Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu serbest zaman uyumlu bir duyusal içinde özel olarak tasarlanmış bir akvaryum tank içinde hem doğru ve güvenilir bir hayvanın elektrik organı deşarj zamanlaması, vücut konumu ve duruşu ölçülerek, uzun bir süre boyunca zayıf elektrik balık yüzme spontan davranışını incelemek için teknikler bir dizi tanımlamak izolasyon odası.

Özet

Uzun vadeli davranışsal izleme seyrek meydana gelen de dahil olmak üzere doğal hayvan davranışları yakalamak ve ölçmek olabilir. Bu tür keşif ve sosyal etkileşimler gibi davranışlar iyi pervasız, özgürce davranarak hayvanları gözlemleyerek ele alınabilir. Zayıf elektrik balığı (WEF) ekran elektrik organı akıntı (EOD) yayan tarafından kolayca gözlemlenebilir keşif ve sosyal davranışlar. Burada, biz eşzamanlı EOD, vücut pozisyonu, ve uzun bir süre için serbest yüzme WEF duruşu ölçmek için üç etkili teknikleri tarif. İlk olarak, bu tür ışık, ses ve titreşim gibi duyusal uyaranların dış kaynaklardan engellemek üzere tasarlanmış bir yalıtım bölmesinin içine deneysel tankın yapımını tarif eder. Akvaryum dört test örneklerini barındırmak için bölümlenmiş ve otomatik kapıları uzaktan merkezi arenada hayvanların erişimini kontrol edildi. İkincisi, biz özgürce WEF yüzme hassas ve güvenilir bir gerçek zamanlı PMİ zamanlama ölçüm yöntemini tarif. Hayvanın vücut hareketlerinden kaynaklanan sinyal bozulmaları mekansal ve zamansal ortalama alma işleme aşamaları tarafından düzeltilir. Üçüncü olarak, biz soğukkanlı gece hayvan davranışlarını gözlemlemek için bir sualtı yakın-kızılötesi görüntüleme kurulumu açıklanmaktadır. Kızılötesi ışık darbeleri uzun bir kayıt süresi boyunca, video ve fizyolojik sinyal arasındaki zamanlama senkronize etmek için kullanıldı. Bizim otomatik izleme yazılımı bir su sahnesinde güvenilir hayvanın vücut pozisyonu ve duruşu ölçer. Birlikte, bu teknikler serbestçe güvenilir ve kesin bir şekilde zayıf elektrik balık yüzme kendiliğinden davranışının uzun süreli gözlem sağlar. Biz yöntemi benzer keşif veya sosyal davranışları ile kendi fizyolojik sinyalleri ile diğer su hayvanları çalışmaya uygulanabilir inanıyorum.

Giriş

Arkaplan. Hayvan davranışları üzerine nicel deneyler (örneğin zorunlu tercih, şok kaçınma, T-labirent, vb.), Tipik olarak, duyusal-motor becerileri ile ilgili öğrenme ve bellek oluşumu spesifik hipotezleri araştırmak için kullanılmaktadır. Ancak, bu kısıtlayıcı deneyler doğal hayvan davranışlarının zenginliği çok özledim ve davranışın altında yatan nöral temeli basitleştirilmiş modelleri sonuçlanması muhtemeldir. Daha doğal koşullarda deneyler nedenle biz daha tam bir tür davranış repertuarı keşfetmek hangi önemli bir tamamlayıcıdır. Serbestçe hareket hayvanları ile ilgili deneyler, ancak bu tür hareketleri kaynaklı kayıt eserler gibi eşsiz teknik sorunları ele almalıdır. Uyarıyla tetiklenen tepkiler farklı olarak, kendiliğinden meydana gelen araştırıcı davranışı tahmin edilemez, bu nedenle deneysel konular sürekli olarak izlenir ve uzun bir süre boyunca izlenir gerekir. Özel araştırma soruları can en iyi özenle seçilmiş organizmalar ve mevcut teknik araçları tarafından ele. Örneğin, genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri 1 ve optogenetik 2 gibi optik kayıt ve stimülasyon teknikleri başarıyla serbestçe genetik model organizmalar 3-5 hareketli tatbik edilmiştir. Alternatif olarak, minyatür sinir telemetri sistemleri kaydedebilir ve küçük hayvanlara 6,7 hareket serbestçe uyarır.

Elektrikli balık. WEF türler onların yakın çevresini algılamak ya da daha büyük mesafeler üzerinden iletişim kurmasına izin elektrik organı deşarjları (EODs), üretir. EODs zamansal desenler tür öz-hareketler 8,9, duyusal uyaranlar 10,11 ve sosyal etkileşimlerinin 12,13 gibi farklı koşullar altında değişir. Sürekli yarı sinüs dalga şekilleri oluşturmak için dalga-tipi türlerin aksine darbe tipi WEF türler, ayrık bakliyat bir tren üretmek. Genel olarak, darbe tipi türler sergi morE değişken EOD oranı dalga tipi türlere göre ve hayvanların EOD oyu yakından onların duyusal çevresi 10,14 yenilik içeriğini yansıtmaktadır. Pulse-tipi türler hemen yeni bir duyusal tedirgemesi (yenilik yanıt 10,11,14) için cevap veren bir tek darbe döngüsü içindeki arası nabız aralığı (IPI) kısaltabilir. Bu balıkların devam eden elektrik davranış dış kaynaklardan kontrolsüz duyusal uyaranlar tarafından tedirgin olabilir ve bu tür titreşim, ses, elektrik, ve ışık gibi uyarıcıların farklı tetik yenilik yanıtları bilinmektedir. Bu nedenle, özel önlemler serbest yüzme WEF uzun süreli gözlem sırasında dış duyusal uyaranlara engellemek ya da azaltmak için alınmalıdır. Bu şekilde, EOD hızı ve hareket yörüngelerine değişimler özel deneyi tarafından sunulan uyaranlara atfedilebilir.

