Seguimiento del comportamiento a largo plazo de Libremente Natación débilmente eléctrico Fish

Resumen

Se describe un conjunto de técnicas para el estudio de la conducta espontánea de nadar libremente peces débilmente eléctrica durante un período prolongado de tiempo, de forma sincrónica medir el tiempo de descarga de órgano eléctrico del animal, la posición del cuerpo y la postura tanto de forma precisa y fiable en un tanque del acuario especialmente diseñado dentro de un sensorial cámara de aislamiento.

Resumen

Seguimiento del comportamiento a largo plazo puede capturar y cuantificar las conductas animales naturales, incluyendo las que ocurren con poca frecuencia. Conductas tales como la exploración y las interacciones sociales pueden ser mejor estudiados mediante la observación, los animales comportarse libremente sin restricciones. Peces eléctricos débilmente (WEF) de visualización exploratoria fácilmente observables y el comportamiento social mediante la emisión de descarga órgano eléctrico (EOD). A continuación, describimos tres técnicas eficaces para medir de forma sincrónica los Tedax, la posición del cuerpo y la postura de un WEF nadan libremente durante un período prolongado de tiempo. En primer lugar, se describe la construcción de un tanque experimental en el interior de una cámara de aislamiento diseñado para bloquear las fuentes externas de estímulos sensoriales como la luz, el sonido y la vibración. El acuario se dividió para dar cabida a cuatro especímenes de ensayo, y barreras automáticas controlar remotamente el acceso de los animales a la arena central. En segundo lugar, se describe un método preciso y fiable en tiempo real de medición de tiempo del EOD de nadar libremente WEF. Distorsiones de la señal causadas por los movimientos del cuerpo del animal se corrigen por promediado espacial y etapas de procesamiento temporal. En tercer lugar, se describe una configuración de imagen en el infrarrojo cercano bajo el agua para observar comportamientos de los animales nocturnos no perturbadas. Pulsos de luz de infrarrojos se utilizan para sincronizar la temporización entre el vídeo y la señal fisiológica a través de una duración de la grabación de largo. Nuestro software de seguimiento automatizado mide la posición del cuerpo del animal y la postura de forma fiable en una escena acuática. En combinación, estas técnicas permiten la observación a largo plazo de la conducta espontánea de nadar libremente peces débilmente eléctrica de una manera fiable y precisa. Creemos que nuestro método se puede aplicar de manera similar al estudio de otros animales acuáticos, relacionando sus señales fisiológicas con comportamientos exploratorios o sociales.

Introducción

Antecedentes. Experimentos cuantitativos sobre el comportamiento animal (por ejemplo, elección forzada, evitación de shock, laberinto en T, etc.) Se utilizan normalmente para investigar las hipótesis específicas relativas a las habilidades sensoriales y motoras, el aprendizaje y la formación de la memoria. Sin embargo, estos experimentos restrictivas se pierda gran parte de la riqueza del comportamiento natural de los animales, y es probable que resulte en modelos simplistas de la base neural subyacente de comportamiento. Los experimentos en condiciones más naturales son, por tanto, un complemento importante por el cual podemos explorar más a fondo el repertorio conductual especies. Los experimentos con animales se mueven libremente deben, sin embargo, frente a los desafíos técnicos únicos, tales como artefactos de grabación inducidas por movimiento. A diferencia de las respuestas de estímulo evocado, que se producen de manera espontánea el comportamiento exploratorio no se pueden predecir, por lo que los sujetos experimentales tienen que ser controlados y seguidos durante un período prolongado de tiempo constante. Las preguntas específicas de investigación can ser mejor abordados por organismos cuidadosamente seleccionados y las herramientas técnicas disponibles. Por ejemplo, las técnicas de registro y estimulación ópticos tales como sensores de calcio genéticamente codificados en ¹ y ² optogenética se han aplicado con éxito para moverse libremente organismos modelos genéticos ^3-5. Por otra parte, los sistemas de telemetría neuronales miniaturizados pueden grabar y estimular que se mueve libremente animales pequeños ^6,7.

