Langfristige Verhaltens Verfolgung von Frei Schwimmen Schwach elektrische Fische

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Reihe von Techniken für die Untersuchung spontane Verhalten frei schwimmend schwach-elektrischen Fischen über einen längeren Zeitraum durch synchrones Messen der elektrischen Organ Ausstoßzeitpunkt des Tieres, Körper Position und Stellung sowohl genau und zuverlässig in einem speziell konstruierten Aquariumbehälter in einem sensorischen Isolationskammer.

Zusammenfassung

Langfristige Verhaltens Tracking kann erfassen und zu quantifizieren, natürlichen tierischen Verhaltensweisen, auch die selten auftreten. Verhaltensweisen wie Exploration und sozialen Interaktionen können am besten durch die Beobachtung hemmungslos, frei lebenden Tier untersucht werden. Schwach elektrische Fische (WEF) Display leicht beobachtbar Sondierungs-und Sozialverhalten durch Aussenden elektrische Orgel Entladung (EOD). Hier beschreiben wir drei effektiven Techniken synchron messen die EOD, Körperposition und Haltung eines frei schwimm WEF für einen längeren Zeitraum. Zunächst beschreiben wir den Bau eines Versuchs Tank in einer Isolationskammer entwickelt, um externe Quellen von Sinnesreizen wie Licht, Sound und Vibration zu blockieren. Das Aquarium wurde aufgeteilt auf vier Proben aufnehmen und automatisierte Tore Fernzugriff der Tiere an die zentrale Arena steuern. Zweitens beschreiben wir eine präzise und zuverlässige Echtzeit-EOD Zeitmessverfahren von frei schwimm WEF. Signalverzerrungen durch Körperbewegungen des Tieres verursacht werden durch räumliche und zeitliche Mittelung Verarbeitungsstufen korrigiert. Drittens, beschreiben wir eine Unterwasser Nah-Infrarot-Bildgebungs Setup, um ungestörten Nachttierverhalten zu beobachten. Infrarotlicht-Impulse wurden verwendet, um die Zeitsteuerung zwischen dem Videosignal und dem physiologischen über einen langen Aufzeichnungsdauer zu synchronisieren. Unsere automatisierten Tracking-Software misst Körperposition und Körperhaltung des Tieres zuverlässig in einem aquatischen Szene. In Kombination sind diese Techniken ermöglichen langfristige Beobachtung des spontanen Verhaltens in einer zuverlässigen und präzisen Art und Weise frei schwimmen schwach-elektrischen Fischen. Wir glauben, dass unsere Methode kann ähnlich wie bei der Studie von anderen Wassertieren, die im Zusammenhang mit ihrer physiologischen Signale Sondierungs oder sozialen Verhaltensweisen angewandt werden.

Einleitung

Hintergrund. Quantitative Versuche über das Verhalten von Tieren (z. B. Zwangs Wahl, Stoßvermeidung, T-Labyrinth, etc.) Werden in der Regel verwendet, um spezifische Hypothesen zu untersuchen über sensorisch-motorischen Fähigkeiten, Lernen und Gedächtnisbildung. , Vermissen jedoch diese restriktiven Experimente viel von dem Reichtum an natürlichen Verhalten der Tiere und werden wahrscheinlich in stark vereinfachte Modelle der zugrunde liegenden neuronalen Grundlagen von Verhalten führen. Experimente unter naturalistischen Bedingungen sind daher eine wichtige Ergänzung, durch die wir näher erkunden eine Art Verhaltensrepertoire. Experimente mit frei beweglichen Tieren müssen jedoch ansprechen einzigartige technische Herausforderungen wie bewegungsinduzierte Aufnahme Artefakte. Anders als Stimulus hervorgerufene Reaktionen, spontan auftretende Erkundungsverhalten nicht vorhergesagt werden, somit Versuchspersonen müssen ständig überwacht und über einen längeren Zeitraum verfolgt werden. Spezifische Forschungsfragen can am besten durch sorgfältig ausgewählte Organismen und verfügbaren technischen Tools angesprochen werden. Zum Beispiel sind optische Aufzeichnungs-und Stimulationstechniken wie genetisch codierten Calciumsensoren ¹ und ² Optogenetik wurde erfolgreich eingesetzt, um frei beweglichen genetischen Modellorganismen ^3-5. Alternativ können miniaturisierte neuronalen Telemetriesysteme erfassen und frei bewegen zu stimulieren kleine Tiere ^6,7.