Akvaryum tankı ve izolasyon odası. Dolayısıyla titreşim emici malzemelerin çoklu katmanlar yerleştirilir under büyük bir akvaryum tankı (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m), ve ışık, elektriksel gürültü, ses ve ısı akışı dış kaynakları engellemek için yalıtılmış bir muhafaza ile tankı çevrili. EOD oranı, çevredeki sıcaklığa 15,16 bağlıdır böylece su sıcaklığı sıkıca Güney Amerika WEF türler için tropikal bir aralık (25 ± 1 ° C) düzenlenmiştir. Biz esas olarak iki boyutlu (Şekil 1A) sınırlı DEF mekansal keşif davranışlarını gözlemlemek için geniş ve sığ (10 cm su derinliği) deposu inşa. Tank ayrı ayrı balık (Şekil 1B) evine merkezi mekansal davranışlarını gözlemlemek arena ve dört köşe bölmelere bölünmüştür. Her bölme bireyler arasındaki elektriksel iletişimi önlemek için su geçirmez inşa edilmiştir. Merkezi arenaya hayvanların erişim dört motorlu kapıları ile dışarıdan kontrol edildi. Kapıları bölmeler arasına yerleştirilmiş ve kilitli zaman su geçirmez oldularnaylon kanat tarafından fındık. WEF metallere karşı hassas tepki beri metalik parçalar sualtı kullanıldı.

EOD kaydı. EODs (Mormyridsleri içinde) tek aktivasyonu veya 17,18 (Gymnotiforms olarak) birden fazla dağınık elektrik organları tarafından basmakalıp bir şekilde üretilmiştir. Medüller kalp pili gibi sırayla ön beyin 19 aksonal projeksiyonlar alır diensefalik prepacemaker nükleus gibi yüksek beyin bölgelerinden direkt nöral girdiler aldığı beri EOD oranının zamansal modülasyon, üst düzey nöral faaliyetlerini ortaya çıkarabilir. Ancak, EOD zamanlama dikkatli bir ham dalga kayıt çıkarılan ve hayvanın hareketi kaynaklı çarpıtmalar tarafından önyargılı olmamak gerekir. Bir WEF tarafından üretilen elektrik alanı dipol olarak yaklasık olabilir, bu nedenle kayıt elektrotlar PMİ darbe genlikleri hayvan ve elektrotlar 8,20 arasındaki bağıl mesafeler ve yönelimleri bağlıdır. Hayvanın kendini movemEnt Bu şekilde, farklı hareketler elektrotlarda EOD genlikleri (Haziran et al. 8 Şekil 2B, bakınız) uçucu bir şekilde, zaman içinde değişir neden, hayvan ve elektrotlar arasındaki nispi geometri değiştirin. Elektrikli organların farklı bir dizi göreli katkıları kuyruk bükme tarafından tanıtıldı vücut uzunluğu ve yerel eğriliklerin boyunca konumlarını bağlıdır çünkü Ayrıca, kendi kendine hareketler de, kaydedilen PMİ dalga şeklini değiştirmek. EOD genlik ve şekil hareketi kaynaklı çarpıtmalar yanlış ve güvenilmez EOD zamanlama ölçümleri yol açabilir. Biz mekansal farklı yerlerde kaydedilen birden fazla PMİ dalga formları ortalamasını alarak bu sorunları üstesinden, ve tam bir serbest yüzme WEF gelen EOD zamanlamasını belirlemek için bir zarf çıkarma filtre ekleyerek. Ayrıca, tekniği de bir hayvan EOD değişikliği dayalı istirahat veya aktif hareket olmadığını göstermek EOD genliklerde ölçerzamanla genlikleri (Şekil 2E ve 2F bakınız). Biz ortak mod gürültüsünü azaltmak için kayıt elektrot çiftlerinden farklılaşarak güçlendirilmiş sinyalleri kaydedildi. EOD bakliyat düzensiz zaman aralıklarında üretilen bu yana, EOD olay zaman serisi değişken örnekleme oranı var. Tercih edilen bir analitik araç tarafından gerekirse EOD zaman serisi enterpolasyon ile sabit bir örnekleme oranına dönüştürülebilir.

Video kaydı. EOD kayıt bir hayvan brüt hareket aktivitesini izleyebilir karşın, video kaydı, bir hayvanın vücut pozisyonu ve duruş doğrudan ölçülmesini sağlar. Yakın kızılötesi (NIR) aydınlatma (λ = 800 ~ 900 nm) WEF karanlıkta en aktif ve gözleri NUR spektrum 23,24 duyarlı olmadığından serbestçe, balık 21,22 yüzme soğukkanlı görsel gözlem izin verir. Çoğu dijital görüntüleme sensörleri (örn. CMOS veya CCD) wavelengt NIR spektrum yakalayabilirfiltreyi 25 tıkayan bir kızılötesi (IR) çıkardıktan sonra 800-900 nm arasında saat aralığı. Bazı high-end tüketici sınıf kamerası mevcut profesyonel kalitede IR kameralar çok daha büyük maliyetleri bir görüntü kalitesi karşılaştırılabilir, ya da üstün üretebilir yüksek çözünürlüklü, geniş görüş açısı ve iyi düşük ışık hassasiyeti, sunuyoruz. Buna ek olarak, bazı tüketici sınıf kamerası hiçbir kalite kaybı ile video sıkıştırma tarafından genişletilmiş bir kayıt süresini izin kayıt yazılımı ile birlikte verilir. Çoğu profesyonel kalitede fotoğraf makineleri dijital sinyalleri ile video arasındaki zamanlamayı hizalanması için 26 saat senkronizasyonu TTL darbe çıkışları ya da tetik TTL darbe girişlerini sunuyoruz, ancak bu özellik tüketici sınıf kamerası genellikle yoktur. Ancak, video kayıt ve bir sinyal sayısallaştırıcınız arasındaki zamanlama doğru aynı anda kamera ve sinyal sayisallastirici LED periyodik olarak yanıp sönen IR çekimi ile uyumlu olabilir. Başlangıçtaki ve son IR darbe zamanlama kullanılabilecek birtersi sinyal dijitalleştirici zaman birimi için video kare numaraları dönüştürmek ve s iki kez Kalibrasyon işaretleri.