Peces Electric. Especies WEF generan descargas eléctricas de órganos (EODs), que les permiten percibir su entorno inmediato o para comunicarse a grandes distancias. Los patrones temporales de EODs varían bajo diferentes condiciones tales como auto-movimientos ^8,9, estímulos sensoriales ^{10,11, 12,13} y las interacciones sociales. Especies WEF de tipo Pulso producen un tren de pulsos discretos, en lugar de especies de tipo de onda a la que generan formas de onda cuasi sinusoidal continua. En general, de tipo pulso exhiben especies more Tasa EOD variables en comparación con las especies de tipo de onda, y las tasas de eliminación de artefactos explosivos de los animales refleja de cerca el contenido de la novedad de su entorno sensorial ^10,14. Especies de tipo de pulso pueden reducir de inmediato el intervalo entre pulsos (IPI) en un solo ciclo de pulso en responder a una perturbación sensorial novela (respuesta novedad ^10,11,14). El comportamiento eléctrico continuo de estos peces puede ser perturbado por los estímulos sensoriales no controladas procedentes de fuentes externas, y diferentes tipos de estímulos tales como la vibración, el sonido, la electricidad y la luz son conocidas las respuestas de la novedad de activación. Por lo tanto, se deben tomar precauciones especiales para impedir o atenuar los estímulos sensoriales externos durante una observación a largo plazo de nado libre WEF. De esta manera, los cambios en la tasa de EOD y trayectorias de movimiento pueden ser atribuidos específicamente a los estímulos presentados por el experimentador.

Tanque de acuario y cámara de aislamiento. Por lo tanto, colocamos varias capas de materiales de absorción de vibraciones under un tanque del acuario grande (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m), y rodearon el tanque con un recinto aislado para bloquear las fuentes externas de luz, ruido eléctrico, el sonido y el flujo de calor. Tasa de EOD depende de la temperatura que rodea ^15,16, por lo tanto la temperatura del agua fue estrechamente regulada en un intervalo de tropical (25 ± 1 ° C) para las especies de Sur América WEF. Construimos un (10 cm de profundidad de agua) tanque grande y poco profunda para observar conductas exploratorias espaciales del WEF restringidas principalmente en dos dimensiones (Figura 1A). El tanque se repartió en una pista central para observar comportamientos espaciales, y cuatro compartimentos de esquina para albergar por separado cada pez (Figura 1B). Cada compartimiento estanco fue construida para impedir la comunicación eléctrica entre los individuos. Acceso Animals 'a la arena central estaba controlada desde el exterior por cuatro compuertas motorizadas. Las puertas se colocaron entre los compartimentos, y se convirtieron hermético cuando está bloqueadopor nylon alas nueces. No hay partes metálicas se utilizaron bajo el agua desde WEF reaccionan sensiblemente a los metales.

Grabación EOD. EODs se generan de una manera estereotipada por la activación de un solo (en Mormyrids) o múltiples órganos eléctricos distribuidos espacialmente (en Gymnotiforms) ^17,18. Modulaciones temporales en la tasa del EOD pueden revelar las actividades neuronales de nivel superior, ya que el marcapasos medular recibe entradas neuronales directos de las regiones superiores del cerebro, tales como el núcleo prepacemaker diencefálico, que a su vez recibe las proyecciones axonales de la cerebro anterior ^19. Sin embargo, el momento del EOD debe ser cuidadosamente extraída de una grabación de forma de onda en bruto y no sesgada por las distorsiones inducidas por movimiento del animal. El campo eléctrico generado por una FEM se puede aproximar como un dipolo, por lo EOD amplitudes de pulso en electrodos de registro dependen de las distancias y orientaciones relativas entre el animal y los electrodos de ^8,20. Auto-movem del Animalpadres cambian la geometría relativa entre el animal y los electrodos, por lo tanto los movimientos causan las amplitudes EOD en diferentes electrodos para varían con el tiempo de una manera volátil (véase la Figura 2B en Junio ​​et al. ^8). Por otra parte, auto-movimientos también cambian la forma de onda EOD grabadas, porque las contribuciones relativas de diferentes conjunto de los órganos eléctricos dependen de sus ubicaciones a lo largo de la longitud del cuerpo y sus curvaturas locales introducida por la flexión de la cola. Las distorsiones inducidas por movimiento en las amplitudes y formas EOD pueden conducir a mediciones de tiempo EOD imprecisas y no fiables. Hemos superado estos problemas espacialmente promediando múltiples formas de onda de desactivación de artefactos explosivos registrados en distintos lugares, y añadiendo un filtro de extracción de sobres para determinar con precisión el momento del EOD de una FEM de nado libre. Además, nuestra técnica también mide las amplitudes de desactivación de artefactos explosivos, que indican si un animal está en reposo o moviéndose activamente basándose en el cambio de la EODamplitudes en el tiempo (véanse las figuras 2E y 2F). Se registraron señales diferencialmente amplificados a partir de los pares de electrodos de grabación para reducir el ruido de modo común. Dado que los pulsos de desactivación de artefactos explosivos se generan a intervalos de tiempo irregulares, el evento de series de tiempo EOD tiene una frecuencia de muestreo variable. El tiempo-serie del EOD se puede convertir a una velocidad de muestreo constante por interpolación si es requerido por una herramienta analítica de elección.

