L'isolement et la différenciation Th17 de Naïve CD4 des lymphocytes T

Résumé

Avec des fonctions effectrices distinctes des autres sous-ensembles de cellules T, les cellules Th17 ont été impliqués dans l'auto-immunité centre inflammatoire. Cette vitro Th17 protocole de différenciation fournit un moyen de déterminer si les lymphocytes T CD4 + naïfs peuvent se différencier en cellules Th17, et d'examiner leur rôle dans l'auto-immunité et réponse de l'hôte.

Résumé

cellules Th17 sont un sous-ensemble distinct de cellules T qui ont été trouvées pour produire l'interleukine 17 (IL-17), et se différencient en fonction des autres sous-ensembles de cellules T, y compris Th1, Th2, et des cellules T régulatrices. cellules Th17 ont émergé comme un coupable central dans les réponses immunitaires inflammatoires associés à l'excès de zèle de nombreuses maladies auto-immunes. Dans cette méthode, nous purifions lymphocytes T de la rate et des ganglions lymphatiques de souris C57BL / 6, et stimuler les cellules T CD4 + purifiés sous contrôle et environnements Th17 induisant. L'environnement de Th17 inducteur comprend stimulation en présence d'anti-CD3 et anti-CD28, les anticorps de l'IL-6, et TGF-β. Après incubation pendant au moins 72 heures et jusqu'à cinq jours à 37 ° C, les cellules sont ensuite analysées pour la capacité de produire de l'IL-17 par cytométrie en flux, qPCR, et ELISA. cellules différenciées Th17 CD4 + CD25-T peuvent être utilisés pour élucider le rôle que jouent les cellules Th17 dans l'apparition et la progression de l'auto-immunité et de l'hôte defense. En outre, la différenciation Th17 de CD4 + CD25 des lymphocytes à partir de modèles KO / murins de maladies distinctes peut contribuer à notre compréhension du destin cellulaire plasticité.

Introduction

Lymphocytes T CD4 + (cellules T) jouent un rôle critique dans la défense immunitaire à médiation par le système contre les micro-organismes infectieux. A l'inverse, les cellules T sont également intimement associés à l'apparition et la progression des maladies auto-immunes telles que le diabète de type 1, le lupus érythémateux disséminé et l'arthrite rhumatoïde. Lymphocytes T CD4 + sont activées par une combinaison de récepteurs des cellules T (TCR) des interactions avec un antigène apparenté / complexe majeur d'histocompatibilité (CMH II) II des molécules, et des interactions récepteur CD28 avec des ligands B7.1/B7.2 ^15. En plus de la fourniture de la stimulation du TCR et CD28 co-stimulation, les cellules présentatrices d'antigènes offrent également un environnement de cytokines, ce qui détermine l'état du lymphocyte T de différenciation, en dirigeant ainsi la réponse du lymphocyte T à l'antigène donné. Interactions pathogène distincte / cellule présentatrice d'antigène de créer des environnements de cytokines distinctes, qui Skew lymphocytes T vers le bas voies distinctes axées sur la elimination de l'agent pathogène initiateur. Malheureusement, T voies effectrices des lymphocytes, à l'origine destinées à éliminer les pathogènes envahisseurs, peuvent être à tort dirigés contre des auto-tissus ^15. Par conséquent, une meilleure compréhension de l'état de différenciation de chaque sous-ensemble distinct de cellules T CD4 + est essentielle pour notre compréhension de la façon de moduler l'équilibre entre l'élimination des agents pathogènes et la tolérance à l'auto.