Elektrische Fische. WEF-Arten erzeugen elektrische Orgel Entladungen (EOD), die sie an die unmittelbare Umgebung erfassen oder über größere Entfernungen kommunizieren. Zeitlichen Muster der EOD variieren unter verschiedenen Bedingungen wie Selbst Bewegungen ^8,9, Sinnesreize ^{10,11, 12,13} und soziale Interaktionen. Pulse-Typ-WEF Arten produzieren eine Folge von diskreten Impulsen, im Gegensatz zu Wave-Arten, die quasi-kontinuierliche Sinuswellenformen zu erzeugen. Im Allgemeinen impulsartige Spezies weisen morE EOD variable Rate im Vergleich zu den Wellentyp-Spezies und Tiere "EOD Raten Neuheit Inhalt ihrer sensorischen Umgebung ^10,14 eng reflektieren. Puls-Typ-Arten können die inter-Pulsintervall (IPI) in einer einzigen Impulszyklus verkürzen sofort reagieren in ein neues Sinnesstörung (Neuheit Antwort ^10,11,14). Die anhaltende elektrische Verhalten dieser Fische können durch unkontrollierte Sinnesreize von außen gestört werden, und verschiedene Arten von Reizen wie Vibration, Klang, Elektrizität und Licht sind bekannt Trigger Neuheit Antworten. Daher müssen besondere Vorkehrungen getroffen werden, um während einer Langzeitbeobachtung von frei schwimm WEF blockieren oder abschwächen externe Sinnesreize werden. Auf diese Weise können Änderungen in der EOD Rate und Bewegungsbahnen speziell auf Reize vom Experimentator dargestellt zurückzuführen.

Aquarium Tank-und Isolationskammer. Deshalb platziert mehrere Schichten von schwingungsdämpfenden Materialien under ein großes Aquarium (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m) und umgeben den Tank mit einem isolierten Gehäuse für externe Lichtquellen, elektrisches Rauschen, Ton-und Wärmefluss blockieren. EOD Rate ist abhängig von der Umgebungstemperatur ^15,16, also die Wassertemperatur wurde dicht an einem tropischen Bereich (25 ± 1 ° C) für die südamerikanischen Arten WEF geregelt. Wir konstruierten einen großen und flachen (10 cm Wassertiefe) Tank zu Sondierungs räumliche Verhalten der WEF vor allem in zwei Dimensionen (Abbildung 1A) eingeschränkt beobachten. Der Tank wurde in eine zentrale Arena räumliche Verhalten zu beobachten, und vier Ecken Fächer unterteilt ist, um einzelne Fische einzeln aufzunehmen (Fig. 1B). Jedes Abteil wurde wasserdicht gebaut, um eine elektrische Kommunikation zwischen Individuen zu verhindern. Zugang der Tiere zu der zentralen Bühne wurde von außen durch vier motorisierten Gates gesteuert. Die Tore wurden zwischen den Abteilen platziert, und sie wurde als wasserdicht verschlossenvon Nylon-Flügelmuttern. Keine Metallteile wurden verwendet, Unterwasser seit WEF reagieren empfindlich auf Metalle.

EOD Aufnahme. EOD in einer stereotypen Art und Weise durch die Aktivierung der einzelnen (in Mormyrids) oder mehrere räumlich verteilte elektrische Organe (in Gymnotiforms) ^17,18 erzeugt. Zeitliche Modulationen in der EOD Rate geordneten neuronalen Aktivitäten zu offenbaren, da die Markschrittmacher erhält direkten neuronalen Eingänge von höheren Hirnregionen wie dem Zwischenhirn prepacemaker Kern, die wiederum erhält axonalen Projektionen aus dem Vorderhirn ^19. Jedoch muss der EOD Zeit sorgfältig aus einem rohen Wellenaufnahme extrahiert werden und nicht durch die Bewegung induzierte Verzerrungen des Tieres vorgespannt ist. Das elektrische Feld durch eine WEF erzeugt als Dipol angenähert werden, so EOD Impulsamplituden an Aufzeichnungselektroden von den relativen Abstände und Orientierungen zwischen dem Tier und den Elektroden ^8,20. Tierselbst movemEltern verändern die relative Geometrie zwischen dem Tier und den Elektroden, wodurch Bewegungen bewirken, dass die EOD-Amplituden bei verschiedenen Elektroden mit der Zeit in einer flüchtigen Weise zu variieren (siehe Abbildung 2B im Juni et al. ^8). Außerdem Eigenbewegungen auch die Form der aufgezeichneten Wellenformen EOD ändern, denn relativen Beiträge von anderen Satz von der elektrischen Organe hängen von ihren Standorten entlang der Körperlänge und ihre lokalen Krümmungen durch Schwanzbiege eingeführt. Die Bewegungs-induzierten Verzerrungen in den EOD Amplituden und Formen können zu ungenauen und unzuverlässigen EOD Zeitmessungen führen. Wir überwanden diese Probleme durch die Mittelung mehrerer räumlich EOD Wellenformen an verschiedenen Orten aufgenommen und durch Zugabe einer Hülle Extraktionsfilter genau bestimmen die EOD Timing von einer frei schwimm WEF. Darüber hinaus misst unsere Technik auch EOD Amplituden, die anzeigen, ob ein Tier ruht oder aktiv bewegt, basierend auf der Änderung des EODAmplituden über die Zeit (siehe Abb. 2E und 2F). Wir nahmen differentiell verstärkten Signale von den Aufzeichnungselektrodenpaare auf Gleichtaktrauschen zu reduzieren. Da die EOD-Impulse werden in unregelmäßigen Zeitabständen erzeugt, das EOD Ereigniszeit-Serie haben eine variable Abtastrate. Der EOD Zeitreihen auf einen konstanten Abtastrate durch Interpolation, wenn durch eine analytische Werkzeug der Wahl erforderlich umgewandelt werden.

