בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

Summary

עם פונקציות מפעיל להבדיל מתת תא T אחר, תאי Th17 היו מעורבים באופן מרכזי באוטואימוניות דלקתיות. במבחנה פרוטוקול בידול Th17 זו מספק אמצעי כדי לקבוע אם לימפוציטים מסוג CD4 + T נאיביים יכולים להתמיין לתאי Th17, ולבחון את תפקידם באוטואימוניות ותגובת מארח נוסף.

Abstract

תאי Th17 הם תת קבוצה ברורה של תאי T שנמצא לייצר אינטרלוקין 17 (IL-17), ונבדלים בפונקציה מתת התא האחר T כולל Th1, Th2, ותאי T רגולטוריים. Th17 תאים צמחו כאשם מרכזי בתגובות חיסוניים דלקתיות נלהבים מדי קשורות עם הרבה הפרעות אוטואימוניות. בשיטה זו אנו מטהרים לימפוציטים מסוג T מבלוטות הלימפה של הטחול ועכברי C57BL / 6, ולעורר תאי CD4 + T מטוהרים תחת שליטה וסביבות Th17 וישכנע. הסביבה וישכנע Th17 כוללת גירוי בנוכחות נוגדנים אנטי CD3 ואנטי CD28, IL-6, וTGF-β. לאחר דגירה לפחות 72 שעות ועד חמישה ימים על 37 מעלות צלזיוס, תאים מנותחים לאחר מכן ליכולת לייצר IL-17 באמצעות cytometry זרימה, qPCR, וELISAs. יכולים להיות מנוצלים על תאי CD4 + CD25-T Th17 המובחן כדי להבהיר את התפקיד שתאי Th17 לשחק בתחילת ההתקדמות של אוטואימוניות ודה מארח נוסףfense. יתר על כן, התמיינות Th17 של CD4 + CD25-לימפוציטים מדגמי נוקאאוט / מחלה עכבריות מובחנים יכולה לתרום להבנה של פלסטיות גורל תא שלנו.

Introduction

לימפוציטים מסוג CD4 + T (תאי T) לשחק תפקיד קריטי בהגנה בתיווך מערכת חיסון כנגד מיקרואורגניזמים מזהמים. לעומת זאת, תאי T גם קשר אינטימי עם תחילת ההתקדמות של מחלות אוטואימוניות כגון סוכרת מסוג 1, זאבת אדמנתית מערכתית, ודלקת מפרקים שגרונית. לימפוציטים מסוג CD4 + T להיות מופעלים באמצעות שילוב של קולטן תא T אינטראקציות (TCR) עם אנטיגן מאותו המקור / מורכב histocompatibility גדול השנייה מולקולות (MHCII), ואינטראקציות הקולטן CD28 עם B7.1/B7.2 ligands ^15. בנוסף למתן גירוי TCR CD28 ושיתוף גירוי, תאי מציגי אנטיגן גם לספק סביבת ציטוקינים, הקובעת את מצב ההתמיינות של הלימפוציטים T, ובכך לכוון את התגובה של הלימפוציטים T לאנטיגן נתון. אינטראקציות הפתוגן מובחן / תא אנטיגן הצגה ליצור סביבות ציטוקינים שונות, אשר להטות T לימפוציטים למטה מסלולים שונים התמקדו באלייmination של הפתוגן ייזום. למרבה הצער, מסלולי מפעיל לימפוציט T, שנועדו במקור למיגור פולש פתוגנים, יכולים להיות מופנים בטעות נגד רקמות עצמי ^15. לכן, הבנה טובה יותר של מצב הבידול של כל תת קבוצה של תאי CD4 + ברורה היא קריטית להבנה של איך לווסת את האיזון בין החיסול של פתוגנים וסובלנות לעצמי שלנו.