La grabación de vídeo. Aunque la grabación EOD puede supervisar una actividad de movimiento bruto de un animal, la grabación de vídeo permite la medición directa de la posición del cuerpo de un animal y la postura. Infrarrojo cercano (NIR) Iluminación (λ = 800 ~ 900 nm) permite imperturbable observación visual de nadar libremente peces ^21,22, ya WEFs son más activos en la oscuridad y sus ojos no son sensibles al espectro NIR ^23,24. La mayoría de los sensores de imagen digital (por ejemplo, CMOS o CCD) pueden capturar el espectro NIR con la wavelength rango entre 800-900 nm, después de la eliminación de un puerto de infrarrojos (IR) de filtro de bloqueo ^25. Ciertas webcams de nivel de consumidor de gama alta ofrecen alta definición, ángulo de visión amplio y una buena sensibilidad con poca luz, lo que puede producir una calidad de imagen comparable a, o superior a cámaras de infrarrojos de calidad profesional disponible a costos mucho mayores. Además, ciertos webcams de nivel de consumidor se incluyen con el software de grabación que permite un tiempo de grabación prolongado al comprimir vídeo sin pérdida de calidad. La mayoría de cámaras de nivel profesional ofrecen sincronización TTL salidas de impulsos de tiempo o entradas de pulsos TTL de disparo ²⁶ para alinear la sincronización entre el vídeo con las señales digitalizadas, pero esta característica es generalmente ausente en webcams de nivel de consumidor. Sin embargo, la temporización entre una grabación de vídeo y un digitalizador de señal se puede emparejar con precisión mediante la captura simultáneamente un IR LED parpadea periódicamente con la cámara y el digitalizador de señal. El momento inicial y la final del pulso IR se puede utilizar unas de dos marcadores de calibración de tiempo para convertir los números de fotogramas de vídeo a la unidad de tiempo digitalizador de señal y viceversa.

Iluminación y fondo. Imagen capturar a través del agua puede ser un desafío técnico debido a reflejos de luz en la superficie del agua. La superficie del agua puede actuar como un espejo para reflejar una escena visual por encima del agua, y las características visuales oscuros bajo el agua, por lo que la escena fuera del agua debe dictarse sin rasgos para evitar la interferencia visual. Con el fin de imagen todo el acuario, una cámara tiene que ser colocado directamente sobre el agua, y que debe estar oculto detrás del techo sobre un orificio de visualización pequeño para evitar su reflexión sobre la superficie del agua. Por otra parte, la superficie del agua puede producir miradas y la iluminación no uniforme si las fuentes de luz se proyectan de forma incorrecta. La iluminación indirecta puede lograr una iluminación uniforme sobre toda el acuario por objetivo las fuentes de luz hacia el techo, de tal manera que el techo y el Wal rodeals pueden reflejar y difundir los rayos de luz antes de llegar a la superficie del agua. Elija un iluminador de infrarrojos que coincide con una respuesta espectral de la cámara (por ejemplo, 850 nm de longitud de onda de pico). Ruido eléctrico de las fuentes de luz puede ser minimizado mediante el uso de luces LED y la colocación de sus fuentes de alimentación de corriente continua fuera de la jaula de Faraday. Coloque un fondo blanco debajo del tanque, ya que los peces contrasta bien en un fondo blanco en longitudes de onda NIR. Del mismo modo, el uso del color blanco mate en las superficies interiores de la cámara de aislamiento proporciona uniforme y brillante iluminación de fondo.