Video-Aufnahme. Obwohl EOD Aufnahme kann eine Brutto-Bewegungsaktivität eines Tieres zu überwachen, ermöglicht Videoaufzeichnung direkte Messungen der Körperposition und Haltung eines Tieres. Nah-Infrarot (NIR)-Beleuchtung (λ = 800 ~ 900 nm) erlaubt ungestörten visuelle Beobachtung von frei schwimmenden Fischen ^21,22, da WEFs sind am aktivsten in der Finsternis und ihre Augen sind nicht empfindlich auf NIR-Spektrum ^23,24. Die meisten digitalen Bildsensoren (zB CMOS-oder CCD) kann mit der NIR-Spektrum erfassen wavelength Bereich zwischen 800 bis 900 nm, nach dem Entfernen eines Infrarot-(IR)-Sperrfilter ^25. Einige High-End-Consumer-Webcams bieten High-Definition-, weite Betrachtungswinkel und eine gute Low-Light-Empfindlichkeit, die eine Bildqualität vergleichbar oder überlegen professionelle IR-Kameras an viel höhere Kosten produzieren kann. Darüber hinaus werden bestimmte Verbraucher-Grade-Webcams mit Recording-Software, die eine längere Aufnahmedauer ermöglicht durch Komprimieren Video ohne Qualitätsverlust gebündelt. Die meisten Profi-Kameras bieten die Zeitsynchronisation TTL Impulsausgänge oder TTL Triggerimpulseingänge ²⁶ für die Ausrichtung des Timing zwischen dem Video mit den digitalisierten Signale, aber diese Funktion ist in der Regel in Consumer-Webcams fehlt. Jedoch kann die Zeitsteuerung zwischen einer Videoaufzeichnung und einem Signal-Digitalisierer genau durch gleichzeitige Erfassung einer periodisch blinkenden IR-LED mit der Kamera und dem Digitalisierer Signal abgestimmt werden. Die Anfangs-und die endgültige IR Impulszeit kann verwendet werden, eines zwei Zeitkalibrierungsmarkierungen zur Umwandlung der Video-Frame-Nummern an die Signal Digitalisierer Zeiteinheit und umgekehrt.

Lighting & Hintergrund. Bildaufnahme durch Wasser kann technisch anspruchs aufgrund von Lichtreflexionen auf der Wasseroberfläche sein. Die Wasseroberfläche kann als Spiegel fungieren, um eine visuelle Szene über Wasser, und obskuren visuellen Merkmale Unterwasser reflektieren, und so muss die Szene über Wasser gesichts gemacht, um visuelle Störungen zu verhindern. Um das ganze Bild Aquarium, braucht eine Kamera direkt über dem Wasser platziert werden, und sollte sie hinter der Decke über einem kleinen Sichtloch versteckt, um seine Spiegelung auf der Wasseroberfläche zu verhindern. Darüber hinaus kann die Wasseroberfläche starrt und ungleichmäßige Beleuchtung zu produzieren, wenn Lichtquellen werden falsch projiziert. Indirekte Beleuchtung kann eine gleichmäßige Helligkeit über das gesamte Aquarium mit dem Ziel, die Lichtquellen in Richtung Decke zu erreichen, so dass die Decke und die umgebenden walls kann reflektieren und diffundieren die Lichtstrahlen vor dem Erreichen der Wasseroberfläche. Wählen Sie einen IR-Strahler, die eine spektrale Empfindlichkeit der Kamera (z. B. 850 nm Peak-Wellenlänge) entspricht. Elektrisches Rauschen von den Lichtquellen kann durch LED-Leuchten und Anordnen der DC-Stromversorgung außerhalb des Faradayschen Käfigs zu minimieren. Legen Sie einen weißen Hintergrund unter dem Tank, da Kontrast zu Fisch in einem weißen Hintergrund in der NIR-Wellenlängen. Ebenso stellt die Verwendung von matten weißen Farbe auf den Innenflächen der Isolationskammer gleichmäßige und helle Hintergrundbeleuchtung.