Aydınlatma ve arka plan. Su ile yakalama görüntü nedeniyle su yüzeyinde ışık yansımaları teknik açıdan zorlayıcı olabilir. Su yüzeyi sualtı bir su üstünde görsel bir sahne, ve karanlık görsel özelliklerini yansıtan bir ayna olarak hareket edebilir, bu nedenle su üstünde sahne görsel etkileşimi önlemek için özelliksiz hale getirilmelidir. Görüntü için tüm akvaryum içinde, bir kamera doğrudan su üstünde yerleştirilmesi gereken ve bu su yüzeyinde kendi yansımasını önlemek için küçük bir görüntüleme delik üzerine tavan arkasındaki gizli olmalıdır. Işık kaynakları yanlış tahmin edilmektedir Ayrıca, eğer su yüzeyi glares ve kuralsız aydınlatma üretebilir. Dolaylı aydınlatma, tavana doğru ışık kaynakları yönelterek tüm akvaryumun üzerinde düzgün bir parlaklık elde edebilirsiniz şekilde tavan ve çevredeki walls yansıtır ve su yüzeyine ulaşmadan önce ışınları yaygın olabilir. Kamera (örneğin 850 nm dalga boyu tepe) bir spektral tepki eşleşen bir IR aydınlatıcı seçin. Işık kaynaklarından elektrik gürültü LED ışıkları kullanarak ve Faraday kafesi dışında kendi DC güç kaynağı koyarak minimize edilebilir. Balık NIR dalga boylarında beyaz bir arka iyi tezat yana, tankın altında beyaz bir arka plan yerleştirin. Benzer şekilde, yalıtım bölmesinin iç yüzeyleri üzerinde mat beyaz renkli kullanımı düzgün ve parlak bir arka aydınlatma sağlar.

Video izleme. Bir video kaydettikten sonra, otomatik bir görüntü izleme algoritması zamanla hayvanın vücut pozisyonlarını ve duruşlar ölçebilirsiniz. Video izleme otomatik ya hazır kullanımlı yazılımı (Bakış açısı veya Ethovision), ya da kullanıcı-programlanabilir yazılım (OpenCV veya MATLAB görüntü işleme araç kutusu) tarafından yapılabilir. Görüntü izleme ilk adım olarak,Geçerli bir izleme alanı (maskeleme işlemi) dışındaki alanı hariç tutmak için bir geometrik şekil çizerek tanımlanmalıdır. Daha sonra, bir hayvanın resim hayvan içeren bir resimdeki bir arka plan görüntüsü çıkarılarak arka izole edilmesi gerekmektedir. Çıkarılmış görüntü sentroidinin ve yönlendirme eksen ikili morfolojik faaliyetlerinden hesaplanabilir şekilde bir yoğunluk eşik uygulayarak ikili bir biçimde dönüştürülür. Gymnotiforms 27-29 ve 30-32 Mormyridsleri olarak, electroreceptor yoğunluk kafa bölgesine yakın olarak yüksek olduğu, bu yüzden her an baş konumu, en yüksek duyusal keskinliği bir konumunu gösterir. Baş ve kuyruk yerleri otomatik görüntü döndürme ve sınırlayıcı kutu işlemleri uygulanarak tespit edilebilir. Baş ve kuyruk uçları elle ilk karede onları tanımlayan ve iki ardışık kareyi karşılaştırarak kendi yerleri takip ederek birbirinden ayırt edilebilir.

Protokol

Bu prosedür Ottawa Hayvan Bakım Komitesi Üniversitesi gereksinimlerini karşılar. Hiçbir çıkar çatışması ilan edilir. Ekipman ve aşağıda listelenen maddelerin marka ve modelleri için Malzeme ve Reaktitlerin Tablo bakınız. Özel yazılmış Spike2 ve MATLAB komut ve örnek veriler Ek Dosya verilmektedir.