Seguimiento de vídeo. Después de una grabación de vídeo, un algoritmo de seguimiento automatizado de imágenes puede medir posiciones y posturas del cuerpo del animal con el tiempo. El seguimiento de vídeo se puede realizar de forma automática, ya sea software listo para usar (Viewpoint o Ethovision), o software programable por el usuario (OpenCV o MATLAB caja de herramientas de procesamiento de imagen). Como el primer paso de seguimiento de imagen,un área de seguimiento válido tiene que ser definido por dibujar una forma geométrica para excluir la zona exterior (enmascarar la operación). A continuación, la imagen de un animal tiene que ser aislado del fondo restando una imagen de fondo de una imagen que contiene el animal. La imagen de la resta se convierte a un formato binario mediante la aplicación de un umbral de intensidad, de manera que el centroide y el eje de orientación se pueden calcular a partir de las operaciones morfológicas binarias. En Gymnotiforms ^27-29 y ^30-32 Mormyrids, la densidad electroreceptor es la más alta cerca de la región de la cabeza, por lo que la posición de la cabeza en cualquier momento indica una ubicación de la más alta agudeza sensorial. Los lugares de la cabeza y de la cola se pueden determinar de forma automática mediante la aplicación de las operaciones de rotación de imagen y de cuadro de límite. Los extremos de cabeza y cola se pueden distinguir uno del otro definiendo manualmente en el primer fotograma, y ​​por hacer el seguimiento de sus ubicaciones de la comparación de dos tramas sucesivas.

Protocolo

Este procedimiento cumple con los requisitos de la Universidad de Comité de Cuidado de Animales de Ottawa. Ningún conflicto de interés se declara. Por favor, consulte la Tabla de Materiales y Reactivos para las marcas y modelos de los equipos y materiales que figuran a continuación. Escritos Custom Spike2 y MATLAB scripts y datos de ejemplo se proporcionan en el archivo suplementario.