Video-Tracking. Nach einer Video-Aufnahme, kann eine automatische Bild Tracking-Algorithmus Körperpositionen und Körperhaltungen der Tiere über die Zeit zu messen. Das Video-Tracking kann automatisch von beiden ready-to-use-Software (Viewpoint oder Ethovision) oder vom Benutzer programmierbare Software (OpenCV oder MATLAB Die Image Processing Toolbox) durchgeführt werden. Als ersten Schritt der Bildverfolgung,ein gültiger Spurbereich muss, indem eine geometrische Form, um den Bereich außerhalb auszuschließen (Maskierungsoperation) definiert werden. Weiter muss Bild eines Tieres aus dem Hintergrund durch Subtrahieren eines Hintergrundbildes aus einem Bild, die das Tier isoliert werden. Das subtrahierte Bild wird in ein binäres Format durch Anlegen einer Intensitätsschwelle, so dass der Schwerpunkt und die Orientierungsachse von binären morphologischen Operationen berechnet werden, umgewandelt. In Gymnotiforms ^27-29 und ^30-32 Mormyrids, ist die Elektrorezeptordichte die höchste in der Nähe der Kopfbereich, somit die Kopfposition in jedem Moment gibt einen Ort der höchsten Sinnesschärfe. Die Kopf-und Schwanz Standorten können automatisch durch die Anwendung der Bilddrehung und Begrenzungs-Box-Operationen bestimmt werden. Die Kopf-und Schwanzenden könnten voneinander manuell in den ersten Rahmen, der ihnen, und durch die Verfolgung der Positionen von den Vergleich von zwei aufeinanderfolgenden Rahmen zu unterscheiden.

Protokoll

Dieses Verfahren entspricht den Anforderungen der Universität von Ottawa Animal Care Committee. Kein Interessenkonflikt erklärt. Bitte beachten Sie die Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Marken und Modelle der Geräte und unten aufgeführten Materialien. Benutzerdefinierte schriftliche Spike2 und MATLAB-Skripten und Beispieldaten werden in der Supplemental-Datei bereitgestellt.