בנוסף לTh1, Th2, ומסלולי התמיינות תאי T רגולטוריים מושרה, יכול גם להיות מונע על לימפוציטים מסוג T נאיבי ידי ציטוקינים במורד מסלול Th17. ואילו פתוגנים תאיים לחימה תאי Th1, תאי Th2 לחסל פתוגנים תאיים, ותאי T רגולטוריים (Tregs) למזער תגובות דלקתיות ^{1, 16;} תאי Th17 לשחק תפקיד חשוב בחיסול חיידקים ופטריות תאיים. Th17 תאים בדרך כלל מצוינים על ידי ביטוי של גורם הייחוס ספציפי לשעתוק RORγT וייצור של IL-17A, אשר מקדם את ההפעלה של מקרופאגים ונויטרופילים ^{1, 7.}

תאי Th17 היו מעורבים בכמה הפרעות אוטואימוניות, ומודלים של המכרסמים הקשורים בם. כך, למשל, הודגם כי IL-23 (אשר נדרש כדי לקיים את הפנוטיפ Th17), אך לא IL-12, הוא האשם המרכזי בדלקת המוח אוטואימונית הניסויי (EAE), מודל המחלה המכרסם לטרשת נפוצה. זה לאחר מכן הוכח כי הפחתה בייצור IL-17 מתואמות לEAE מניעה ^{2, 6, 17.} יתר על כן, תאי Th17 נקשרו עם הפרעות אוטואימוניות אחרות, כולל דלקת מפרקים וזאבת (לופוס) ^{10, 16.} IL-23 p19 לקוי ^{- / -} עכברים הראו את מספרים נמוכים מאוד של תאי Th17, והם עמידים לפיתוח לא רק EAE, אלא גם בדלקת מפרקים קולגן-Induced, מודל לדלקת מפרקים שגרונית ^{10, 18.} בנוסף, עכברים שטופלו בנוגדנים מנטרלים IL-17A בקע מירכי ספינהאה את התחלתה של דלקת מפרקים שנגרם קולגן נמצאה גם יש רזולוציה של נזק משותף ^18. יצוין, כי תפקידיו של Th17 תאים בהתקדמות של מחלות אוטואימוניות עדיין לא מאופיינים כמו מחקר שנעשה לאחרונה הראה גם תפקיד המגן של תאי Th17 בסוכרת מהסוג 1 ^{9, 11} ודלקת מעיים ^14. מחקרים אלה מאשרים את החשיבות של בידול Th17 באוטואימוניות.

בבידול Th17 מבחנה היא שיטת צורך במחקר בתאי T, כי יש לפחות שתי שאלות המביכות שדורשות חקירה נוספת: 1) איך בדיוק IL-6 אין להסדיר את האיזון בין Treg ובידול Th17, ו 2) מה הם המנגנונים המדויקים מאחורי IL-מושרה 17 מחלות דלקתיות? השיטה שלנו מעסיקה תאי CD4 + CD25-T מהטחול ובלוטות לימפה של עכבר C57BL / 6. חשוב לציין כי למרות שזה אפשרי כדי לגרום לבידול Th17 באמצעות טמאאוכלוסייה, רכישה לפחות 80% CD4 טהור + אוכלוסיית תאי CD25-T שוללת כל דאגה של זיהום ומבטיחה תוצאות בידול Th17 מוצלחות יותר. על מנת להשיג בידול Th17 תקין, תאים מסוג CD4 + CD25-T מודגרת בנוכחות אנטי CD3 ואנטי CD28, המספקים אותות הפעלה, 1 ו -2, בהתאמה, ו-IL-6, וTGF-β. למרות שזה כבר דווח כי IL-23 לבדו יכול לשמש כדי להשיג בידול Th17, זה היה מאוחר יותר הוכיח כי IL-23 הוא הכרחי ליציבותה של אוכלוסיית תאי Th17, אבל IL-6 ו TGF-β הוא חיוניים לבידול Th17 ^{3, 18, ​​19.} מחקרים עכבריים הראו כי קולטן IL-23 מתבטא בתאים מסוג CD4 + T רק לאחר שהם כבר מגורה עם IL-6 ו TGF-β ^{13, 18.} כמו כן, תאי Th17 יהיו בהצלחה לפתח בנוכחות של IL-חסימת 23 נוגדנים כל עוד IL-6 ו TGF-β נמצאים ^{18, 19.} ככזה, prov פרוטוקול בידול Th17 זהאידו התנאים המתאימים כדי לגרום לבידול Th17 בהצלחה. פיתוח הבנה טובה יותר של מנגנוני בידול Th17 ו-IL-17 ייצור נוכחי ההזדמנות לפיתוח תרופות טובות יותר שמטרתה הפרעות אוטואימוניות ^13.