1. El tanque del acuario y de la Cámara de aislamiento Configuración

1. Anti-v piso ibration. Construir una superficie anti-vibración (2,1 mx 2,1 m) apilando los cojines de goma espuma de poliestireno, acústico, el panel de madera contrachapada marina, y los cojines de espuma de poliuretano de la parte inferior a la parte superior (Figura 1A). Coloque cuatro postes de madera (5 cm x 10 cm) en el panel de madera contrachapada para apoyar a los bordes del tanque del acuario.
2. Calentador de piso. Coloque un elemento de calentamiento eléctrico blindado sobre un relleno de espuma térmicamente clasificado (ver figura inferior 1D). Cubrir el elemento de calentamiento con un metallic malla de blindaje eléctrico.
3. Tanque espacial. Construir un tanque del acuario de ancho y poco profundo (1,8 mx 1,8 mx 30 cm), utilizando 1,3 cm paneles de vidrio, marco de aluminio en forma de L y silicona acuario grado (véase la Figura 1A) de espesor templado. Cubrir la parte inferior del tanque con una gran hoja de fondo blanco para proporcionar un alto contraste de formación de imágenes (véase el Protocolo 3).
4. Divida el tanque del acuario en una arena central (1,5 m de diámetro) y cuatro compartimentos de esquina (véase la Figura 1B) por paredes instalando (22,5 cm de altura) hechas de hojas de acrílico (mate blanco, 0,64 cm de grosor).
   1. Curva cuatro hojas de acrílico (22,5 cm x 102,7 cm), mediante la aplicación de calor para crear cuatro secciones de pared curvadas, y las incluirá en el fondo del tanque utilizando masilla de silicona para separar la arena central de los cuatro compartimentos de esquina. Deje 20 cm de espacio entre las secciones curvas para la instalación de la puerta.
   2. Separe compartimentos de esquina vecina mediante la instalación de cuatro paredes dobles with 15 cm lagunas, que proporcionan aislamiento eléctrico adicional y lugares para sensores submarinos como un hidrófono.
5. Montar cuatro puertas motorizadas, y los instala entre los compartimentos de esquina y el escenario central.
   1. Montar cuatro marcos de puertas como se muestra en la Figura 1C. Crear seis pozos (0,64 cm de profundidad) en cada marco de puerta, insertar tuercas ciegas nylon (hilo de diámetro 0,64 cm) y fijarlos con epoxi.
   2. Cortar cuatro paneles de las puertas de acrílico y láminas de caucho, y crear seis agujeros (0,64 cm de diámetro) en el acrílico y paneles de goma para el mecanismo de bloqueo. Únete al acrílico y paneles de goma utilizando masilla de silicona.
   3. Instale bisagras de acrílico para unir los paneles de las puertas con los marcos de las puertas.
   4. Monte balanceando los brazos en servomotores, e instalarlas en la parte superior de los marcos de las puertas (ver Figura 1 C). Hacer bucles con bridas para unir los brazos oscilantes de los paneles de las puertas.
   5. Coloque los conjuntos de puerta en la gaps creado entre las secciones de pared curvados, y asegurarlos mediante masilla de silicona.
   6. Conecte todos los servomotores a un controlador servo, y conectarlo a una fuente de alimentación y un ordenador mediante un cable de extensión USB activo. Pruebe las puertas utilizando el software de control suministrado con el controlador del servo.
   7. Después de que la silicona se endurece, compruebe la estanqueidad al bloquear todas las puertas con tornillos de nylon y relleno de un compartimiento a la vez.
6. Cámara de aislamiento. Construir una cámara de aislamiento para rodear el acuario y bloquear las fuentes externas de luz, sonido y ruido eléctrico (vea la Figura 1D).
   1. Haga tres paneles de pared (2 mx 2 mx 5 cm) y cuatro paneles de las puertas (1,9 mx 0,95 mx 5 cm). Para cada grupo, se unen las molduras de aluminio (5 cm x 2,5 cm) para crear un marco rectangular, y remachar un panel blanco de plástico corrugado en el marco de aluminio. Rellene guatas de fibra de vidrio acústico de los paneles, y cerca de un panel de plástico corrugado negro.
   2. Instale tres paneles de pared en el piso anti-vibración, e instalar bisagras de piano para unirse a los cuatro paneles de las puertas en los paneles de las paredes.
   3. Rodean la cámara de aislamiento con mallas de aluminio, y la tierra de mallas en todos los lados para crear una jaula de Faraday.
7. Control de humedad. Instale un extractor de aire de bajo ruido (Figura 1F superior) para eliminar el exceso de humedad acumulación de calor. Coloque el extractor de aire de al menos 2 m de distancia del lugar de grabación, e instalar un conducto de aire entre la cámara de aislamiento y el extractor de aire.
8. Rutinariamente supervisar y mantener las condiciones de agua del tanque y animales.
   1. Mantener las condiciones de agua constante a 10 cm de profundidad, 100 S / cm de conductividad y pH 7,0 mediante la adición de agua o solución salina de valores (consulte Knudsen ³³ para la receta). Añadir una bolsa de coral triturado si el pH cae por debajo de 6,5.
   2. Instale filtros del acuario verticales que pueden operar desde aguas poco profundas para la limpieza yfines de aireación (Figura 1F) de fondo. Desconecte los filtros y los llevan fuera de la arena central durante las sesiones de grabación.
   3. Entregar gusanos viven en el fondo del tanque uniéndolos en ventosas con elásticos. Evite presas flotantes como blackworms para evitar la alimentación controlada de presas perdidas durante la grabación.