En plus de la Th1, Th2, et des voies de différenciation des cellules T régulatrices inductibles, les lymphocytes T naïfs peuvent également être entraînés par des cytokines en bas de la voie Th17. Considérant que les cellules Th1 pathogènes intracellulaires combat, les cellules Th2 éliminer les agents pathogènes extracellulaires, et les lymphocytes T régulateurs (Tregs) minimiser les réactions inflammatoires ^{1, 16;} cellules Th17 jouent un rôle important dans l'élimination des bactéries et des champignons extracellulaires. cellules Th17 sont généralement désignés par l'expression du facteur de transcription spécifique de la lignée RORγT et la production d'IL-17A, ce qui favorise l'activation des macrophages et des ^{neutrophiles, 1 7.}

cellules Th17 ont été impliqués dans plusieurs maladies auto-immunes, et leurs modèles de rongeurs associés. Par exemple, il a été démontré que l'IL-23 (qui est nécessaire pour maintenir le phénotype Th17), mais pas d'IL-12, était le coupable central dans l'encéphalite auto-immune expérimentale (EAE), le modèle de rongeur de la maladie de sclérose en plaques. Il a été montré par la suite que la réduction de la production d'IL-17 sont corrélées à la prévention EAE ^{2, 6, 17.} De plus, les cellules Th17 ont été associés à d'autres maladies auto-immunes comme l'arthrite et le lupus érythémateux disséminé (SLE) ^{10, 16.} IL-23 p19 déficientes ^{- / -} les souris se sont révélés avoir de très faibles nombres de cellules Th17, et sont résistants au développement de l'EAE, non seulement, mais également d'arthrite induite par le collagène, un modèle pour la polyarthrite rhumatoïde ^{10, 18.} En outre, les souris traitées avec des anticorps neutralisants de l'IL-17A à l'arrièreer l'apparition de l'arthrite induite par le collagène ont également été trouvés à avoir une résolution de l'atteinte articulaire ^18. Il convient de noter que le rôle des cellules Th17 dans la progression de la maladie auto-immune reste à caractériser la recherche récente a également montré un rôle protecteur des cellules Th17 dans diabète de type 1 ^{9, 11} et ¹⁴ de l'inflammation intestinale. Ces études confirment l'importance de la différenciation Th17 dans l'auto-immunité.

Dans la différenciation Th17 vitro est une méthode nécessaire à la recherche sur les cellules T, car il ya au moins deux questions troublantes qui nécessitent une enquête plus approfondie: 1) Comment fonctionne exactement IL-6 régulent l'équilibre entre Treg et la différenciation Th17, et 2) Quels sont les mécanismes exacts derrière l'IL-17 induit-troubles inflammatoires? Notre procédé utilise des cellules CD4 + CD25-T à partir des rates et des ganglions lymphatiques de la souris C57BL / 6. Il est important de noter que bien qu'il soit possible d'induire la différenciation Th17 utilisant un impurpopulation, l'acquisition d'au moins une CD4 pur à 80% + population de cellules CD25-T nie toute inquiétude de contamination et garantit des résultats de différenciation Th17 plus de succès. Afin d'obtenir une différenciation adéquate Th17, les cellules CD4 + CD25-T sont incubées en présence d'anticorps anti-CD3 et anti-CD28, qui fournissent des signaux d'activation, 1 et 2, respectivement, et de l'IL-6, et TGF-β. Bien qu'il ait été rapporté que l'IL-23 seule peut être utilisé pour réaliser la différenciation Th17, il a ensuite été démontré que l'IL-23 est nécessaire pour la stabilité de la population de cellules Th17, mais IL-6 et le TGF-β sont essentiels pour la différenciation Th17 ^{3, 18, ​​19.} Des études murines ont montré que le récepteur de l'IL-23 est exprimé sur les cellules T CD4 + seulement après qu'ils ont été stimulées avec de l'IL-6 et le TGF-β ^{13, 18.} En outre, les cellules Th17 vont développer avec succès en présence d'IL-23-anticorps de blocage aussi longtemps que l'IL-6 et TGF-β sont présents ^{18, 19.} En tant que tel, cette différenciation Th17 protocole provIDES les conditions appropriées avec succès pour induire la différenciation Th17. Développement d'une meilleure compréhension des mécanismes qui sous-tendent la différenciation Th17 et IL-17 production présenter l'opportunité pour le développement de meilleurs traitements visant à les troubles auto-immunes ^13.

Protocole

Toute utilisation des animaux a été effectuée conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux.