Protocol

כל השימוש בבעלי החיים נערכו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש.

1. הכנת תערובות ומדיה

1. pH סטרילי PBS: 7.3 (1 ליטר)
   0.23 גרם לאא ₂ PO ₄
   1.15 גרם Na ₂ HPO ₄
   9.0 גרם NaCl
   קח את נפח עם מים די. לעקר עם החיטוי.
2. תא תרבות מדיה (100 מיליליטר)
   89 RPMI מיליליטר
   10 מיליליטר 10% FBS
   1 מיליליטר האנטיביוטיקה antimycotic (ABAM) 100 מיקרוגרם 50 מ"מ 2-mercaptoethanol (3.5 מיקרוגרם המניה 2-mercaptoethanol ל96.5 מיקרוגרם PBS)
3. 2% FBS FACS חיץ (Cell פלורסנט ההפעלה של מיון) (כדי לשמש במהלך cytometry זרימה) בPBS סטרילי
4. iTh17 מיקס (בהתבסס על מספר דוגמאות, לקבוע את עוצמת הקול דרוש לכל תערובות והתקשורת)
   1.5 מיקרוגרם / מיליליטר אנטי CD28
   20 ng / ml IL-6
   5 ng / mlTGF-β

2. תאים יהיו מצופים בשלושה עותקים בתנאים הבאים

1. צלחת מחויבת אנטי CD3, אנטי CD28 (זה תמהיל שליטת הפעלה).
2. iTH17: צלחת מחויבת אנטי CD3, אנטי CD28, IL-6, TGF-β.

3. אנטי CD3 הנכנס פלייט (10 מיקרוגרם / מיליליטר)

מומלץ כי הכנת צלחות אנטי CD3 הנכנס צלחת נעשה לפחות 4 שעות לפני מועד תאים יתווספו לצלחות.

1. הוסף 30 μl אנטי CD3 לבארות (אנטי CD3 הוא מדולל PBS סטרילי) של צלחת חדשה 96 גם U תחתון Microtest רקמות תרבות, ולהקיש על הצדדים של הצלחת כדי להבטיח כיסוי אחיד של הבארות. לדגור על C ° 37 עבור 4 שעות, ולאחר מכן שומרים במקרר עד שהגיעו הזמן להוסיף את תערובות ותאים לצלחת.

4. העכבר Dissection

1. פרוטוקול זה מבוסס על השימוש בC57BL / 6 מיקרופוןדואר, 3-8 חודשים של גיל, ושנרכש מהמעבדה ג'קסון (בר הרבור, ME).
2. להקריב את העכבר באמצעות CO מחנק _2, ולאשר את המוות עם נקע בצוואר הרחם שלאחר מכן.
3. לעקר כלים לנתיחה עכברים ואזור חתך עם 70% אתנול ולהתחיל נתיחה.
4. מתצוגת הגחון, לתפוס את העור, כי הוא קדמי לפתיחת השופכה ולהתחיל לחתוך במספריים את קו האמצע הגחון עד שמגיע לאזור הסנטר. לנקוט באמצעי זהירות שלא לקרוע או לחתוך לציפוי הפנימי של קיר הבטן.
5. משוך לאחור על העור ולהצמיד כדי לאפשר גישה נוחה לבלוטות הלימפה בעת ההסרה.
6. בלוטות לימפה והטחול ייאספו כל יוסרו עם מלקחיים, והניחו בצלחת פטרי סטרילית המכילה 5 מיליליטר של autoMACS הפעלת המאגר נרכש מMiltenyi יוטכנולוגיים (ראה איורים 2 ו -3 לבלוטות לימפה ודיאגרמות הסרת טחול).
   1. הסר את בלוטות הלימפה בבית השחי, כי הםנמצא ליד בית השחי (בית השחי) מאחורי שרירי החזה של כל עכבר.
   2. הסר את בלוטות הלימפה זרוע הנמצאות ברקמות חיבור הממוקמים בסמוך זה לבית השחי.
   3. הסר את בלוטות הלימפה בצוואר הרחם השטחיות שנמצאו בצווארו של כל עכבר.
   4. הסר את בלוטות הלימפה מפשעתי אשר ממוקמות באזור הירך בשילוב של כלי דם 3.
   5. כדי לגשת לבלוטות לימפה mesenteric, לחתוך דרך הצפק עד קו האמצע הגחון. בלוטות לימפה mesenteric נמצאות ברקמת החיבור שמחזיק את המעיים ביחד. בדרך כלל הם נמצאים בשרשרת של 4-8 צמתים, ועשויים להופיע כ" מחרוזת פנינים ". הקפד לשלוף את המחרוזת כולה.
   6. הטחול נמצא באזור הבטן, מאחורי הקיבה ומעיים. להסיר אותה על ידי משיכת וניתוקו מהלבלב.
7. טוחן את האיברים מתחת למכסת מנוע סטרילית באמצעות 2 שקופיות מיקרוסקופ חלבית. הנח בלוטות הלימפה או טחול עלבצד החלבית של שקופית אחת מיקרוסקופ, ולשפשף עם צד חלבית של השקופית השנייה ועד מתפורר. חזור על פעולה עד שכל בלוטות הלימפה והטחול כבר טחונים.