2. Seguimiento del EOD

1. Instalación de electrodos. Ensamble ocho electrodos de grafito, y el espacio por igual en la pared curva de la pista central.
   1. Obtener la elaboración de ofertas (15 cm de longitud; Marte Carbon 2 mm Tipo de HB) y afeitarse el revestimiento externo de los cables.
   2. Cortar ocho segmentos de 10 cm de cable coaxial (RG-174), envolver el núcleo del cable alrededor de un extremo de las barras de grafito, y aplicar calor tubo retráctil sobre ellos para la conexión eléctrica fuerte y estable. Conecte los conectores jack BNC en los extremos opuestos (Figura 2A izquierda).
   3. Coloque los electrodos en la pared con cinta adhesiva, y se aplican tiras delgadas de cinta adhesiva en las superficies de los electrodos para protegerlo de la silicona. Aplique sellador de silicona para mantener de forma permanente los electrodos, y quitar toda la cinta antes de que se endurezca silicona (Figura 2A derecha).
2. Construir ocho conjuntos de cables mediante la medición de la distancia desde cada electrodo a la unidad de amplificador, y corte de cables coaxiales (RG-54) en longitudes. Adjuntar conectores BNC en ambos extremos de los cables.
3. Utilice los montajes de cable para conectar todos los electrodos a la unidad de amplificador. Amplificar diferencialmente por el emparejamiento de dos 90 ° electrodos orientados (vea la Figura 2B), y la tierra todos los cables coaxiales de blindaje mediante la conexión a la jaula de Faraday.
4. Establecer la ganancia del amplificador por debajo del límite de saturación de la señal, y aplicar un filtro de paso de banda (200 Hz-5 kHz) para eliminar el ruido. Digitalizar los cuatro pares de electrodos de grabación a 40 kS / s.
5. Onlineprocesamiento de la señal. Las instrucciones están escritas para el software Spike2, y los ajustes de los parámetros están optimizados para Gymnotus sp. (Ver Figura 2 C para el resumen).
   1. Añadir un DC quitar proceso (τ = 0,1 segundos) para todos los canales de grabación.
   2. Añade un proceso de rectificar a todos los canales de grabaciones.
   3. Crear un canal virtual mediante la suma de los cuatro canales de grabación.
   4. Extrae un sobre unimodal por pulso EOD añadiendo un RMS (root-mean-cuadrado, ) Proceso (τ = 0,25 mseg) para el canal virtual, para generar un solo pico por ciclo del EOD para determinar sin ambigüedad la temporización de los impulsos.
   5. Crear un canal RealMark desde el canal virtual y registrar el tiempo y los valores de las amplitudes de pico, después de fijar un umbral adecuado para capturar todo del EOD pulsos wisn perder el pulso, mientras evita falsos positivos.
   6. Monitorear la tasa EOD instantánea en tiempo real mediante el establecimiento de la opción de visualización de canal del canal RealMark a un modo de frecuencia instantánea.
   7. Monitorear el movimiento de los peces en tiempo real mediante la duplicación de la canal RealMark y establezca la opción de pantalla a un modo de forma de onda.
   8. Cuantificar el nivel de actividad de la RMS de la pendiente de amplitud EOD mediante la creación de un canal virtual desde el canal RealMark (periodo de muestreo 0,01 seg), y añadir la pendiente (τ = 0,25 ms) y RMS (τ = 0,5 ms) procesos.
   9. Exportar el canal RealMark en el software de Spike2 al formato MATLAB.