Une. Préparation des mélanges et des médias

1. Stérile pH PBS: 7.3 (1 L)
   0,23 g de NaH ₂ PO ₄
   1,15 g de Na ₂ HPO ₄
   9,0 g de NaCl
   Prendre avec de l'eau déminéralisée. Stériliser à l'autoclave.
2. Culture Cellulaire médias (100 ml)
   89 ml de RPMI
   10 ml de 10% de FBS
   1 ml Antibiotique antimycosique (ABAM) 100 pg 50 mM de 2-mercaptoéthanol (3,5 ug stock 2-mercaptoéthanol dans 96,5 pg PBS)
3. FACS tampon (Fluorescent Activation tri cellulaire) (Pour être utilisé pendant la cytométrie de flux) FBS 2% dans du PBS stérile
4. iTh17 Mix (Basé sur le nombre d'échantillons, déterminer le volume nécessaire pour tous les mélanges et les médias)
   1,5 pg / ml d'anti-CD28
   20 ng / ml d'IL-6
   5 ng / mlTGF-β

2. Les cellules seront étalées dans Triplicate dans les conditions suivantes

1. Plate lié anti-CD3, anti-CD28 (ce qui est le mélange de commande d'activation).
2. iTH17: Plaque lié l'anti-CD3, anti-CD28, IL-6, TGF-β.

3. Plate-lié l'anti-CD3 (10 pg / ml)

Il est recommandé que la préparation de plaques en forme de plaques anti-CD3 lié est effectué au moins 4 heures avant le moment où les cellules sont ajoutées aux plaques.

1. Ajouter 30 ul anti-CD3 de puits (anti-CD3 est dilué dans du PBS stérile) d'un nouveau puits U bas Microtest tissu plaque 96 de la culture, et appuyez sur les côtés de la plaque pour assurer une couverture uniforme des puits. Incuber à 37 ° C pendant 4 heures, puis réfrigérer jusqu'à ce qu'il soit temps d'ajouter les mélanges et les cellules de la plaque.

4. Souris Dissection

1. Ce protocole est basé sur l'utilisation de la souris C57BL / 6 mice, 3-8 mois, et acheté de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).
2. Sacrifiez souris à l'aide de CO ₂ asphyxie, et confirmer la mort à la dislocation cervicale postérieure.
3. Stériliser souris outils de dissection et de la zone d'incision avec 70% d'éthanol et de commencer la dissection.
4. Du point de vue ventrale, saisir la peau qui est antérieure à l'ouverture de l'urètre et commencer à couper avec des ciseaux jusqu'à la ligne médiane ventrale jusqu'à atteindre la zone du menton. Prendre des précautions pour ne pas déchirer ou de couper dans la muqueuse de la paroi péritonéale.
5. Tirez sur la peau et cerner pour permettre un accès confortable aux ganglions lymphatiques lors de l'enlèvement.
6. Les ganglions lymphatiques et la rate recueillies seront tous retirés avec une pince, et placés dans une boîte de Pétri stérile contenant 5 ml de autoMACS cours Buffer acheté de Miltenyi Biotec (voir les figures 2 et 3 pour les ganglions lymphatiques et les diagrammes d'enlèvement de la rate).
   1. Retirer les ganglions lymphatiques axillaires qui sonttrouvé près de l'aisselle (sous le bras) derrière les muscles pectoraux de chaque souris.
   2. Retirer les ganglions lymphatiques brachial qui se trouvent dans les tissus conjonctifs qui se trouvent à proximité de chaque région axillaire.
   3. Retirer les ganglions lymphatiques cervicaux superficiels présents dans le cou de chaque souris.
   4. Retirer les ganglions lymphatiques inguinaux qui sont situés dans la région de la hanche à la conjonction des trois vaisseaux sanguins.
   5. Pour accéder aux ganglions lymphatiques mésentériques, couper à travers le péritoine jusqu'à la ligne médiane ventrale. Ganglions lymphatiques mésentériques sont présents dans le tissu conjonctif qui maintient ensemble les intestins. Ils se trouvent généralement dans une chaîne de 4-8 nœuds, et peuvent apparaître comme un "collier de perles". Assurez-vous de retirer la totalité de la chaîne.
   6. La rate est situé dans la région abdominale, derrière l'estomac et les intestins. Retirez-le en le tirant et le détacher du pancréas.
7. Broyer les organes sous une hotte stérile en utilisant deux lames de microscope givré. Placez les ganglions lymphatiques ou la rate surle côté givré d'une lame de microscope, et frotter avec le côté givré de la deuxième diapositive jusqu'à désintégré. Répétez jusqu'à ce que tous les nœuds lymphatiques et la rate ont été la terre.

