분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

요약

다른 T 세포의 하위 집합에서 별개의 이펙터 기능으로, TH17 세포는 중앙 염증성자가 면역 질환에 연루되어있다. 이 체외 TH17 분화 프로토콜은 순진 CD4 + T 림프구는 TH17 세포로 분화 할 수 있고, 또한자가 면역 및 호스트 응답에서 자신의 역할을 조사할지 여부를 결정하는 방법을 제공합니다.

초록

TH17 세포는 17 (IL-17) 인터루킨 생산하는 것으로 확인 된 T 세포의 서브 세트 별개이며, TH1, TH2, 규제 T 세포를 포함한 다른 T 세포의 서브 세트에서 기능이 다르다. TH17 세포는 많은자가 면역 질환과 관련된 지나치게 염증 면역 반응의 중심 원인으로 등장했습니다. 이 방법에서 우리는 C57BL / 6 마​​우스의 비장과 림프절에서 T 림프구를 정화하고, 제어 및 TH17 유도하는 환경에서 정제 된 CD4 + T 세포를 자극한다. TH17 유발 환경은 항 CD3 및 항 CD28 항체, IL-6와 TGF-β의 존재에 자극을 포함한다. 최소 72 시간 동안 배양 한 후 37 ° C에서 최대 5 일 동안 세포는 이후 세포 계측법, qPCR에, 및 ELISA를 흐름을 통해 IL-17을 생산하는 기능을 분석하고 있습니다. TH17 분화 된 CD4 + CD25-T 세포는 또한 TH17 세포가자가 면역 및 호스트 드의 발병 및 진행에서 재생하는 역할을 규명하기 위해 이용 될 수있다범법. 또한, 별개의 쥐 녹아웃 / 질병 모델에서 CD4 + CD25-림프구의 TH17 분화는 세포의 운명의 가소성에 대한 우리의 이해에 기여할 수있다.

서문

CD4 + T 림프구 (T 세포) 전염성 미생물에 대한 면역 체계가 중재 방어에 중요한 역할을한다. 역으로, T 세포들은 속속들이 예컨대 제 1 형 당뇨병, 전신성 홍 반성 루푸스, 류마티스 관절염과 같은자가 면역 질환의 발병 및 진행과 연관된다. CD4 + T 림프구는 T 세포 수용체 동족 항원 / 주요 조직 적합성 복합체 II (MHCII) 분자 (TCR)의 상호 작용의 결합을 통해 활성화되고, B7.1/B7.2와 CD28 수용체의 상호 작용은 ¹⁵ 리간드. TCR 자극 및 CD28 동시 자극의 제공뿐만 아니라, 항원 제시 세포는 또한 이에 관련 항원에 T 림프구의 응답을 연출, T 림프구의 분화 상태를 결정 사이토킨 환경을 제공한다. 고유 병원체 / 항원 제시 세포 상호 작용은 T는 엘리에 초점을 맞춘 독특한 경로를 림프구 왜곡 별개의 사이토 카인 환경을 만들고,시작 병원체의 mination. 불행하게도, 원래 병원균을 침해 근절하기 위해 디자인 된 T 림프구의 음향 경로는 잘못 자기 조직 ^(15)에 대항 할 수 있습니다. 따라서, 각 별개의 CD4 + T 세포의 부분 집합의 분화 상태를 더 잘 이해 병원균의 제거 및 자기 내성 사이의 균형을 조절하는 방법에 대한 우리의 이해에 중요합니다.

TH1, TH2, 및 유도 성 조절 T 세포 분화 경로 이외에, 나이브 T 림프구는 TH17 통로 다운 사이토킨에 의해 구동 될 수있다. Th1 세포 전투 세포 내 병원체 반면에, TH2 세포는 세포 외 병원균을 제거하고, 규제 T 세포 (Tregs가)는 염증 반응 ^{하나, (16)을} 최소화; TH17 세포는 세포 외 박테리아 및 곰팡이의 제거에 중요한 역할을한다. TH17 세포는 일반적 계보 특정 전사 인자 및 IL RORγT 생산의 식으로 표시된다대식 세포와 호중구 ^{1, 7의} 활성화를 촉진-17A.