3. Seguimiento de vídeo sincronizada

1. Crear un fondo de escena.
   1. Ocultar cualquier objeto que arroja un reflejo en la superficie del agua, cubriendo con película mate encimera blanco.
   2. Instale un blanco matePanel de plástico corrugado de 15 cm por debajo del techo para ocultar la cámara y la salida de aire.
   3. Imprimir patrones de cuadrícula en una hoja grande de papel blanco para la calibración de una cámara y ponerla debajo del tanque para proporcionar un fondo de alto contraste.
2. Instale las fuentes de luz.
   1. Obtener luces del IR LED y, quite ventiladores incorporados para reducir el ruido. Conducir el LED con una fuente de alimentación de corriente regulada DC colocado fuera de la jaula de Faraday.
   2. Instale luces del IR para la imagen en la oscuridad, y las luces blancas del LED para la conducción de un ciclo de luz diurna en los peces del ensayo LED. Directos todas las fuentes de luz hacia el techo para lograr la iluminación indirecta y uniforme (Figura 3A).
   3. Regular el ciclo de luz diurna mediante el accionamiento del blanco LED luces con un interruptor de control de tiempo (por ejemplo, 12 horas on/12 hr off).
3. Instale una cámara directamente encima del acuario.
   1. Obtenga una cámara NIR y minúsculas, o quitar un bloqueo filte IRR rompiendo una fina lámina de vidrio teñido en la parte posterior del conjunto de lentes. Asegúrese de que el ángulo de visión es lo suficientemente amplia como para la imagen de todo el escenario central.
   2. Haz un pequeño agujero de visión en el centro del panel de techo, y coloque la cámara directamente encima del agujero.
   3. Instale un guardia anillo blanco alrededor de la lente, si las fuentes de luz generan resplandores.
4. Realice una grabación de vídeo sincronizado.
   1. Deposite un LED IR en una de las cuatro esquinas del tanque para generar pulsos de sincronización de tiempo (1 ms de duración, período de 10 segundos). Añadir un resistor limitador de carga (1 kW) en serie, y conducir el LED IR de un puerto de salida digital del hardware digitalizador.
   2. Use el software de grabación de video incluido con la cámara, si está disponible. Seleccione la calidad de grabación más alta (por ejemplo, la compresión sin pérdida) y los más altos resoluciones soportadas.
   3. Inicie la grabación de vídeo inmediatamente antes de iniciar la grabación del EOD, y detener la grabación de vídeo inmemente después de la grabación del EOD.
   4. Después de la grabación, convertir los números de cuadro de imagen a la unidad de tiempo digitalizador por interpolación lineal entre el primero y los últimos impulsos de luz capturados por el digitalizador de señal y la grabación de vídeo.
5. Seguimiento automatizado de imágenes
   Las instrucciones están escritas para la caja de herramientas de procesamiento de imágenes MATLAB, y hacer uso de sus funciones. Una secuencia de comandos de MATLAB encargo se ofrece con esta presentación para el seguimiento automatizado de imágenes.
   1. Importar vídeo. Importar un archivo de grabación de vídeo directamente en el espacio de trabajo de MATLAB usando "Videoreader. Leer" la función.
   2. Crear una imagen de fondo compuesto por la combinación de dos cuadros de imagen. Reemplazar la región de imagen ocupada por un animal con una imagen no ocupada de la misma región de otro marco (véase la Figura 3B).
   3. Especifique un área de imagen para realizar un seguimiento mediante la elaboración de una máscara circular alrededor de la pista central para excluir la unarea exterior (Figura 3B inferior), y multiplicar por una constante (r _int) para establecer un umbral mínimo para la diferencia de intensidad. Por ejemplo, establecer rint = 0.85 suprimirá las fluctuaciones de intensidad de 15% = (1 - r _int) por debajo del fondo.
   4. Sustracción de imagen. Restar un cuadro de imagen (= IM _k) de la imagen de fondo (= IM ₀₎ para obtener la imagen de diferencia (= ΔIM _k). Utilice entero sin signo de precisión numérica para almacenar los valores de intensidad de imagen como enteros no negativos.
   5. Segmento de la imagen de diferencia mediante la aplicación de un umbral de intensidad determinada a partir de la función de graythresh. Limpie la imagen binaria utilizando la función bwmorph y seleccione la mancha más grande que corresponde a un animal después de calcular todas las áreas de blob utilizando la función regionprops.
   6. Determinar el centroide y un importante orientaciónxis de la mancha más grande mediante la aplicación de la función regionprops, y rotar la imagen para alinear el eje mayor con el eje x. Divida la imagen para las partes de la cabeza y de la cola en el centroide (parte superior Figura 3D).
   7. Determinar el eje mayor de la parte de cabeza, y girar toda la imagen para alinear con el eje x (Figura 3D parte inferior izquierda). Montar delimitadores cajas alrededor de la cabeza y las partes traseras paralelas a sus ejes principales el uso de la función regionprops.
   8. Determinar la mediana de coordenadas y de la burbuja en la izquierda, el centro y los bordes verticales de la derecha de los cuadros delimitadores (puntos verdes en la parte inferior figura 3D), y asignarlos a cinco puntos de la entidad (la cabeza de punta, a mitad de la cabeza, a medio cuerpo , a mediados de la cola, punta de la cola).
   9. Procesar imágenes sucesivas después de recortar un cuadro de imagen centrada en baricentro del animal determina a partir de su marco anterior.
   10. Asigne manualmente la orientación de la cabeza para el primer fotograma, y ​​utilizar un betwe punto-productoen los vectores de orientación de dos fotogramas sucesivos para determinar automáticamente la orientación de la cabeza. Inspeccione el resultado, y dar la vuelta manualmente la orientación de la cabeza si se ha asignado incorrectamente.
6. Trazar una trayectoria animales al unirse a la cabeza-tips y suavizar utilizando la mediana y los filtros de promedio (n = 3) si tiene una apariencia nerviosa. Superponer la trayectoria una imagen de fondo, e interpolar las líneas medias de peces usando los cinco puntos de la entidad (véase la Figura 2E).
7. Calcular la tasa de EOD promedio en cada imagen el tiempo de captura por remuestreo la tasa EOD instantáneo (frecuencia de muestreo de 100 Hz) y un promedio de (ventana de tiempo 0.0625 segundos). Trazar la trayectoria en pseudo-colores determinados a partir de la tasa de EOD vez emparejados, y superponer una imagen de fondo (ver Figura 2F) con.

