細胞外表面マーカーは、CD4、CD8、およびCD25が含まれる。
    1. IL-17細胞内染色のために、BDバイオサイエンスからの細胞内サイトカイン染色スターターキット - マウスを使用しています。
    2. 各サンプルについて、ペレット細胞は、上清を除去し、200μlのFACSバッファー（PBS中の2％FBS）に再懸濁細胞ペレット。
    3. 96細胞フローサイトメトリープレートに再懸濁細胞を移す。
    4. 1,200 rpmで5分間細胞をスピンダウンし、上清を捨てる。
    5. 200μlのPBS FACS緩衝液、1,200 rpmで5分間遠心を追加し、上澄みを捨てる。
    6. FACS緩衝液100μlに再懸濁細胞と細胞外抗体100μlの（A-B）の混合物（細胞外抗体混合物をFACS緩衝で作られて）を適用。ホイルで覆い、室温で15分間インキュベートする。
    7. ステップ8.1.4を繰り返します。
    8. 手順を繰り返し8.1.5 2X。
    9. BDのCytofix / Cytoperm緩衝液100μl中に細胞を懸濁します。 Incubホイルで覆い、RTで20分間食べた。
    10. 1XのBDパーマ/洗浄緩衝液100μl加え、1,200 rpmで5分間遠心し、上清を捨てる。繰り返します。
    11. 細胞内の抗体混合液50μlを加える。 （細胞内抗体混合物を、1×BDのPerm /洗浄で行われる）箔で覆われたRTで15分間、インキュベートする。
    12. ステップ8.1.10を繰り返します。
    13. BD染色緩衝液200μl中に細胞を懸濁します。
    14. 200μlのBD染色緩衝液（最終容量は400μLである）を含むチューブにフローサイトメトリーに再懸濁した細胞を配置します。
    15. 4℃で保存サンプルが読み込み可能になるまで。

9。フローサイトメトリー分析

  1. ゲート生きた細胞集団。
  2. 生細胞集団からのCD4 + CD8-の人口上のゲート。
  3. CD4 + CD8-集団から、IL-17A +集団上のゲート。
    1. 我々の以前の実験結果に基づいて、IL-17A +集団の100％がCD25 +であろう。

*全絶対細胞数は、サンプル三連をプールした後に得られた
CD4 + CD25 + IL-17A +細胞のように、ライブゲートパーセンテージおよび系統特異的マーカー、CD4、CD25、およびIL-17Aを有する全細胞の割合で細胞の総数を乗じることによって求めた。**の絶対数フローサイトメトリーにより決定した。

10。定量PCRおよびELISA

  1. 場所細胞は、5〜10分間、13,000 rpmで1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブ、遠心分離、フローサイトメトリー分析のために使用されない。遠心分離後に細胞ペレットに見出される細胞は、qPCR分析のために使用される。 qPCR分析は、PTC-200ペルチェサーマルサイクラー（Biorad）を用いて行った。
  2. ELISAの遠心分離チューブから上清を収集します。 IL-17A ELISAは、抗体ペアTC11-18H10（キャプチャ、カタログ番号555068）を使用して実施し、TC11-8H4ビオチン（検出、カタログ番号555067）はBD Biosciences社から購入した。 IL-17A ELISA STAndardsはイーバイオサイエンス（カタログ番号14-8171-80）から得た。
  3. 上清を除去した後、（後で使用するために-80℃でRNA抽出、cDNA合成および定量PCR、または格納のためにすぐに使用する）175μlのRNA溶解緩衝液中でのqPCRに使用する残りの細胞を再懸濁する。
    1. IL-17Aとアクチンのためのプライマー配列は、表IIを参照してください（ハウスキーピング遺伝子）

結果

このTh17の分化プロトコルは、脾臓の摘出および腋窩、上腕、腸間膜、頸部、および鼠径リンパ節から始まります。それぞれの位置の表現は、 図2および図3に見出すことができる。図1および図5の両方が、このプロトコルに記載された方法の視覚的表現を提供する。

このTh17のプロトコルは、CD4 + CD25 - Tリンパ球集団から?...

ディスカッション

ここでは、 インビトロでのTh17分化を達成するためのプロトコルを記載している。のTh17サブセットへのTリンパ球の分化はヒト病原体13の効果的な除去のために重要であるとしてのTh17分化の研究は、重要です。逆に、IL17産生は、自己免疫疾患の進行13と関連している。それは、免疫調節および自己免疫の多数の異なるマウスモデルに適用することができるように、Th17の?...

開示事項

宣言するの開示。

謝辞

この作品は、フロリダ大学のTL1 TR000066とUL1 TR000064、国立衛生研究所、BDバイオサイエンス試薬の助成金、および大学からの親グラントR01AI056152からダイバーシティ·補完するために、NIH / NCATS臨床およびトランスレーショナル科学賞によって部分的にサポートされていますフロリダ州。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent/Material
Sterile Polyestrene Petri DishFisher Scientific0875713A60 mm x 15 mm
autoMACS Running BufferMiltenyi Biotec130-091-221
Premium Microscope Slides, FrostedFisher Scientific12-544-33" x 1"1 mm
5 ml 21G1 Latex Free Syringe and NeedleBD Biosciences309632
Corning 15 ml Centrifuge TubesSigma-AldrichCLS430791
Nylon 40 micronsMiami AquacultureNylon 40/26
Microtest tissue culture plate 96 well U bottom BD Biosciences35-3077
Corning Costar 24 well cell culture platesSigma-AldrichCL3524
Eppendorf Tubes 1.5 mlFisher Scientific05-408-129
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3eBD Biosciences553057
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28BD Biosciences553294
Mouse IL-6 Recombinant ProteineBioscience14-8061-62
TGFbetaR&D Systems240-B-002
Trypan blue solution 0.4 %Sigma-Aldrich66H2364
Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4BD Biosciences558107
APC Rat Anti-Mouse CD8aBD Biosciences553035
PE Conjugated Anti-mouse CD25eBioscienceE01155-516
Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17BD Biosciences560820
Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-MouseBD Biosciences51-2041AK (559311)
MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouseMiltenyi Biotec130-091-221
ABAM Cellgro30-004-CI
RPMICorning, Cellgro10-040-CM
B 2-MercaptoEthanolMP Biomedical194834Hazardous
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA)
Ionomycin Calcium SaltSigma-Aldrich13909-1MLHazardous
Brefeldin A (BFA)MP Biomedicals159027
ELISA IL-17A Capture mAb BD Biosciences555068
ELISA IL-17A Detection mAb BD Biosciences555067
ELISA IL-17A StandardeBioscience14-8171-80
IL-2 ELISA KitBD Biosciences555148
TMB Substrate Reagent Set BD Biosciences555214
Equipment
autoMACS Pro Cell SeparatorMiltenyi Biotec130-092-545
Sorvall Legend RT+ CentrifugeThermoScientific
Napco series 8000 WJ CO2 IncubatorThermoScientific
PTC-200 Peltier Thermal CyclerBiorad

参考文献

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79 Th17 IL 17 Th17 T

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