TH17 세포는 여러 가지자가 면역 질환에 연루 및 관련 설치류 모델이되었다. 예를 들어,이 IL-23 (TH17 표현형을 유지하는데 요구되는) 것으로 증명되었다 아니지만 IL-12, 실험자가 면역성 뇌염 (EAE)의 중심 범인, MS를위한 설치류 질환 모델. 그것은 이후 IL-17의 생산 감소가 EAE 방지 ^{2, 6, 17에} 상관 관계가 있음을 보였다. 더욱이, TH17 세포 관절염 및 전신성 홍 반성 루푸스 (SLE) ^{(10), (16)을} 포함하는 다른 자기 면역 질환과 관련되었다. IL-23 결핍 P19 ^{- / -} 생쥐는 TH17 세포의 매우 낮은 숫자를 가지고 표시하고, EAE뿐만 아니라 개발에 저항했지만, 콜라겐 유도 관절염, 류마티스 관절염 ^{10, 18} 모델. 또, 마우스 후미 IL-17A의 중화 항체로 처리ER 콜라겐 - 유도 관절염의 발병은 또한 관절 손상 ^(18)의 해상도를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이는 최근의 연구는 또한, 제 1 형 ^{당뇨병으로 15, 11,} 장내 염증 ¹⁴ TH17 세포의 보호 역할을 나타낸 것처럼 면역 질환의 진행에 TH17 세포의 역할은 특성화 될 남아 있음을 주목해야한다. 이러한 연구는자가 면역에 TH17 차별화의 중요성을 확인합니다.

1) 정확히 어떻게 IL-6는 Treg의와 TH17 분화 사이의 균형을 조절 않으며, 2) 정확한 메커니즘은 무엇입니까 : 추가 조사가 필요 적어도 두 곤혹 질문이 있기 때문에 체외 TH17의 분화 T 세포 연구에 필요한 방법은 IL-17에 의한 염증성 질환 뒤에? 우리의 방법은 C57BL / 6 마​​우스의 비장 및 림프절에서 CD4 + CD25-T 세포를 이용한다. 그것은주의하는 것이 중요합니다 그것은 불순한를 사용 TH17 분화를 유도 할 수 있지만인구는 80 %의 순수한 CD4 + CD25-T 세포 인구를 획득하는 것은 오염의 걱정을 부정하고 성공 TH17 분화의 결과를 보장합니다. 적절한 TH17 감별을 달성하기 위하여, CD4 + CD25-T 세포는 각각 항-CD3 및 항-CD28, 활성화 신호를 제공하고, 1 및 2의 존재하에 배양하고, IL-06과 TGF-β. 이 IL-23 단독는 TH17 분화를 달성하는 데 사용될 수 있다고보고되었지만, 나중에 IL-23 TH17 세포군의 안정성 필요하다고 입증되었지만, IL-6, TGF-β는 TH17 분화에 필수적인 ^{3, 18, ​​19.} 쥐의 연구는 IL-23 수용체가 IL-6와 TGF-β ^{13, 18로} 자극 된 후에 만 CD4 + T 세포에 발현되는 것으로 나타났습니다. 또한, TH17 세포가 성공적으로 한 IL-6와 TGF-β는 ^{18, 19} 존재로 IL-23-차단 항체의 존재에 개발할 것입니다. 이와 같이,이 TH17 분화 프로토콜 prov에성공적으로 TH17의 분화를 유도 할 수있는 적절한 조건을 십오. 자가 면역 질환 ^13을 목표로 더 나은 치료제의 개발을위한 기회를 제공 TH17 차별화와 IL-17 생산을 기본 메커니즘에 대한 이해의 개발.

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프로토콜

모든 동물의 사용은 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 검토를 실시하였습니다.