1. Aquarium Tank und Isolation Chamber-Setup

1. Anti-v ibration Boden. Konstruieren Sie ein Anti-Vibrations-Oberfläche (2,1 mx 2,1 m) durch Stapeln von Gummi-Pads, akustische Styropor-, Meeres-Sperrholzplatte, und Polyurethan-Schaumstoff-Pads von unten nach oben (Abbildung 1A). Legen Sie vier Holzständer (5 cm x 10 cm) auf der Sperrholzplatte, um die Kanten des Aquarium zu unterstützen.
2. Bodenheizung. Legen Sie eine elektrisch abgeschirmte Heizelement über thermisch abgestuft Schaumstoffpolsterung (siehe Abbildung 1D unten). Decken Sie das Heizelement mit einem Metalllic Netz für elektrische Abschirmung.
3. Räumliche Tank. Konstruieren Sie eine breite und flache Aquarium (1,8 mx 1,8 mx 30 cm) mit 1,3 cm dicken Glasplatten, L-förmige Aluminiumrahmen und Aquarium-Silikon (siehe Abbildung 1A) gemildert. Decken Sie die Unterseite des Tanks mit einem großen Bogen weißem Hintergrund zu hohe Abbildungs ​​Kontrast zu schaffen (siehe Protokoll Nr. 3).
4. Teilen Sie das Aquarium in eine zentrale Arena (1,5 m Durchmesser) und vier Eck-Fächern (siehe Abbildung 1B) durch die Installation Wände (22,5 cm hoch) von Acrylplatten (matt weiß, 0,64 cm dick) hergestellt.
   1. Biegen vier Acrylplatten (22,5 cm x 102,7 cm) durch Anwendung von Wärme zu vier gebogenen Wandabschnitte zu erstellen, und befestigen Sie sie mit Silikon abdichten, um die zentrale Arena von den vier Eck-Fächer zu trennen, um den Tankboden. Lassen Sie 20 cm Abstand zwischen den Kurvenabschnitten für die Gate-Installation.
   2. Separate Nachbar Eckfächer durch die Installation von vier Doppelwände with 15 cm Lücken, die zusätzliche elektrische Isolierung und Orte für Unterwassersensoren wie ein Hydrophon bieten.
5. Montieren Sie vier motorisierte Tore, und installieren Sie sie zwischen den Fächern Ecke und der zentralen Arena.
   1. Zubauen vier Türrahmen, wie in Fig. 1C gezeigt. Neues sechs Bohrungen (0,64 cm tief) an jedem Türrahmen einzubetten Nylon Hutmuttern (0,64 cm Durchmesser Gewinde) und sichern Sie diese mit Epoxidharz.
   2. Cut vier Türverkleidungen aus Acryl-und Kautschukbahnen und Erstellen sechs Bohrungen (0,64 cm Durchmesser) auf Acryl-und Gummiplatten für die Verriegelung. Schließen Sie sich der Acryl-und Gummiplatten mit Silikon Abdichten.
   3. Installieren Acryl-Scharniere, die Türverkleidungen mit den Türrahmen anzuschließen.
   4. Berg Schwenkarme Servomotoren auf, und installieren Sie sie auf der Oberseite der Türrahmen (siehe Abbildung 1C). Machen Schleifen mit Kabelbindern um die Schwenkarme an den Türverkleidungen verbinden.
   5. Positionieren Sie die Gate-Baugruppen auf der gaps zwischen den gekrümmten Wandabschnitte erstellt, und befestigen Sie sie mit Silikon Abdichten.
   6. Verbinden Sie alle Servomotoren an eine Servosteuerung, und schließen Sie es an eine Stromquelle und einem Computer über eine aktive USB-Verlängerungskabel. Testen Sie die Tore mit dem Servo-Controller mitgelieferte Steuersoftware.
   7. Nachdem das Silikon aushärtet, überprüfen Sie die Dichtheit durch Sperren alle Tore mit Nylon-Schrauben und füllt ein Fach nach dem anderen.
6. Isolationskammer. Konstruieren Sie eine Isolationskammer, um das Aquarium umgeben und blockieren externen Quellen von Licht, Klang und elektrischen Störungen (siehe Abbildung 1D).
   1. Machen Sie drei Wandplatten (2 mx 2 mx 5 cm) und vier Türverkleidungen (1,9 mx 0,95 mx 5 cm). Für jedes Panel, kommen Aluminium-Formteile (5 cm x 2,5 cm), um einen rechteckigen Rahmen zu schaffen, und nieten eine weiße Kunststoff-Wellplatte auf der Aluminiumrahmen. Füllen akustische Fiberglas Batts in den Panels, und schließen mit einem schwarzen Kunststoffwellplatte.
   2. Legen Sie drei Wandplatten auf dem Anti-Vibrations-Stock, und installieren Stangenscharniere, die vier Türverkleidungen auf den Wandplatten anzuschließen.
   3. Umgeben die Isolationskammer mit Aluminium-Gitter und Boden greift auf allen Seiten einen Faradayschen Käfig zu schaffen.
7. Feuchteregelung. Installieren Sie eine geräuscharme Abluftventilator (1F oben), um überschüssige Feuchtigkeit Aufbau von Heizung entfernen. Setzen Sie den Abluftventilator mindestens 2 m entfernt von der Aufnahme-Website, und installieren Sie einen Luftkanal zwischen der Isolationskammer und der Abgasventilator.
8. Routinemäßig überwachen und die Bedingungen des Tankwassers und Tiere halten.
   1. Mit konstanter Wasserbedingungen bei 10 cm Tiefe, 100 uS / cm Leitfähigkeit und pH 7,0 durch Zugabe von Wasser oder Salz-Stammlösung (siehe Knudsen ³³ für das Rezept). In eine Tüte Korallenbruch, wenn der pH-Wert unter 6,5.
   2. Installieren vertikale Aquarienfilter, die aus flachen Wasser zur Reinigung bedienen und kannBelüftungszwecken (1F unten). Trennen Sie die Filter und nehmen Sie sie aus dem zentralen Arena während der Aufnahme-Sessions.
   3. Mehlwürmer liefern Live auf dem Boden des Behälters durch Anbringen sie auf Saugnäpfe mit Gummibändern. Vermeiden frei schwebenden Beute wie blackworms unkontrollierte Fütterung von streunenden Beute während der Aufnahme zu vermeiden.