Note: Il est recommandé de commencer par les ganglions lymphatiques et terminer avec la rate, comme le sang, il sera difficile de voir les ganglions lymphatiques restantes dans le tampon autoMACS.

9. Pour filtrer les organes de base dans une suspension cellulaire unique, commencer par pliage d'un morceau de matériau en nylon 40 pm à plusieurs reprises, et en plaçant dans la partie supérieure d'un tube à centrifuger de 15 ml. Le matériau en nylon devrait être d'environ 3 x 3 po
10. Utilisez une seringue de 5 ml et 21 aiguille G pour aspirer les 5 ml de autoMACS cours tampons et organes sol. Distribuer lentement dans le matériau de nylon repliée. Prenez soin de ne pas percer la matière avec l'aiguille.

Remarque: Une fois que la suspension cellulaire unique est atteint, la solution doit apparaître comme une solution cohérente pâle sans VisibLe morceaux de tissu solide. Si les solides restent, re-aspiration et de distribution à travers un nouveau morceau plié de nylon placé dans un nouveau tube de 15 ml de la centrifugeuse.

11. Toujours garder les cellules sur la glace lorsqu'il n'est pas utilisé.

5. Séparation cellulaire

1. Pour des résultats optimaux, obtenir au moins un CD4 pur à 80% + population CD25-cellule par autoMACS séparateur de cellules Pro utilisant le MACS CD4 + CD25 + T réglementaire l'isolement cellulaire kit, souris. Le protocole pour la rétention négative de la population CD25-des cellules CD4 + est obtenue par Miltenyi Biotec.

6. Th17 différenciation

1. Recueillir la population CD25 des cellules CD4 + après la séparation avec le Pro séparateur de cellules autoMACS.
2. Compter les cellules diluées dans un rapport de 1:1000 avec du bleu trypan en utilisant un hémocytomètre.
3. Une fois que la concentration a été déterminée à partir du nombre de cellules, diluer la suspension de cellules à 1 x 10 ⁶ cellules / ml dans des milieux de culture cellulaire.
4. Sortez plaques à 96 puits avec plaque liée anti-CD3 après 4 h.
5. Laver les puits d'anti-CD3-enduites avec 200 ul de PBS. Répétez 2 fois.
   1. Pour laver ajouter 200 ul de PBS stérile aux puits d'anti-CD3-revêtues et supprimer PBS dans un conteneur de déchets.
6. Ajouter 100 ul du mélange iTh17 ou commande d'activation mélange (voir point n ° 2) dans les puits, en triple exemplaire.
7. Ajouter 100 pi de cellules dans chaque puits dans lequel soit le mélange Th17 ou le mélange de commande d'activation a été placé.
8. Incuber les cellules pendant au moins 72 heures ou jusqu'à 5 jours (différenciation Th17 peut être obtenu après 72 heures ou après 5 jours.)
9. différenciation Th17 peut être évaluée par coloration et analyse par cytométrie de flux intracellulaire, ELISA, ou qPCR