1. 믹스 미디어의 준비

1. 멸균 PBS 산도 : 7.3 (1 L)
   0.23 g의의 NaH ₂ PO ₄
   1.15 g 나 ₂ HPO ₄
   9.0 g의 NaCl
   DI 물과 볼륨을 차지합니다. 오토 클레이브로 멸균.
2. 세포 배양 배지 (100 ㎖)
   89 ML의 RPMI
   10 ㎖의 10 % FBS
   1 ㎖ 항생제 항진균 (ABAM) 100 μg하는 50 mM 2 - 머 캅토 에탄올 (96.5 μg PBS에 3.5 μg 주식 2 - 머 캅토 에탄올)
3. 멸균 PBS에 FACS 버퍼 (형광 활성화 셀 정렬) (유동 세포 계측법 동안 사용되는) 2 % FBS
4. iTh17 믹스 (샘플 수에 따라 모든 믹스 및 미디어에 필요한 양을 결정)
   1.5 ㎍ / ㎖의 항-CD28
   20 NG / ML IL-6
   5 NG / MLTGF-β

2. 세포는 이하의 조건 중으로 도금 될 것인가

1. 항-CD3 바인딩 플레이트는, 항-CD28 (이것은 활성화 제어 혼합이다).
2. iTH17 : 플레이트 항 CD3 결합, 항 CD28, IL-6, TGF-β.

3. 플레이트 바인딩 항 CD3 (10 ㎍ / ㎖)

그것은 플레이트 바인딩 항 CD3 판의 준비는 이전에 세포가 플레이트에 추가 할 시간을 적어도 4 시간을 수행하는 것이 좋습니다.

1. 웰에 30 ㎕의 항 CD3 추가 새 96 잘 U 바닥 MICROTEST 조직 배양 플레이트 (항 CD3 멸균 PBS에 희석), 그리고 우물의 균일 한 커버리지를 보장하기 위해 판의 측면을 누릅니다. 이 판에 믹스 및 셀을 추가하는 시간이 될 때까지 냉장 후 4 시간 동안 37 ° C에서 부화합니다.

4. 마우스 해부

1. 이 프로토콜은 C57BL / 6 MIC의 사용에 기초전자, 3-8 세의 월, 잭슨 연구소 (바 하버, ME)에서 구입.
2. CO ₂ 질식을 사용하여 마우스를 희생하고, 이후의 자궁 경부 탈구 죽음을 확인합니다.
3. 70 % 에탄올로 쥐 해부 도구와 절개 영역을 소독하고 해부를 시작합니다.
4. 복부보기에서 요도구에 앞쪽에 피부를 잡아 턱의 영역에 도달 할 때까지 가위로 복부 중간 선을 절단 시작합니다. 주의 눈물이나 복막 벽의 안감으로 절단하지보십시오.
5. 피부에 당겨 제거하는 동안 림프절에 편안하게 액세스 할 수 있도록 아래로 핀.
6. 수집 된 림프절과 비장은 모든 집게로 제거하고, 버퍼 (림프절, 비장 제거 다이어그램 그림 2와 그림 3 참조)있는 Miltenyi Biotec은에서 구입 한 실행 autoMACS 5 ㎖를 포함하는 멸균 페트리 접시에 배치됩니다.
   1. 있는 액와 림프절을 제거각 마우스의 가슴 근육 뒤에 겨드랑이 (겨드랑이) 근처에서 발견.
   2. 각각의 겨드랑이 근처에있는 결합 조직에있는 상완 림프절을 제거합니다.
   3. 각 마우스의 목에서 발견 된 표면 경부 림프절을 제거합니다.
   4. 3 혈관의 결합에 엉덩이 지역에 위치한 서혜부 림프절을 제거합니다.
   5. 복막 안감까지 복부 정중선을 극복 장간막 림프절을 액세스 할 수 있습니다. 장간막 림프절은 내장을 함께 보유하고있는 결합 조직에서 발견된다. 그들은 일반적으로 4-8 노드의 문자열에서 발견되고, "진주의 문자열"로 나타날 수 있습니다. 전체 문자열을 당겨해야합니다.
   6. 비장은 위장 뒤에 복부 지역에 위치하고 있습니다. 췌장에서 당겨 분리하여 제거합니다.
7. 2 젖빛 현미경 슬라이드를 사용하여 멸균 후드 기관을 갈기. 림프절이나 비장에 배치해체 될 때까지 두 번째 슬라이드의 프로스트면이 하나의 현미경 슬라이드, 문지의 프로스트 쪽. 모든 림프절, 비장 접지 될 때까지 반복합니다.