1.. Akvaryum Tank ve İzolasyon Odası Kurulumu

  1. Anti-v ibration kat. Alttan üstüne (Şekil 1A) kauçuk pedleri, akustik Strafor, deniz kontrplak paneli ve poliüretan köpük pedleri istifleme bir anti-titreşim yüzeyi (2,1 mx 2,1 m) Construct. Akvaryum tankı kenarlarını destekleyecek kontrplak panel üzerinde dört ahşap saplamalar (5 cm x 10 cm) yerleştirin.
  2. Kat kaloriferi. (Şekil 1D altına bakınız) termal dereceli köpük dolgu üzerinde bir elektriksel ekranlı ısıtma elemanı yatıyordu. Bir metal ile ısıtma elemanı Kapaklic elektrik koruma için örgü.
  3. Mekansal tankı. Kalınlığında cam paneller, L-şekilli alüminyum çerçeve ve akvaryum dereceli silikon (Şekil 1A bakınız) temperli 1.3 cm kullanan geniş ve sığ bir akvaryum tankı (1,8 mx 1,8 mx 30 cm) Construct. (Protokol: 3), yüksek görüntüleme kontrast sağlamak için beyaz arka plan büyük bir levha ile tankın alt kapak.
  4. (0.64 cm kalınlığında beyaz mat) akrilik levhalardan yapılmış (22.5 cm boyunda) yükleyerek duvarlar tarafından merkezi bir alanda (1,5 m çap) ve dört köşe bölmeleri (Şekil 1B bakınız) içine akvaryum tankı bölün.
    1. Dört kavisli duvar bölümleri oluşturmak, ve dört köşe bölmelerinden merkezi arena ayırmak için silikon kalafat kullanarak tank tabanına ekleyebilirsiniz ısı uygulanarak bend dört akrilik levhalar (22.5 cm x 102.7 cm). Kapı montaj için kavisli bölümler arasında 20 cm boşluk bırakın.
    2. Dört çift duvar wi yükleyerek ayrı komşu köşe bölmeleriBöyle bir Hidrofondan gibi sualtı sensörler için fazladan elektrik izolasyon ve yerleri sağlamak inci 15 cm boşluklar.
  5. Dört motorlu kapı montaj ve köşe bölmeleri ve merkezi arena arasında bunları yükleyin.
    1. Şekil 1C gösterildiği gibi dört kapı çerçeveleri birleştirin. Her kapı çerçeve üzerinde altı kuyu (0.64 cm derinlik) oluşturmak, naylon palamut fındık (0.64 cm çap diş) gömmek ve epoksi ile sabitleyin.
    2. Ve akrilik kauçuk tabakalar dört kapı panelleri kesme ve kilitleme mekanizması için, akrilik ve kauçuk panellerde altı delik (0.64 cm çapında) oluşturur. Silikon doldurmayı kullanarak akrilik ve kauçuk paneller katılın.
    3. Install akrilik kapı çerçeveleri ile kapı panelleri katılmak için menteşeleri.
    4. Dağı servo motorlar üzerinde silah sallanan, ve (Şekil 1C bakın) kapı çerçevelerinin üstüne onları yükleyin. Kapı panelleri için sallanan kollarını bağlamak için kablo bağları ile döngüler olun.
    5. Ga üzerinde kapı montajları yerleştirinps kavisli duvar bölümleri arasında oluşturulan ve silikon doldurmayı kullanarak sabitleyin.
    6. Bir servo kontrol için tüm servo motorlar, ve aktif bir USB uzatma kablosu aracılığıyla bir güç kaynağına ve bilgisayara bağlayın. Servo kontrol ile sağlanan kontrol yazılımı kullanarak kapıları kontrol edin.
    7. Silikon sertleştikten sonra, naylon vidalar ile tüm kapıları kilitleme ve bir seferde bir bölme doldurarak su geçirmezlik için kontrol edin.
  6. İzolasyon odası. Akvaryum çevreleyen ve (Şekil 1D bakınız) ışık, ses ve elektriksel gürültü dış kaynaklarını engellemek için bir izolasyon haznesi oluşturun.
    1. Üç duvar panelleri (2 mx 2 mx 5 cm) ve dört kapı panelleri (1,9 mx 0,95 mx 5 cm) olun. Her panel için, bir dikdörtgen çerçeve oluşturmak için alüminyum pervaz (5 cm x 2,5 cm) katılmak ve alüminyum çerçeve üzerinde beyaz bir oluklu plastik paneli perçin. Akustik fiberglas paneller tabakaların ve siyah oluklu plastik panel ile yakın doldurun.
    2. Titreşim katta üç duvar panelleri kurmak ve yüklemek piyano duvar panelleri üzerinde dört kapı panelleri katılmak için menteşeleri.
    3. Alüminyum kafesleri ile izolasyon odasını çevreleyen ve zemin bir Faraday kafesi oluşturmak için her tarafta kafesleri.
  7. Nem kontrolü. Isıtma aşırı nem birikmesini kaldırmak için düşük gürültü egzoz fanı (Şekil 1F üst) yükleyin. En az 2 m uzakta kayıt sitesinden egzoz fanı yerleştirin ve izolasyon odası ve egzoz fan arasında bir hava kanalı yükleyin.
  8. Rutin olarak izlemek ve tank su ve hayvan koşullarını korumak.
    1. 10 cm derinliğinde, 100 us / cm iletkenlik ve su veya tuz stok solüsyonu (tarifi için Knudsen 33 bakınız) eklenerek pH 7.0 'de sabit su koşulları sağlamak. PH 6,5 'in altında düşerse ezilmiş mercan bir çanta ekleyin.
    2. Temizlik için sığ suda işletmek ve dikey olabilir akvaryum filtreleri takınhavalandırma amaçlı (Şekil 1F alt). Filtreleri ayırın ve kayıt oturumları sırasında merkezi arena dışına götürün.
    3. Elastik emme bardak takarak tankın altındaki canlı mealworms sunun. Kayıt sırasında kaçak avlayan kontrolsüz beslenmesini engellemek için böyle blackworms gibi serbest yüzen avlayan kaçının.