הערה: מומלץ להתחיל עם בלוטות לימפה ולסיים עם הטחול, כמו הדם יעשה את זה קשה לראות את בלוטות הלימפה שנותרו במאגר autoMACs.

9. כדי לסנן איברי קרקע לתוך השעיה תא בודדת, להתחיל על ידי קיפול מעל פיסת ניילון 40 מיקרומטר כמה פעמים חומר, והצבה בחלקו העליון של צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. חומר הניילון צריך להיות בערך 3 x 3 פנימה
10. השתמש במזרק 5 מיליליטר ו21 מחט G כדי לשאוב 5 מיליליטר של autoMACs ריצת איברי חיץ והקרקע. לוותר לאט לתוך חומר הניילון המקופל. תשמור על עצמך כדי למנוע ניקוב החומר עם המחט.

הערה: לאחר ההשעיה תא בודד מושגת, הפתרון צריך להופיע כפתרון חיוור, עולה בקנה אחד עם שום visibחתיכות le של רקמה מוצקה. אם תישאר מוצקים, מחדש לשאוב ולוותר על דרך פיסה מקופלת חדשה מניילון להציב צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר חדש.

11. תמיד לשמור על תאים על קרח כאשר אינו בשימוש.

5. הפרדת תאים

1. לקבלת תוצאות אופטימליות, להשיג לפחות 80% CD4 טהור + אוכלוסיית CD25 תאים באמצעות מפריד הנייד Pro autoMACS באמצעות MACS CD4 + CD25 + T רגולטוריים בידוד תא הערכה, העכבר. הפרוטוקול לשימור השלילי של אוכלוסיית CD25-תאי CD4 + מתקבל באמצעות Miltenyi ביוטכנולוגיים.

6. בידול Th17

1. לאסוף את אוכלוסיית CD25-תאי CD4 + אחרי פרידה עם מפריד הנייד Pro autoMACS.
2. ספירת תאים בדילול מלא ביחס 1:1000 עם trypan הכחול באמצעות hemocytometer.
3. ברגע שהריכוז כבר נקבע מספירת תאים, לדלל השעיה תא 1 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר בתקשורת תרבות תא.
4. קח את 96 צלחות גם עם הצלחת מחויבת אנטי CD3 לאחר 4 שעות.
5. לשטוף בארות מצופות-CD3 אנטי עם 200 μl של PBS. חזור על 2 פעמים.
   1. לשטוף להוסיף 200 μl של PBS סטרילי לבארות מצופים אנטי CD3 ולהסיר PBS לתוך מיכל פסולת.
6. הוספה של תמהיל iTh17 או תערובת שליטת הפעלת 100 μl (ראה # נקודה 2) לבארות בשלושה עותקים.
7. הוספה של תאים 100 μl לכל טוב שבו בכל תמהיל Th17 או תמהיל שליטת ההפעלה הושם.
8. דגירה תאים לפחות 72 שעה או עד 5 ימים (ניתן להשיג בידול Th17 לאחר 72 שעה או לאחר 5 ימים.)
9. בידול Th17 ניתן להעריך על ידי ניתוח תאיים מכתים ותזרים cytometric, ELISA, או qPCR

7. הפעלת תא (נחוץ רק לתאי מכתים)