참고 : 혈액이 어려운 autoMACs 버퍼에 남아있는 림프절을 볼 것 같은 그것은, 림프절로 시작하고 비장 마무리하는 것이 좋습니다.

9. 단일 세포 현탁액으로 접지 장기를 필터링하기 위해 40 ㎛의 나일론 조각 위에 재료를 여러 번 접어, 및 15 ㎖의 원심 관의 상부에 위치시킴으로써 시작된다. 나일론 소재는 약 3 × 3인치해야
10. 버퍼와 지상 장기 실행 autoMACs의 5 ㎖를 흡인하는 5 ML의 주사기와 21 G 바늘을 사용합니다. 접힌 나일론 소재로 천천히 분배. 바늘과 재료를 천공 않도록주의하십시오.

참고 : 하나의 세포 현탁액이 달성되면,이 솔루션은 visib없이 함께 창백한, 일관된 솔루션으로 나타납니다단단한 조직의 르 조각. 고체, 다시 대기음을 유지하고 새로운 15 ML의 원심 분리기 튜브에 넣고 나일론의 새로운 접힌 부분을 분배합니다.

11. 사용하지 않을 때는 항상 얼음에 세포를 유지.

5. 세포 분리

1. 최적의 결과를 MACS CD4 + CD25 + 조절 T 세포 격리 키트, 마우스를 사용 autoMACS 프로 셀 구분을 통해 80 %의 순수한 CD4 + CD25-세포 집단을 구하십시오. CD4 + CD25-세포 집단의 네거티브 유지를위한 프로토콜이있는 Miltenyi Biotec 사를 통해 얻을 수있다.

6. TH17 차별화

1. autoMACS 프로 전지 세퍼레이터로 분리 한 후 CD4 + CD25-세포 인구를 수집합니다.
2. 혈구를 사용하여 트리 판 블루 1:1000 비율로 희석하여 세포를 계산합니다.
3. 농도 세포 수로부터 결정되면, 세포 배양 배지에서 1 × ¹⁰⁶ 세포 / ml로 세포 현탁액을 희석.
4. 4 시간 후 항 CD3 바인딩 플레이트 96 웰 플레이트를 꺼내.
5. PBS 200 μL와 항 CD3 코팅 우물을 씻으십시오. 2 회 반복한다.
   1. 세척하는 것은 항 CD3 코팅 우물에 멸균 PBS 200 ㎕를 추가하고 폐기물 용기에 PBS를 제거합니다.
6. 세중 우물에 iTh17 혼합 또는 활성화 제어 믹스 100 μL (포인트 # 2 참조)를 추가합니다.
7. 각 웰 TH17 혼합 또는 활성화 제어 혼합 하나가 배치 된에에 세포 100 μl를 추가합니다.
8. 최소 72 시간 동안 5 일까지 세포를 품어 (TH17 분화는 72 시간 후 5 일 이후에 얻을 수있다.)
9. TH17 분화 세포 내 염색과 유세포 분석, ELISA, 또는 qPCR에 의해 평가 될 수있다

7. 세포 활성화 (필요시에만 세포 내 염색 용)

1. 72 시간 5 일 중 하나의 끝에 인큐베이터에서 96 웰 플레이트를 제거
   1. 그 리콜 TH17의 differentiatio여기서 n은 72 시간 5 일 중 하나 후에 달성 할 수있다.
2. 각 조건 (예를 들어 활성화 제어 또는 iTh17)의 경우, 24 웰 세포 배양 플레이트 잘 하나에 세중의에 세포를 전송합니다. 96 잘 U 바닥 배양 접시에 회 반복되는 반대로 하나의 조건에 대한 세포는 지금 24 잘 문화 판의 한 우물에 풀링되었습니다.
3. 24 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰의 총 부피는 지금 600 μL이다. 물론 세포 배양 배지 1 ml로 각각의 볼륨을 높이고.
4. (1 μM)을 이오 노마 이신, PMA (포르 미리 스테이트 아세테이트) (50 NG / ML)를 추가하고, BFA (Brefeldin-A) (10 ㎍ / ml)에 나와있는 농도에서 24 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰.
5. 4 시간 동안 37 ℃에서 배양한다.