2. EOD Takibi

  1. Elektrotlar kurulum. Merkezi arena eğimli duvara sekiz grafit elektrotlar ve eşit boşluk bunları birleştirin.
    1. (15 cm uzunluğunda; Mars Karbon 2. mm tip HB) yol çizim elde etmek ve potansiyel dış kaplama traş.
    2. , Koaksiyel kablo (RG-174) sekiz 10 cm kesimleri kesmek grafit çubuklarının bir ucunda etrafında kablo özünü sarın ve uygulamak ısı shrink güçlü ve kararlı elektriksel bağlantısı için üzerlerine boru. Zıt uçlarında (Şekil 2A sol) BNC jack konnektörleri takın.
    3. Taping tarafından duvara elektrotlar yerleştirin ve silikon korumak için elektrot yüzeylerinde maskeleme ince şerit bant uygulanır. Kalıcı elektrotları tutun ve silikon artıkları (Şekil 2A sağda) önce tüm bandı çıkarmak için silikon doldurmayı uygulayın.
  2. Amplifikatör ünitesine her elektrot arasındaki mesafeyi ölçme ve uzunluklarda koaksiyel kablolar (RG-54) keserek sekiz kablo montajları oluşturun. Kabloların iki ucunda BNC fiş konnektörleri takın.
  3. Amplifikatör ünitesine tüm elektrotlar tel kablo montajları kullanın. Diferansiyel Faraday kafesi onları bağlayarak tüm koaksiyel koruyucu teller (Şekil 2B) iki 90 ° odaklı elektrotlar eşleştirme tarafından yükseltmek ve zemin.
  4. Sinyal doygunluk sınırının altında amplifikatör kazancı ayarlayın ve gürültü çıkarmak için bir bant geçiren filtre (200 Hz-5 kHz) uygulanacaktır. 40 KS / sn hızında dört kayıt elektrot çiftleri sayısallaştır.
  5. Çevrimiçisinyal işleme. Talimatlar Spike2 yazılım için yazılır ve parametre ayarları Gymnotus sp için optimize edilmiştir. (Özet için bakınız Şekil 2C).
    1. Ekle DC tüm kayıt kanalları işlemi (τ = 0.1 sn) çıkarın.
    2. Tüm kayıtlar kanallarına bir rektifiye işlemi ekleyin.
    3. Dört kayıt kanalları toplanmasıyla sanal bir kanal oluşturun.
    4. Bir RMS ekleyerek PMİ darbe başına bir unimodal zarf Özü (root-mean-squared, figure-protocol-7366 Açıkça darbe zamanlamasını belirlemek için PMİ çevrimi başına tek bir tepe oluşturmak için sanal kanala) süreci (τ = 0.25 msn).
    5. Sanal kanalı bir Realmark kanalı oluşturmak ve tüm EOD bakliyat wi yakalamak için uygun bir eşik ayarladıktan sonra, zaman ve genlik zirve değerlerini kaydetmekyanlış pozitif kaçınarak thout, bir darbe eksik.
    6. Bir anlık frekans moduna Realmark kanal kanal görüntüleme seçeneği ayarlayarak gerçek zamanlı anlık EOD hızını izlemek.
    7. Realmark kanalı çoğaltarak gerçek zamanlı balık hareketi izlemek ve bir dalga moduna ekran seçeneğini ayarlayın.
    8. Realmark kanalı (0.01 sn örnekleme dönemi) bir sanal kanal oluşturarak EOD genlik eğimin RMS bir etkinlik düzeyini ölçmek ve eğim (τ = 0.25 msn) ve RMS (τ = 0.5 milisaniye) süreçleri ekleyin.
    9. MATLAB formatında Spike2 yazılım Realmark kanalı ihracat.