Resultados

Seguimiento de los resultados del EOD

Las formas de onda EOD grabadas de diferentes pares de electrodos varían en amplitud y las formas como se esperaba de sus posiciones únicas y orientaciones (Figura 2C arriba). El uso de múltiples pares de electrodos garantiza fuerte recepción de la señal en todas las posiciones posibles y las orientaciones de FEM dentro del tanque. La forma de onda envolvente (Figura 2C parte inferior, verde rastro) siempre contenía u...

Discusión

Importancia de nuestras técnicas. En resumen, se describió por primera vez la construcción de un gran tanque de acuario y una cámara de aislamiento para observar comportamientos exploratorios espontáneas producidas por WEF. A continuación, se demostró la técnica de registrar y hacer un seguimiento de la tasa de EOD y los estados de movimiento de los peces sin restricciones en tiempo real, utilizando múltiples pares de electrodos. Finalmente, describimos la técnica de infrarrojos de grabación de víde...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
			[Aquarium construction]
Electrically shielded floor heater	ThermoSoft Corp., IL, USA	ThermoTile	www.thermosoft.com
Tempered glass panel	generic		.5 inch thick, used for the aquarium construction
Aquarium grade silicone	generic
Acrylic sheet	generic		.25 inch thick, matt white
Natural rubber sheet	generic		.25 inch thick
Servomotor	HITECHRCD Inc., Korea	HS-325HB, 180deg rotation	www.servocity.com
Servomotor arm mount	HITECHRCD Inc., Korea	56362 Large Spline	www.servocity.com
Servomotor controller (6 chan.)	sparkfun.com	ROB-09664	Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller
Active USB extension cable	C2G	38990	12m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable
Exhaust fan	Nutone	ILFK120	www.homedepot.com
Vertical aquarium filter	Tetra, Germany	Whisper Internal Power Filter - 40i
Crushed coral			Used to increase the pH of the tank water
			[EOD recording setup]
Graphite Electrodes	Staedtler, Germany	Mars Carbon 2-mm type HB	Shave the outer coating
Physiological Amplifier/Filter	Intronix, Canada	2015F
Coaxial Cable	generic	RG174	For electrodes assembly
Coaxial Cable	generic	RG54	For wiring use
BNC jack connector for RG-174	Amphenol Connex	112160	For electrodes assembly
BNC plug connector for RG-54	Amphenol Connex	112116	For wiring use
Signal digitizer hardware	Cambridge Electronic Design, UK	Power MKII 1401
Signal digitizer software	Cambridge Electronic Design, UK	Spike 2. ver 7
			[Visual tracking setup]
White LED light	IKEA, Sweden	DIODER 201.194.18	www.ikea.com
Infrared LED light (850 nm)	Scene Electronics, China	S8100-60-B/C-IR	Remove built-in fan
USB webcam	Logitech Inc., CA, USA	C910	Remove Infrared blocking filter
Motorized camera	Logitech Inc., CA, USA	Quickcam Orbit	Remove Infrared blocking filter
Video recording software	Logitech Inc., CA, USA	Logitech Quickcam Software	Download from www.logitech.com
Matlab	Mathworks, MA, USA	2012a	Image processing toolbox