8. 세포 내 염색

1. 유세포 분석을위한 원하는 세포 외 및 세포 내 마커 스테인 세포. 프리젠 O를 검출F IL-17은 세포 내 염색은 항-IL-17A의 항체로 수행됩니다. 추천 세포 표면 마커는 CD4, CD8, 및 CD25 (가) 있습니다.
   1. IL-17 세포 내 염색에 BD 바이오 사이언스에서 세포 내 사이토 카인 염색법 스타터 키트 - 마우스를 사용합니다.
   2. 각 샘플의 경우, 펠렛 세포는, 상층 액을 제거하고, 200 ㎕의 FACS 버퍼 (PBS 2 % FBS)에 재현 탁 세포 펠렛.
   3. 플레이트 세포 계측법 96 셀 흐름에 재현 탁 세포를 전송합니다.
   4. 1,200 rpm에서 5 분 동안 세포를 스핀 다운 및 뜨는 폐기.
   5. 1,200 rpm에서 5 분 동안 200 ㎕의 PBS FACS 버퍼, 원심 분리기를 추가하고, 상층 액을 버린다.
   6. FACS 100 μL에 재현 탁 세포는 버​​퍼와 세포 항체 100 ㎕를 (AB) 혼합물 (AB 세포 혼합물을 FACS 버퍼 제)를 적용한다. 호일로 덮여 RT에서 15 분, 알을 품다.
   7. 8.1.4 단계를 반복합니다.
   8. 단계를 반복 8.1.5 배.
   9. BD Cytofix / Cytoperm 버퍼 100 μL의 세포를 Resuspend. Incub호일로 덮여 RT에서 20 분, 위해 먹었다.
   10. 1X BD 파마 / 워시 버퍼 100 μl를 추가, 1,200 rpm에서 5 분 동안 원심 분리하고, 상층 액을 버린다. 반복합니다.
   11. 세포 내 AB 혼합물의 50 μl를 추가합니다. 호일로 덮여, RT에서 15 분 동안 배양 (세포 내 AB 혼합물 1X BD 파마 / 워시 제).
   12. 8.1.10 단계를 반복합니다.
   13. BD 염색 버퍼 200 μL의 세포를 Resuspend.
   14. 200 ㎕의 BD 염색 버퍼 (최종 부피가 400 ㎕의 경우) 포함 튜브 유동 세포 계측법에 재현 탁 세포를 놓습니다.
   15. 4 ° C에서 보관 샘플을 읽을 준비가 될 때까지.

9. 유세포 분석

1. 게이트 라이브 세포 인구.
2. 라이브 세포 인구에서, CD4 + CD8 인구에 게이트.
3. CD4 + CD8 인구에서, IL-17A + 인구에 문입니다.
   1. 우리의 이전 실험 결과에 기초하여, IL-17A + 인구의 100 %가 CD25 +의 것이다.

* 전체 절대 세포 수치는 샘플에서 삼중 풀링 후에 얻었다
** CD4 + CD25 + IL-17A + 세포의 절대 수는 라이브 게이트 백분율 및 계통 특이 마커, CD4, CD25, 및 IL-17A 베어링 전체 세포의 비율에 의해 셀의 총 개수를 곱으로 결정 하였다 유동 세포 계측법에 의해 결정.