2. EOD-Tracking

1. Elektroden-Installation. Zubauen acht Graphitelektroden und Raum sie gleichmäßig auf der gekrümmten Wand der zentralen Bereich.
   1. Erhalten Zeichnung Leitungen (15 cm in der Länge; Mars Carbon 2 mm Typ HB) und rasieren Sie die äußere Beschichtung der Leitungen.
   2. Schneiden Sie acht 10 cm Segmente Koaxialkabel (RG-174), wickeln Sie das Kabel Kern, um ein Ende der Graphitstäbe, und wenden Sie Schrumpfschlauch über sie für starke und stabile elektrische Verbindung. Bringen BNC-Buchse Anschlüsse auf den gegenüberliegenden Enden (2A links).
   3. Positionieren Sie die Elektroden auf der Wand durch Abkleben und gelten dünne Streifen Klebeband auf den Elektrodenoberflächen aus Silikon schützen. Bewerben Silikondichtmasse, die Elektroden dauerhaft zu halten, und entfernen Sie alle Band vor den Silikon härtet (2A rechts).
2. Aufbau acht Kabelanordnungen durch Messen des Abstands von jeder Elektrode zu der Verstärkereinheit, und Schneid Koaxialkabel (RG-54) in der Länge. Bringen BNC-Steckverbinder an beiden Enden der Kabel.
3. Verwenden Sie die Kabelbaugruppen, alle Elektroden an der Verstärkereinheit zu verdrahten. Verstärken differentiell durch Paarung zwei 90 ° ausgerichtet Elektroden (siehe Abbildung 2B), und Boden alle Koaxialabschirmhülse Drähte, indem sie mit dem Faradayschen Käfig.
4. Stellen Sie die Verstärkung des Verstärkers unter der Signalsättigungsgrenze, und Anwendung eines Bandpassfilters (200 Hz-5 kHz), um Rauschen zu entfernen. Digitalisieren Sie die vier Aufzeichnungselektrodenpaaren bei 40 kS / sec.
5. OnlineSignalverarbeitung. Die Hinweise sind für die Spike2 Software geschrieben und die Parametereinstellungen für Gymnotus sp optimiert. (Siehe Abbildung 2C für Zusammenfassung).
   1. Schreibe einen DC entfernen Prozess (τ = 0,1 s) auf alle Aufzeichnungskanäle.
   2. Fügen Sie einen Rectify Prozess für alle Aufnahmen Kanäle.
   3. Erstellen Sie einen virtuellen Kanal, der durch Addition aller vier Aufzeichnungskanäle.
   4. Extrahieren Sie eine unimodale Umschlag pro EOD Impuls, der durch das Hinzufügen von ein RMS (root-mean-squared, ) Verfahren (τ = 0,25 ms), um den virtuellen Kanal, zur Erzeugung eines einzelnen Peaks pro EOD Zyklus eindeutig bestimmen die Impulszeit.
   5. Erstellen Sie ein Realmark-Kanal von den virtuellen Kanal und notieren Sie die Zeit und die Werte der Spitzenamplituden, nach Setzung einer angemessenen Schwelle, alle EOD Impulse wi erfassenThout fehlt ein Impuls, und vermeidet Fehlalarme.
   6. Überwachung der momentanen EOD Rate in Echtzeit, indem Sie die Option des Realmark-Kanal Kanalanzeige einer momentanen Frequenzmodus.
   7. Überwachen Sie den Fisch Bewegung in Echtzeit durch Duplizieren der Realmark-Kanal, und stellen Sie die Anzeigeoption auf eine Wellenform-Modus.
   8. Quantifizieren Sie eine Aktivität aus den RMS des EOD Amplitudensteigung durch die Schaffung einer virtuellen Kanal aus der Realmark-Kanal (0,01 Sekunden Messzeit) und fügen Steigung (τ = 0,25 ms) und RMS (τ = 0,5 ms) Prozesse.
   9. Exportieren Sie die Realmark-Kanal im Spike2 Software auf die MATLAB-Format.