3. Senkronize ve Video Takip

  1. Bir arka plan sahne oluşturun.
    1. Mat beyaz tezgah film ile kaplayarak su yüzeyinde bir yansıması atmalarını herhangi bir nesneyi gizlemek.
    2. Bir mat beyaz yükleyinKamerayı ve hava deliği gizlemek için 15 cm tavanın altında oluklu plastik paneli.
    3. Bir kamera kalibre için beyaz kağıt büyük bir kağıda yazdırma ızgara desenleri ve yüksek kontrastlı arka plan sağlamak için tankın altında yatıyordu.
  2. Işık kaynakları yükleyin.
    1. Elde IR LED ışıkları ve gürültüyü azaltmak için dahili fanlar kaldırın. Faraday kafesi dışına yerleştirilmiş bir akım ayarlı DC güç kaynağı ile LED sürün.
    2. IR karanlıkta görüntüleme için ışıklar ve test balık bir gündüz ışık döngüsü sürüş için beyaz LED LED ışıklar yükleyin. Dolaylı ve homojen aydınlatma (Şekil 3A) ulaşmak için tavana doğru doğrudan tüm ışık kaynakları.
    3. Beyaz sürerek gündüz ışık döngüsünü düzenleyen bir zamanlayıcı kontrol anahtarı (örneğin 12 saat on/12 saat kapalı) ile LED ışıklar.
  3. Doğrudan akvaryum üzerinde bir kamera takın.
    1. Bir NIR-duyarlı bir kamera alın, ya da bir kızılötesi engelleme filte kaldırmaklens takımının arkasında renkli cam ince tabaka kırarak r. Görüş açısı görüntünün tüm merkezi arena yeterince geniş olduğundan emin olun.
    2. Tavan panelinin ortasında küçük bir gözetleme deliği yapmak ve doğrudan deliğin üstünde kamera yerleştirin.
    3. Işık kaynakları glares oluşturmak eğer lens etrafında beyaz bir halka bekçi yükleyin.
  4. Bir zaman senkronize video kaydı yapmak.
    1. IR zaman senkronizasyonu bakliyat (1 msn süre, 10 saniye süre) oluşturmak için dört tankı köşelerinden birinde LED yerleştirin. Seri bir yük sınırlayıcı direnç (1 kW) ekleyin ve dijitalleştirici donanım dijital bir çıkış noktasına gelen IR LED sürücü.
    2. Kamera varsa ile birlikte video kayıt yazılımı kullanın. Yüksek kayıt kalitesini (örneğin kayıpsız sıkıştırma) ve desteklenen yüksek çözünürlükleri seçin.
    3. Hemen EOD kayda başlamadan önce video kaydını başlatmak ve video kayıt derhal durdurunkinveren'in EOD kayıttan sonra.
    4. Kayıttan sonra, doğrusal birinci ve sinyal sayısallaştırıcıya ve video kaydı ile yakalanan son ışık darbeleri arasındaki enterpolasyonlayarak dijitalleştirici zaman birimi için resim çerçeve numaraları dönüştürmek.
  5. Otomatik görüntü izleme
    Talimatlar MATLAB görüntü işleme araç kutusu için yazılmış ve onun fonksiyonları kullanarak yapmak vardır. Özel bir MATLAB komut dosyası, otomatik görüntü izleme için bu sunulması ile sağlanır.
    1. Video import. Doğrudan kullanarak MATLAB çalışma alanına bir video kayıt dosyasını içe "Videoreader. Okumak" fonksiyonu.
    2. İki resim karelerini birleştirerek bir kompozit arka plan görüntüsü oluşturun. Başka bir çerçeve aynı bölgesinin bir işgal edilmemiş bir görüntü (Şekil 3B) ile bir hayvan tarafından işgal edilen bir görüntü alanını değiştirin.
    3. A dışlamak için merkezi arena etrafında dairesel bir maske çizerek izlemek için bir görüntü bölgeyi belirleyinrea dışında (Şekil 3B alt) ve yoğunluk farkı için asgari eşik ayarlamak için bir sabiti (r int) ile çarpın. Arka altındaki - (r int 1) Örneğin, Rint ayar 0.85 yoğunluk oranlarındaki değişim% 15 = bastırır =.
    4. Görüntü çıkarma. (= IM 0) fark görüntünün (= ΔIM k) elde etmek için arka plan görüntüsü bir resim çerçevesi (= IM k) çıkarın. Negatif olmayan tamsayılar gibi görüntü yoğunluk değerlerini saklamak için işaretsiz tamsayı sayısal hassasiyet kullanın.
    5. Graythresh işlevi belirlenen bir yoğunluk eşiği uygulayarak Segment fark görüntü. Bwmorph işlevini kullanarak ikili görüntüyü temizleyin ve regionprops fonksiyonunu kullanarak tüm blob alanları hesaplandıktan sonra bir hayvana karşılık büyük blob seçin.
    6. Merkezini ve ana yönelim a belirleyinregionprops fonksiyonunu uygulayarak, ve x-ekseni ile ana eksene hizalamak için görüntüyü döndürmek tarafından büyük blob'un x,. Sentroidi (Şekil 3D üstte) baş ve kuyruk parçaları görüntü bölün.
    7. Baş kısmının ana ekseni belirlemek, ve x-ekseni (Şekil 3D sol altta) ile hizalamak için tüm görüntüyü döndürmek. Başının etrafında sınırlayıcı kutuları Fit ve kuyruk parçaları regionprops işlevini kullanarak kendi ana eksenlerinin paralel.
    8. Sol, orta ve sınırlayıcı kutuları (Şekil 3D alt yeşil noktalar) doğru dikey kenarlarında blob'un medyan y-koordinatlarını belirlemek ve beş özellik noktalarının (baş ucu, orta-kafa, orta vücut bunları atamak , orta kuyruk, kuyruk ucu).
    9. Önceki çerçevesi belirlenen hayvanın sentroidi merkezli bir görüntü çerçevesini kırpma sonra ardışık kare işleyin.
    10. Elle ilk karede için kafa yönünü atamak ve bir nokta-ürün betwe kullanınbirbirini takip eden iki çerçeve arasındaki yönlendirme vektörleri en otomatik olarak baş konumu belirlenmiştir. Sonucu incelemek ve yanlış atanan elle baş yönünü çevirmek.
  6. Baş-ipuçlarını katılarak bir hayvan yörünge çizmek ve medyan ve ortalama filtreleri kullanarak pürüzsüz (n = 3), bir gergin bir görünüme sahipse. Bir arka plan görüntüsü ile yörünge üst üste, ve beş özellik noktaları (Şekil 2E bakın) kullanarak balık midlines katmak.
  7. Anlık EOD oranını (100 Hz örnekleme hızı) yeniden örnekleme ve (0.0625 sn zaman penceresi) ortalama her görüntü yakalama anda ortalama EOD oranını hesaplayın. Zaman uyumlu PMİ oranından belirlenir sözde renklerde yörünge çizmek ve bir arka plan görüntüsü (Şekil 2F bakınız) ile üst üste.

Sonuçlar

EOD izleme sonuçları

Kendilerine özgü konum ve yönelimleri (Şekil 2C üst) beklendiği gibi farklı elektrot çiftleri kaydedilen EOD dalga genlik ve şekilleri değişmiştir. Birden fazla elektrot çiftlerinin kullanılması, tankın içindeki tüm olası pozisyonları ve DEF of yönelimleri de güçlü bir sinyal alımını sağlanmalıdır. Zarf dalga (Şekil 2C alt, yeşil iz) her zaman kesin (= IPI -1) arası nabız aralıkları ve anlık...