1. הסר 96 צלחות גם מחממות בסוף גם 72 שעות או 5 ימים
   1. נזכיר כי differentiatio Th17n יכול להיות מושגת לאחר שני 72 שעות או 5 ימים.
2. עבור כל תנאי (שליטה למשל הפעלה או iTh17), להעביר תאים שנמצאים בשלושה עותקים לאחד טוב של צלחת תרבית תאים גם 24. התאים לתנאי אחד יש עכשיו כבר אספו לתוך אחד טוב של צלחת התרבות גם 24, בניגוד להיותו בשלושה עותקים בצלחת התרבות גם U התחתונה 96.
3. הנפח הכולל של כל טוב בצלחת תרבית תאי 24 גם הוא החברה 600 μl. להעלות את עוצמת הקול של כל אחד גם למ"ל 1 עם תקשורת תרבות תא.
4. הוספת PMA (אצטט phorbol Myristate) (50 ng / ml), ionomycin (1 מיקרומטר), והתואר הראשון (Brefeldin-) (10 מיקרוגרם / מיליליטר) היטב כל אחד בצלחת תרבית תאים גם 24 בריכוזים מופיעים ברשימה.
5. לדגור על C ° 37 במשך 4 שעות.

8. מכתים תאיים

1. תאי כתם עם הסמנים תאיים ו תאיים הרצויים לניתוח התזרים cytometric. כדי לזהות את נוכחות oו IL-17, מכתים תאיים נעשה עם נוגדנים נגד IL-17A. סמני משטח תאיים מומלצים כוללים CD4, CD8, וCD25.
   1. השתמש תאית ציטוקין מכתים Starter Kit-מאוס מBD Bioscience עבור מכתים IL-17 תאיים.
   2. עבור כל דגימה, תאים גלולה, להסיר supernatant, ו resuspend תא גלולה ב200 μl FACS חיץ (2% FBS PBS).
   3. העבר את תאי resuspended ל96 תא זרימת cytometry צלחת.
   4. ספין למטה תאים 5 דקות ב1,200 סל"ד וזורקים supernatant.
   5. הוסף 200 PBS חיץ FACS μl, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 1,200 סל"ד, וזורקים supernatant.
   6. תאי resuspend ב של FACS 100 μl חיץ ולהחיל של נוגדנים תאיים 100 μl תערובת (AB) (תערובת Ab תאית מורכבת בחיץ FACS). דגירה של 15 דקות ב RT, מכוסות בנייר כסף.
   7. חזור על השלב 8.1.4.
   8. 2x חזור על צעד 8.1.5.
   9. Resuspend תאים בשל BD Cytofix / Cytoperm הצפת 100 μl. Incubאכלתי ל20 דקות ב RT, מכוסות בנייר כסף.
   10. הוספה של חיץ 1x BD פרם / לשטוף 100 μl, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 1,200 סל"ד, וזורקים supernatant. חזור על פעולה.
   11. הוסף 50 μl של תערובת Ab תאית. (תערובת תאית Ab הוא עשה ב1x BD פרם / לשטוף) דגירה במשך 15 דקות ב RT, מכוסה בנייר כסף.
   12. חזור על שלב 8.1.10.
   13. Resuspend תאים ב200 μl של BD מכתים הצפת.
   14. מקום תאי resuspended לcytometry זרימת צינורות המכילים 200 μl BD מכתים חוצץ (נפח סופי הוא 400 μl).
   15. חנות ב 4 ° C עד דגימות מוכנות לקריאה.

9. תזרים cytometric ניתוח

1. אוכלוסיית תא חי שער.
2. מאוכלוסיית התא החי, שער בCD4 + CD8-אוכלוסייה.
3. מסוג CD4 + CD8-האוכלוסייה, שער על IL-17A + אוכלוסייה.
   1. בהתבסס על תוצאות הניסוי הקודמות שלנו, של IL-17A + האוכלוסייה 100% יהיו + CD25.

* ספירת תאים מוחלטת סך הכל התקבלו לאחר איגום triplicates המדגם
** מספר מוחלט של CD4 + CD25 + IL-17A + תאים נקבע על ידי הכפלת המספר הכולל של תאים על ידי אחוז השער החי ואחוז התאים בסך הכל נושאים את סמני שושלת ספציפית, מסוג CD4, CD25, ו-IL-17A, כפי נקבע על ידי cytometry זרימה.