7. Activation de la cellule (seulement nécessaire pour intracellulaire coloration)

1. Retirer des plaques 96 puits des incubateurs à la fin de l'une des 72 heures ou 5 jours
   1. Rappelons que Th17 differentiation peut être réalisé soit après 72 heures ou 5 jours.
2. Pour chaque condition (par exemple de commande d'activation ou iTh17), transférer les cellules qui sont en triple dans un puits d'une plaque 24 puits de culture cellulaire. Les cellules pour une condition ont été regroupées dans un puits de la plaque de culture de 24 puits, au lieu d'être en triple exemplaire en bien U plaque inférieure 96 de la culture.
3. Le volume total de chaque puits de la plaque de culture cellulaire de 24 puits est maintenant de 600 ul. Augmenter le volume de chaque puits à 1 ml avec du milieu de culture cellulaire.
4. Ajouter PMA (phorbol myristate acétate) (50 ng / ml), de l'ionomycine (1 uM), et BFA (Brefeldine-A) (10 pg / ml) à chaque puits dans le puits plaque 24 de culture cellulaire à des concentrations indiquées.
5. Incuber à 37 ° C pendant 4 heures.

8. Coloration intracellulaire

1. cellules de coloration avec les marqueurs extracellulaires et intracellulaires souhaités pour l'analyse par cytométrie de flux. Pour détecter la présence of IL-17, la coloration intracellulaire est réalisée avec des anticorps anti-IL-17A. Marqueurs de surface extracellulaires recommandées comprennent CD4, CD8, CD25 et.
   1. Utilisez la cytokine intracellulaire coloration Starter Kit-souris de BD Biosciences de l'IL-17 intracellulaire coloration.
   2. Pour chaque échantillon, un culot de cellules, enlever le surnageant et culot de cellules de remettre en suspension dans 200 ul de tampon FACS (FBS à 2% dans du PBS).
   3. Transfert cellules remises en suspension à 96 flux de cellules cytométrie plaque.
   4. Spin cellules vers le bas pendant 5 min à 1200 rpm et éliminer le surnageant.
   5. Ajouter 200 pi de tampon PBS FACS, centrifugeuse pendant 5 min à 1200 rpm, et éliminer le surnageant.
   6. Resuspendre les cellules dans 100 ul de tampon FACS et s'appliquent 100 ul d'anticorps extracellulaire de mélange (Ab) (Ac extracellulaire mélange est effectué dans un tampon FACS). Incuber pendant 15 min à température ambiante, recouverte d'une feuille.
   7. Répétez l'étape 8.1.4.
   8. Répétez l'étape 8.1.5 2x.
   9. Remettre en suspension les cellules dans 100 ul de BD Cytofix / Cytoperm tampon. Incubmangé pendant 20 min à température ambiante, recouverte d'une feuille.
   10. Ajouter 100 ul de tampon 1x BD Perm / Wash, centrifuger pendant 5 min à 1200 rpm, et éliminer le surnageant. Répétez.
   11. Ajouter 50 ul de mélange Ab intracellulaire. (Mélange intracellulaire Ab est faite en 1x BD Perm / Wash) Incuber pendant 15 min à température ambiante, recouverte d'une feuille.
   12. Répétez l'étape 8.1.10.
   13. Remettre en suspension les cellules dans 200 ul de tampon de marquage BD.
   14. Placez cellules remises en suspension dans cytométrie de flux des tubes contenant 200 pi BD tampon de marquage (volume final est de 400 pi).
   15. Conserver à 4 ° C jusqu'à ce que des échantillons sont prêts à être lu.

9. Analyse par cytométrie en flux

1. Porte population de cellules vivantes.
2. De la population de cellules vivantes, porte sur CD4 + CD8-population.
3. De l'CD8-population CD4 +, porte sur l'IL-17A + population.
   1. Sur la base de nos résultats expérimentaux précédents, 100% de l'IL-17A + population sera CD25 +.

* Le nombre total de cellules absolues ont été obtenus après la mise en commun des échantillons en triple
** Nombre absolu de cellules CD4 + CD25 + IL-17A + cellules a été déterminé en multipliant le nombre total de cellules par le pourcentage de la grille en direct, et le pourcentage de cellules totales portant les marqueurs spécifiques de la lignée, CD4, CD25 et IL-17A, comme déterminés par cytométrie en flux.