3. Synchronisierte Video-Tracking

1. Erstellen Sie eine Hintergrundszene.
   1. Ausblenden jedes Objekt, das eine Reflexion auf der Wasseroberfläche durch Abdecken mit Folie matt weiß Arbeitsplatte wirft.
   2. Installieren Sie eine matte whiteWellkunststoffplatte 15 cm unterhalb der Decke, die Kamera und die Entlüftungs verstecken.
   3. Drucken Gittermuster auf einem großen weißen Blatt Papier zur Kalibrierung einer Kamera, und legen Sie sie unter dem Tank, um ein kontrast Hintergrund zu liefern.
2. Installieren Lichtquellen.
   1. Erhalten IR-LED-Leuchten und Entfernen eingebauten Lüfter um Lärm zu reduzieren. Fahren Sie die LED mit einem Strom-geregelte Gleichstromversorgung außerhalb des Faraday-Käfig gesetzt.
   2. Installieren IR-LED-Leuchten für die Bildgebung in der Finsternis, und weiße LED-Leuchten für den Antrieb eines Tageslichtzyklus in der Test Fisch. Direkt alle Lichtquellen in Richtung Decke auf indirekte und gleichmäßige Ausleuchtung (3A) zu erreichen.
   3. Regulieren Sie die Tageslichtzyklus durch den Antrieb des weißen LED-Leuchten mit einem Timer-gesteuerten Schalter (z. B. 12 h on/12 h aus).
3. Installieren Sie eine Kamera direkt über dem Aquarium.
   1. Besorgen Sie sich einen NIR-empfindlichen Kamera, oder entfernen Sie einen IR-Sperr filter durch Aufbrechen einer dünnen Folie aus getöntem Glas auf der Rückseite der Linsenanordnung. Stellen Sie sicher, weit genug, um das ganze Bild zentralen Arena der Betrachtungswinkel ist.
   2. Machen Sie ein kleines Sichtloch in der Mitte der Deckenplatte und legen Sie die Kamera direkt über das Loch.
   3. Installieren Sie einen weißen Schutzring um das Objektiv, wenn die Lichtquellen erzeugen starrt.
4. Machen Sie eine zeitsynchrone Videoaufzeichnung.
   1. ViaMichelin für eine IR-LED an einer der vier Ecken Tank zu Zeit Synchronisationsimpulse (1 ms Dauer, 10 sec Zeitraum) zu erzeugen. Hinzufügen eines Lastbegrenzungswiderstand (1 k) in Serie, und treiben die IR-LED von einem Digital-Ausgang des Digitalisierers Hardware.
   2. Verwenden Sie Video-Recording-Software mit der Kamera, wenn verfügbar gebündelt. Wählen Sie die höchste Aufnahmequalität (zB die verlustfreie Kompression) und die höchsten Auflösungen unterstützt.
   3. Starten Sie das Video-Aufzeichnung unmittelbar vor Beginn des EOD-Aufnahme, und stoppen Sie die Videoaufnahme Immeunmittelbar nach dem EOD-Aufnahme.
   4. Nach der Aufzeichnung, wandeln die Bildnummern am Digitizer Zeiteinheit durch lineare Interpolation zwischen der ersten und der letzten von der Signal Digitizer und der Videoaufzeichnung erfasst Lichtimpulse.
5. Automatisierte Bildverfolgungs
   Die Hinweise sind für die Bildverarbeitung MATLAB Toolbox geschrieben, und nutzen Sie seine Funktionen. Eine benutzerdefinierte MATLAB-Skript wird mit dieser Vorlage für die automatisierte Bildverfolgungs Verfügung gestellt.
   1. Importieren Sie Video. Importieren Sie eine Video-Aufnahme-Datei direkt auf der MATLAB-Arbeitsbereich mit "Videoreader. Gelesen"-Funktion.
   2. Erstellen Sie ein zusammengesetztes Bild Hintergrund durch Kombination von zwei Einzelbildern. Ersetzen der Bildbereich von einem Tier mit einem unbesetzten Bild der gleichen Region von einem anderen Rahmen (siehe Fig. 3B) besetzt.
   3. Geben Sie einen Bildbereich zu, indem eine kreisförmige Maske um die zentrale Arena, die ein auszuschließen verfolgenrea außen (3B unten), und vermehren sich durch einen konstanten (r _int), um eine Mindestschwelle für Intensitätsdifferenz eingestellt. Sie beispielsweise rucken = 0,85 wird die Intensitätsschwankungen zu unterdrücken = 15% - unter dem Hintergrund (1 r _int).
   4. Bild Subtraktion. Subtrahieren Sie einen Bildrahmen (= IM _k) von dem Hintergrundbild (= _IM-0), um den Differenzbild (= ΔIM _k) zu erhalten. Verwenden unsigned integer numerische Genauigkeit, um die Bildintensitätswerte als nicht-negativen ganzen Zahlen zu speichern.
   5. Segment das Differenzbild durch Anlegen einer Intensitätsschwelle von der graythresh Funktion bestimmt. Reinigen Sie das Bild mit dem binären bwmorph Funktion, und wählen Sie die größte Blob entsprechend eines Tieres nach Berechnung aller Blob Gebieten mit der Funktion regionprops.
   6. Bestimmen Sie den Schwerpunkt und Hauptorientierung einxis der größte Klecks durch Anwenden der regionprops Funktion und dreht das Bild, um die Hauptachse mit der x-Achse auszurichten. Teilen Sie das Bild, um Kopf-und Heckteile im Schwerpunkt (3D oben).
   7. Bestimmen Sie die Hauptachse des Kopfteils, und drehen Sie das gesamte Bild mit der x-Achse (Abbildung 3D unten links) auszurichten. Fit Begrenzungsboxen rund um die Kopf-und Schwanzteile parallel zu ihren Hauptachsen mit der regionprops Funktion.
   8. Bestimmen Sie die mittlere y-Koordinaten des Blobs an der linken, mittleren und rechten vertikalen Kanten der Begrenzungsrahmen (grüne Punkte in 3D unten), und weisen Sie sie fünf Spielpunkte (Kopf-Spitze, mid-Kopf, Körpermitte , Mid-Schwanz, Schwanzspitze).
   9. Prozess aufeinanderfolgenden Rahmen nach Bild beschneiden Rahmen an Schwerpunkt des Tieres aus seiner vorherigen Rahmen bestimmt zentriert.
   10. Die Kopforientierung manuell zuweisen für das erste Bild, und verwenden Sie einen Punkt-Produkt zwiscen der Orientierungsvektoren aus zwei aufeinanderfolgenden Frames automatisch die Kopforientierung. Überprüfen Sie das Ergebnis, und die Kopforientierung manuell drehen, wenn sie falsch zugeordnet.
6. Zeichnen Sie ein Tier und Weise, indem die Kopf-Tipps und glatt mit Median-und Durchschnitts Filter (n = 3), wenn sie einen nervösen Auftritt hat. Überlagern die Flugbahn mit einem Hintergrundbild und interpolieren Fisch Mittellinien mit den fünf Merkmalspunkte (siehe Abbildung 2E).
7. Berechnen Sie die durchschnittliche EOD Rate an jedem Bildaufnahmezeit durch Resampling der momentanen EOD Rate (100 Hz Abtastrate) und Mittelung (0,0625 Sek. Zeitfenster). Zeichnen Sie die Flugbahn in Pseudo-Farben aus der Zeit abgestimmt EOD Rate bestimmt und überlagert mit einem Hintergrundbild (siehe Abbildung 2F).