10. qPCR וELISA

1. תאי מקום שאינו משמשים לניתוח התזרים cytometric בצינור 1.5 מיליליטר Eppendorf ו צנטריפוגות ב 13,000 סל"ד 5-10 דק '. התאים הנמצאים בתא גלולה לאחר צנטריפוגה ישמשו לניתוח qPCR. ניתוח qPCR בוצע באמצעות Cycler תרמית PTC-200 Peltier (BioRad).
2. איסוף supernatant מן הצינורות centrifuged לELISAs. IL-17A ELISAs בוצע באמצעות צמד נוגדן TC11-18H10 (לכידה, מספר קטלוג 555,068) וביוטין TC11-8H4 (זיהוי, מספר קטלוג 555,067) שנרכש מBiosciences BD. IL-17A ELISA standards התקבלו מeBioscience (מספר קטלוג 14-8171-80).
3. לאחר הסרת supernatant, resuspend התאים שנותרו כדי לשמש לqPCR ב175 מאגר תמוגה RNA μl (להשתמש באופן מיידי להפקת RNA, סינתזת cDNA, וqPCR, או בחנות ב-80 ° C לשימוש מאוחר יותר).
   1. עיין בטבלה השנייה לרצפי פריימר לIL-17A ויקטין (גן בית שמירה)

תוצאות

פרוטוקול הבחנה זו Th17 מתחיל עם ההסרה של הטחול ובית השחי, זרוע, mesenteric, צוואר הרחם, ובלוטות לימפה מפשעתי. ניתן למצוא ייצוג של המיקומים של כל אחד באיורים 2 ו -3. איורים 1 ו 5 שניהם מספקים ייצוג חזותי של השיטות שתוארו בפרוטוקול זה.

Discussion

כאן יש לנו תיארתי את הפרוטוקול כדי להשיג בידול Th17 במבחנה. המחקר של בידול Th17 חשוב, כמו בידול של T לימפוציטים מסוג למשנה Th17 הוא קריטי לחיסול היעיל של פתוגנים אנושיים ^13. לעומת זאת, ייצור IL17 נקשר עם התקדמות מחלה אוטואימונית ^13. השיטה של ​​בידול Th17 ישימה להג?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
Sterile Polyestrene Petri Dish	Fisher Scientific	0875713A	60 mm x 15 mm
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
Premium Microscope Slides, Frosted	Fisher Scientific	12-544-3	3" x 1"1 mm
5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle	BD Biosciences	309632
Corning 15 ml Centrifuge Tubes	Sigma-Aldrich	CLS430791
Nylon 40 microns	Miami Aquaculture	Nylon 40/26
Microtest tissue culture plate 96 well U bottom	BD Biosciences	35-3077
Corning Costar 24 well cell culture plates	Sigma-Aldrich	CL3524
Eppendorf Tubes 1.5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e	BD Biosciences	553057
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28	BD Biosciences	553294
Mouse IL-6 Recombinant Protein	eBioscience	14-8061-62
TGFbeta	R&D Systems	240-B-002
Trypan blue solution 0.4 %	Sigma-Aldrich	66H2364
Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4	BD Biosciences	558107
APC Rat Anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	553035
PE Conjugated Anti-mouse CD25	eBioscience	E01155-516
Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17	BD Biosciences	560820
Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse	BD Biosciences	51-2041AK (559311)
MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-091-221
ABAM	Cellgro	30-004-CI
RPMI	Corning, Cellgro	10-040-CM
B 2-MercaptoEthanol	MP Biomedical	194834	Hazardous
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA)
Ionomycin Calcium Salt	Sigma-Aldrich	13909-1ML	Hazardous
Brefeldin A (BFA)	MP Biomedicals	159027
ELISA IL-17A Capture mAb	BD Biosciences	555068
ELISA IL-17A Detection mAb	BD Biosciences	555067
ELISA IL-17A Standard	eBioscience	14-8171-80
IL-2 ELISA Kit	BD Biosciences	555148
TMB Substrate Reagent Set	BD Biosciences	555214
			Equipment
autoMACS Pro Cell Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545
Sorvall Legend RT+ Centrifuge	ThermoScientific
Napco series 8000 WJ CO2 Incubator	ThermoScientific
PTC-200 Peltier Thermal Cycler	Biorad