10. qPCR에와 ELISA

1. 장소 세포는 5 ~ 10 분 동안 13,000 rpm에서 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브와 원심 분리기에서 유세포 분석을 위해 사용되지 않습니다. 원심 분리 후 세포 펠렛에있는 세포의 qPCR 분석을 위해 사용될 것이다. 의 qPCR 분석은 PTC-200 펠티에 열 사이 클러 (바이오 래드)를 사용하여 실시 하였다.
2. ELISA를위한 원심 분리 관에서 상층 액을 수집합니다. IL-17A ELISA를이 항체 쌍 TC11-18H10 (캡처, 카탈로그 번호 555068)를 사용하여 수행하고 TC11-8H4의 비오틴 (검출, 제품 번호 555067) BD 바이오 사이언스에서 구입했다. IL-17A ELISA 역ndards은의 eBioscience (카탈로그 번호 14-8171-80)으로 하였다.
3. 상층 액을 제거한 후, (나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 RNA 추출, cDNA 합성 및 qPCR에, 또는 상점을 즉시 사용) 175 ㎕의 RNA 용해 버퍼에 qPCR에 사용되는 나머지 세포를 재현 탁.
   1. IL-17A와 말라 (집 지키는 유전자)에 대한 프라이머 시퀀스 표 2를 참조하십시오

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결과

이 TH17 분화 프로토콜은 비장의 제거와 겨드랑이, 상완, 장간막, 자궁 경부, 서혜부 림프절로 시작합니다. 각각의 위치의 표현은,도 2 및 3에서 찾을 수있다. 그림 1과 5는 모두이 프로토콜에 설명 된 방법의 시각적 표현을 제공합니다.

이 TH17 프로토콜은 CD4 + CD25-T 림프구 인구에서 차별화에 초점을 맞추고 있습니다. 그것은 autoMACS 프로 세?...

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토론

여기에서 우리는 체외 TH17 차별화를 달성하기 위해 프로토콜을 설명했다. T의 분화가 인간의 병원균 ^(13)의 효과적인 제거를위한 중요 TH17 하위 집합으로 림프구로 TH17 분화 연구는 중요하다. 반대로, IL17의 생산은자가 면역 질환의 진행 ^(13)와 연결되어 있습니다. 이 면역 조절 및자가 면역의 수많은 별개의 뮤린 모델에 적용 할 수 TH17 분화의 방법은 많은 연구의 설정에 적용 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Sterile Polyestrene Petri Dish	Fisher Scientific	0875713A	60 mm x 15 mm
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
Premium Microscope Slides, Frosted	Fisher Scientific	12-544-3	3" x 1"1 mm
5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle	BD Biosciences	309632
Corning 15 ml Centrifuge Tubes	Sigma-Aldrich	CLS430791
Nylon 40 microns	Miami Aquaculture	Nylon 40/26
Microtest tissue culture plate 96 well U bottom	BD Biosciences	35-3077
Corning Costar 24 well cell culture plates	Sigma-Aldrich	CL3524
Eppendorf Tubes 1.5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e	BD Biosciences	553057
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28	BD Biosciences	553294
Mouse IL-6 Recombinant Protein	eBioscience	14-8061-62
TGFbeta	R&D Systems	240-B-002
Trypan blue solution 0.4 %	Sigma-Aldrich	66H2364
Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4	BD Biosciences	558107
APC Rat Anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	553035
PE Conjugated Anti-mouse CD25	eBioscience	E01155-516
Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17	BD Biosciences	560820
Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse	BD Biosciences	51-2041AK (559311)
MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-091-221
ABAM	Cellgro	30-004-CI
RPMI	Corning, Cellgro	10-040-CM
B 2-Mercapt–thanol	MP Biomedical	194834	Hazardous
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA)
Ionomycin Calcium Salt	Sigma-Aldrich	13909-1ML	Hazardous
Brefeldin A (BFA)	MP Biomedicals	159027
ELISA IL-17A Capture mAb	BD Biosciences	555068
ELISA IL-17A Detection mAb	BD Biosciences	555067
ELISA IL-17A Standard	eBioscience	14-8171-80
IL-2 ELISA Kit	BD Biosciences	555148
TMB Substrate Reagent Set	BD Biosciences	555214
Equipment
autoMACS Pro Cell Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545
Sorvall Legend RT+ Centrifuge	ThermoScientific
Napco series 8000 WJ CO2 Incubator	ThermoScientific
PTC-200 Peltier Thermal Cycler	Biorad