Tartışmalar

Bizim teknikleri önemi. Özetle, öncelikle büyük bir akvaryum tankı yapımı ve Dünya Ekonomik Forumu tarafından üretilen kendiliğinden keşif davranışlarını gözlemlemek için bir izolasyon odasını tarif. Sonra, EOD oranı ve çoklu elektrot çiftleri kullanarak gerçek zamanlı olarak kontrolsüz balık hareketi durumlarını kayıt ve izleme tekniği gösterdi. Son olarak, biz bir zaman senkronize bir şekilde su ile infrared video kayıt tekniği, ve vücut pozisyonu ve duruş ölçmek için ...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışma cömertçe Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) ve Sağlık Araştırması Kanada Enstitüleri (CIHR) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
[Aquarium construction]
Electrically shielded floor heaterThermoSoft Corp., IL, USAThermoTilewww.thermosoft.com
Tempered glass panelgeneric .5 inch thick, used for the aquarium construction
Aquarium grade siliconegeneric
Acrylic sheetgeneric .25 inch thick, matt white
Natural rubber sheetgeneric .25 inch thick
ServomotorHITECHRCD Inc., KoreaHS-325HB, 180deg rotationwww.servocity.com
Servomotor arm mountHITECHRCD Inc., Korea56362 Large Splinewww.servocity.com
Servomotor controller (6 chan.)sparkfun.comROB-09664 Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller
Active USB extension cableC2G3899012m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable
Exhaust fanNutoneILFK120www.homedepot.com
Vertical aquarium filterTetra, GermanyWhisper Internal Power Filter - 40i
Crushed coral Used to increase the pH of the tank water
[EOD recording setup]
Graphite ElectrodesStaedtler, GermanyMars Carbon 2-mm type HBShave the outer coating
Physiological Amplifier/FilterIntronix, Canada2015F
Coaxial CablegenericRG174For electrodes assembly
Coaxial CablegenericRG54For wiring use
BNC jack connector for RG-174Amphenol Connex112160For electrodes assembly
BNC plug connector for RG-54Amphenol Connex112116For wiring use
Signal digitizer hardwareCambridge Electronic Design, UKPower MKII 1401
Signal digitizer softwareCambridge Electronic Design, UKSpike 2. ver 7
[Visual tracking setup]
White LED lightIKEA, SwedenDIODER 201.194.18www.ikea.com
Infrared LED light (850 nm)Scene Electronics, ChinaS8100-60-B/C-IRRemove built-in fan
USB webcamLogitech Inc., CA, USAC910Remove Infrared blocking filter
Motorized cameraLogitech Inc., CA, USAQuickcam OrbitRemove Infrared blocking filter
Video recording softwareLogitech Inc., CA, USALogitech Quickcam SoftwareDownload from www.logitech.com
MatlabMathworks, MA, USA2012aImage processing toolbox