10. qPCR et ELISA

1. cellules place pas utilisées pour l'analyse par cytométrie en flux dans un tube Eppendorf et centrifuger de 1,5 ml à 13 000 tours par minute pendant 5-10 min. Les cellules présentes dans le culot de cellules après centrifugation, seront utilisés pour l'analyse qPCR. analyse qPCR a été effectuée à l'aide de PTC-200 Peltier cycleur thermique (Biorad).
2. Recueillir le surnageant des tubes centrifugés pour ELISA. IL-17A ELISA ont été effectuées en utilisant deux anticorps TC11-18H10 (capture, le numéro de catalogue 555068) et TC11-8H4 biotine (détection, le numéro de catalogue 555067) a acheté de BD Biosciences. IL-17A ELISA standards ont été obtenus à partir de eBioscience (numéro de catalogue 14-8171-80).
3. Après élimination du surnageant, remettre en suspension les cellules restantes à être utilisés pour la qPCR dans 175 de tampon de lyse d'ARN ul (utiliser immédiatement pour l'extraction de l'ARN, la synthèse d'ADNc et PCR quantitative, ou conserver à -80 ° C pour une utilisation ultérieure).
   1. Reportez-vous au tableau II pour les séquences d'amorces pour l'IL-17A et l'actine (gène maison de maintien)

Résultats

Ce protocole de différenciation Th17 commence par le prélèvement de la rate et de la axillaire, brachiale, mésentériques, utérus, et les ganglions lymphatiques inguinaux. Une représentation de l'emplacement de chacun peuvent être trouvées dans les figures 2 et 3. Les figures 1 et 5 fois fournissent une représentation visuelle des méthodes décrites dans ce protocole.

Ce protocole Th17 met l'accent sur la différenciation d...

Discussion

Ici, nous avons décrit le protocole pour obtenir la différenciation in vitro de Th17. L'étude de la différenciation Th17 est important, que la différenciation des lymphocytes T dans le sous-ensemble Th17 est essentiel pour l'élimination efficace des agents pathogènes humains ^13. A l'inverse, la production IL17 a été associée à la progression de la maladie auto-immune ^13. Le procédé de différenciation Th17 est applicable à de nombreux paramètres de reche...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
Sterile Polyestrene Petri Dish	Fisher Scientific	0875713A	60 mm x 15 mm
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
Premium Microscope Slides, Frosted	Fisher Scientific	12-544-3	3" x 1"1 mm
5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle	BD Biosciences	309632
Corning 15 ml Centrifuge Tubes	Sigma-Aldrich	CLS430791
Nylon 40 microns	Miami Aquaculture	Nylon 40/26
Microtest tissue culture plate 96 well U bottom	BD Biosciences	35-3077
Corning Costar 24 well cell culture plates	Sigma-Aldrich	CL3524
Eppendorf Tubes 1.5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e	BD Biosciences	553057
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28	BD Biosciences	553294
Mouse IL-6 Recombinant Protein	eBioscience	14-8061-62
TGFbeta	R&D Systems	240-B-002
Trypan blue solution 0.4 %	Sigma-Aldrich	66H2364
Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4	BD Biosciences	558107
APC Rat Anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	553035
PE Conjugated Anti-mouse CD25	eBioscience	E01155-516
Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17	BD Biosciences	560820
Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse	BD Biosciences	51-2041AK (559311)
MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-091-221
ABAM	Cellgro	30-004-CI
RPMI	Corning, Cellgro	10-040-CM
B 2-MercaptoEthanol	MP Biomedical	194834	Hazardous
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA)
Ionomycin Calcium Salt	Sigma-Aldrich	13909-1ML	Hazardous
Brefeldin A (BFA)	MP Biomedicals	159027
ELISA IL-17A Capture mAb	BD Biosciences	555068
ELISA IL-17A Detection mAb	BD Biosciences	555067
ELISA IL-17A Standard	eBioscience	14-8171-80
IL-2 ELISA Kit	BD Biosciences	555148
TMB Substrate Reagent Set	BD Biosciences	555214
			Equipment
autoMACS Pro Cell Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545
Sorvall Legend RT+ Centrifuge	ThermoScientific
Napco series 8000 WJ CO2 Incubator	ThermoScientific
PTC-200 Peltier Thermal Cycler	Biorad