Ergebnisse

EOD Tracking-Ergebnisse

Die aufgezeichneten EOD Wellenformen aus verschiedenen Elektrodenpaare variiert in Amplituden und Formen, wie sie von ihren einzigartigen Positionen und Orientierungen (2C oben) erwartet. Die Verwendung von mehreren Elektrodenpaaren sichergestellt starken Signalempfang an allen möglichen Positionen und Orientierungen des WEF innerhalb des Tanks. Der Umschlag Wellenform (2C Boden, grüne Kurve) immer einen einzigen Peak pro EOD-Zyklus, d...

Diskussion

Bedeutung unserer Techniken. Zusammenfassend zuerst beschrieben wir den Bau eines großen Aquarium und eine Isolationskammer zu spontanen Erkundungsverhalten von WEF hergestellt beobachten. Weiter haben wir gezeigt, die Technik der Aufnahme und die Verfolgung der EOD Rate und die Bewegungszustände von Fisch ungebremst in Echtzeit über mehrere Elektrodenpaare. Schließlich haben wir beschrieben, die Infrarot-Videoaufzeichnungsverfahren durch Wasser in einem zeitsynchron und das Bildverfolgungsalgorithmus, um d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
			[Aquarium construction]
Electrically shielded floor heater	ThermoSoft Corp., IL, USA	ThermoTile	www.thermosoft.com
Tempered glass panel	generic		.5 inch thick, used for the aquarium construction
Aquarium grade silicone	generic
Acrylic sheet	generic		.25 inch thick, matt white
Natural rubber sheet	generic		.25 inch thick
Servomotor	HITECHRCD Inc., Korea	HS-325HB, 180deg rotation	www.servocity.com
Servomotor arm mount	HITECHRCD Inc., Korea	56362 Large Spline	www.servocity.com
Servomotor controller (6 chan.)	sparkfun.com	ROB-09664	Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller
Active USB extension cable	C2G	38990	12m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable
Exhaust fan	Nutone	ILFK120	www.homedepot.com
Vertical aquarium filter	Tetra, Germany	Whisper Internal Power Filter - 40i
Crushed coral			Used to increase the pH of the tank water
			[EOD recording setup]
Graphite Electrodes	Staedtler, Germany	Mars Carbon 2-mm type HB	Shave the outer coating
Physiological Amplifier/Filter	Intronix, Canada	2015F
Coaxial Cable	generic	RG174	For electrodes assembly
Coaxial Cable	generic	RG54	For wiring use
BNC jack connector for RG-174	Amphenol Connex	112160	For electrodes assembly
BNC plug connector for RG-54	Amphenol Connex	112116	For wiring use
Signal digitizer hardware	Cambridge Electronic Design, UK	Power MKII 1401
Signal digitizer software	Cambridge Electronic Design, UK	Spike 2. ver 7
			[Visual tracking setup]
White LED light	IKEA, Sweden	DIODER 201.194.18	www.ikea.com
Infrared LED light (850 nm)	Scene Electronics, China	S8100-60-B/C-IR	Remove built-in fan
USB webcam	Logitech Inc., CA, USA	C910	Remove Infrared blocking filter
Motorized camera	Logitech Inc., CA, USA	Quickcam Orbit	Remove Infrared blocking filter
Video recording software	Logitech Inc., CA, USA	Logitech Quickcam Software	Download from www.logitech.com
Matlab	Mathworks, MA, USA	2012a	Image processing toolbox