Referanslar

  1. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  3. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., De Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
  4. Naumann, E. A., Kampff, A. R., Prober, D. A., Schier, A. F., Engert, F. Monitoring neural activity with bioluminescence during natural behavior. Nat. Neurosci. 13 (4), 513-520 (2010).
  5. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
  6. Mavoori, J., Millard, B., Longnion, J., Daniel, T., Diorio, C. A miniature implantable computer for functional electrical stimulation and recording of neuromuscular activity. In IEEE international workshop on biomedical circuits and systems (BioCAS) 2004; Session: Functional Electrical Stimulators and Related Sensing Techniques. , (2004).
  7. Harrison, R. R., Fotowat, H., Chan, R., Kier, R. J., Olberg, R., Leonardo, A., Gabbiani, F. Wireless neural/EMG telemetry systems for small freely moving animals. IEEE TBioCAS. 5 (2), 103-111 (2011).
  8. Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Precision measurement of electric organ discharge timing from freely moving weakly electric fish. J. Neurophys. 107 (7), 1996-2007 (2012).
  9. Forlim, C. G., Pinto, R. D. Noninvasive Realistic Stimulation/Recording of Freely Swimming Weakly Electric Fish: Movement Detection and Discharge Entropy to Infer Fish Behavior. , (2012).
  10. Caputi, A. A., Aguilera, P. A., Castelló, M. E. Probability and amplitude of novelty responses as a function of the change in contrast of the reafferent image in G. carapo. J. Exp. Biol. 206 (6), 999-1010 (2003).
  11. Pluta, S. R., Kawasaki, M. Multisensory enhancement of electromotor responses to a single moving object. J. Exp. Biol. 211 (18), 2919-2930 (2008).
  12. Heiligenberg, W. Electrolocation and jamming avoidance in a Hypopygus (Rhamphichthyidae, Gymnotoidei), an electric fish with pulse-type discharges. J. Comp. Phys. A. 91 (3), 223-240 (1974).
  13. Capurro, A., Malta, C. P. Noise autocorrelation and jamming avoidance performance in pulse type electric fish. Bull. Math. Biol. 66 (4), 885-905 (2004).
  14. Post, N., von der Emde, G. The "novelty response" in an electric fish: response properties and habituation. Phys. Behav. 68 (1), 115-128 (1999).
  15. Toerring, M. J., Serrier, J. Influence of water temperature on the electric organ discharge (EOD) of the weakly electric fish Marcusenius cyprinoides (Mormyridae). J. Exp. Biol. 74 (1), 133-150 (1978).
  16. Ardanaz, J. L., Silva, A., Macadar, O. Temperature sensitivity of the electric organ discharge waveform in Gymnotus carapo. J. Comp. Phys. A. 187 (11), 853-864 (2001).
  17. Rodríguez-Cattaneo, A., Pereira, A. C., Aguilera, P. A., Crampton, W. G., Caputi, A. A. Species-specific diversity of a fixed motor pattern: the electric organ discharge of Gymnotus. PLoS One. 3 (5), (2008).
  18. Bennett, M. V. L., Hoar, W. S., Randall, D. J. . Fish physiology. , 493-574 (1971).
  19. Wong, C. J. Afferent and efferent connections of the diencephalic prepacemaker nucleus in the weakly electric fish, Eigenmannia virescens: interactions between the electromotor system and the neuroendocrine axis. J. Comp. Neurol. 383 (1), 18-41 (1997).
  20. Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Real-time localization of moving dipole sources for tracking multiple free-swimming weakly electric fish. PLoS One. 8 (6), (2013).
  21. Rasnow, B., Assad, C., Hartmann, M. J., Bower, J. M. Applications of multimedia computers and video mixing to neuroethology. J. Neuro. Methods. 76 (1), 83-91 (1997).
  22. MacIver, M. A., Nelson, M. E. Body modeling and model-based tracking for neuroethology. J. Neuro. Methods. 95 (2), 133-143 (2000).
  23. Douglas, R. H., Hawryshyn, C. W., Douglas, R., Djamgoz, M. . Behavioral studies of fish vision: an analysis of visual capabilities. In The Visual System of Fish. , 373-418 (1990).
  24. Ciali, S., Gordon, J., Moller, P. Spectral sensitivity of the weakly discharging electric fish Gnathonemus petersi using its electric organ discharges as the response measure. J. Fish Biol. 50 (5), 1074-1087 (1997).
  25. Ratledge, D. An Introduction to Webcam Imaging. Digital Astrophotography: The State of the Art. , 31-44 (2005).
  26. Hofmann, V., Sanguinetti-Scheck, J. I., Gómez-Sena, L., Engelmann, J. From static electric images to electric flow: Towards dynamic perceptual cues in active electroreception. J. Phys. Paris. 107, 95-106 (2013).
  27. Castelló, M. E., Aguilera, P. A., Trujillo-Cenóz, O., Caputi, A. A. Electroreception in Gymnotus carapo: pre-receptor processing and the distribution of electroreceptor types. J. Exp. Biol. 203 (21), 3279-3287 (2000).
  28. Caputi, A. A., Castelló, M. E., Aguilera, P., Trujillo-Cenóz, O. Electrolocation and electrocommunication in pulse gymnotids: signal carriers, pre-receptor mechanisms and the electrosensory mosaic. J. Phys. 96 (5), 493-505 (2002).
  29. Pusch, R., et al. Active sensing in a mormyrid fish: electric images and peripheral modifications of the signal carrier. J. Exp. Biol. 211 (6), 921-934 (2008).
  30. Harder, W. Die beziehungen zwischen elektrorezeptoren, elektrischem organ, seitenlinienorganen und nervensystem bei den Mormyridae (Teleostei, Pisces). Z. Vgl. Physiol. 59 (3), 272-318 (1968).
  31. Bacelo, J., Engelmann, J., Hollmann, M., Gvonder Emde, ., Grant, K. Functional foveae in an electrosensory system. J. Comp. Neurol. 511 (3), 342-359 (2008).
  32. Hollmann, M., Engelmann, J., Von Der Emde, G. Distribution, density and morphology of electroreceptor organs in mormyrid weakly electric fish: anatomical investigations of a receptor mosaic. J. Zool. 276 (2), 1469-7998 (2008).
  33. Knudsen, E. I. Spatial aspects of electric fields generated by weakly electric fish. J. Comp. Phys. 99 (2), 103-118 (1975).
  34. Kramer, B. Spontaneous discharge rhythms and social signalling in the weakly electric fish Pollimyrus isidori (Cuvier et Valenciennes) (Mormyridae, Teleostei). Behav. Ecol. Sociobiol. 4 (1), 66-74 (1978).
  35. Stoddard, P. K., Markham, M. R., Salazar, V. L., Allee, S. Circadian rhythms in electric waveform structure and rate in the electric fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Physiol. Behav. 90 (1), 11-20 (2007).
  36. Canfield, J. G. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133 (1-2), 127-134 (2004).
  37. Chen, L., House, J. L., Krahe, R., Nelson, M. E. Modeling signal and background components of electrosensory scenes. J. Comp. Physiol. A. 191 (4), 331-345 (2005).
  38. Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. E. A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities. J. Vis. Exp. (20), (2008).
  39. Windsor, S. P., Tan, D., Montgomery, J. C. Swimming kinematics and hydrodynamic imaging in the blind Mexican cave fish (Astyanax fasciatus). J. Exp. Biol. 211 (18), 2950-2959 (2008).
  40. Shapiro, L. G., Stockman, G. C. . Computer vision. , 367-368 (2001).
  41. Hedrick, T. L. Software techniques for two- and three-dimensional kinematic measurements of biological and biomimetic systems. Bioinsp. Biomim. 3 (3), 034001 (2001).
  42. Babineau, D., Lewis, J. E., Longtin, A. Spatial acuity and prey detection in weakly electric fish. PLoS Comp. Biol. 3 (3), (2007).
  43. Sanguinetti-Scheck, J. I., Pedraja, E. F., Cilleruelo, E., Migliaro, A., Aguilera, P., Caputi, A. A., Budelli, R. Fish geometry and electric organ discharge determine functional organization of the electrosensory epithelium. PLoS One. 6 (11), (2011).
  44. Castello, M. E., Caputi, A., Trujillo‐Cenóz, O. Structural and functional aspects of the fast electrosensory pathway in the electrosensory lateral line lobe of the pulse fish Gymnotus carapo. J. Comp. Neurol. 401 (4), 549-563 (1998).
  45. Canfield, J. G., Mizumori, S. J. Y. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. J. Neurosci. Methods. 133 (1), 127-134 (2004).
  46. Pereira, A. C., Centurión, V., Caputi, A. A. Contextual effects of small environments on the electric images of objects and their brain evoked responses in weakly electric fish. J. Exp. Biol. 208 (5), 961-972 (2005).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 85hayvan takibizay f elektrik balelektrik organ ak ntsualt k z l tesi g r nt lemeotomatik g r nt izlemeduyusal izolasyon odaske if davran

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır