Longo prazo Behavioral Rastreamento de Livremente Natação fracamente elétrico dos peixes

Resumo

Descreve-se um conjunto de técnicas para estudar o comportamento espontâneo de nadar livremente peixe fracamente elétrico durante um período prolongado de tempo, de forma síncrona medição de tempo de descarga do órgão elétrico do animal, a posição do corpo e postura tanto precisa e confiável em um tanque do aquário especialmente concebido dentro de um sensorial câmara de isolamento.

Resumo

Rastreamento comportamental a longo prazo pode capturar e quantificar os comportamentos animais naturais, incluindo aquelas que ocorrem com pouca freqüência. Comportamentos como a exploração e as interações sociais podem ser melhor estudados, observando desenfreadas, animais se comportando livremente. Peixe elétrico Fracamente (WEF) de exibição exploratória facilmente observáveis ​​e comportamentos sociais através da emissão de descarga do órgão elétrico (EOD). Aqui, descrevemos três técnicas eficazes para medir de forma síncrona a EOD, a posição do corpo e postura de um WEF livre de natação por um período prolongado de tempo. Em primeiro lugar, descreve-se a construção de um tanque experimental dentro de uma câmara de isolamento concebido para bloquear as fontes externas de estímulos sensoriais, tais como a luz, som e vibrações. O aquário foi dividido para acomodar quatro corpos de prova, e portas automatizadas controlar remotamente o acesso dos animais para a arena central. Em segundo lugar, nós descrevemos um método de medição em tempo real tempo EOD precisa e confiável de nadar livremente WEF. Distorções de sinal causadas por movimentos do corpo do animal são corrigidos pela média espacial e estágios de processamento temporal. Em terceiro lugar, nós descrevemos uma configuração de imagens de infravermelho próximo submarina para observar comportamentos animais noturnos não perturbados. Pulsos de luz de infravermelhos foram usadas para sincronizar o tempo entre o vídeo e o sinal fisiológico sobre uma longa duração de gravação. Nosso software de monitoramento automatizado mede a posição do corpo do animal e postura de forma confiável em uma cena aquática. Em conjunto, estas técnicas permitem a observação a longo prazo do comportamento espontâneo de nadar livremente peixe fracamente elétrico de uma maneira confiável e precisa. Acreditamos que o nosso método pode ser aplicado de forma semelhante ao estudo de outros animais aquáticos, relacionando os sinais fisiológicos com comportamentos exploratório ou sociais.

Introdução

Fundo. Experimentos quantitativos sobre o comportamento animal (por exemplo, escolha forçada, evitar o choque, T-labirinto, etc.) São normalmente utilizados para investigar hipóteses específicas sobre as habilidades sensório-motoras, aprendizagem e formação da memória. No entanto, estas experiências restritivas perder muito da riqueza do comportamento natural dos animais e são susceptíveis de resultar em modelos simplistas da base neural subjacente de comportamento. Experimentos em condições mais naturalistas são, portanto, um complemento importante pelo qual podemos explorar mais plenamente um repertório comportamental das espécies. Experiments envolvendo animais circulando livremente deve, porém, enfrentar os desafios técnicos exclusivos, como artefatos de gravação induzida pelo movimento. Ao contrário de respostas evocadas por estímulo, o comportamento exploratório de ocorrência espontânea não pode ser previsto, portanto, sujeitos experimentais têm de ser constantemente monitorados e acompanhados durante um período prolongado de tempo. Questões específicas de investigação can ser melhor abordados por organismos cuidadosamente selecionados e instrumentos técnicos disponíveis. Exemplo, gravação e estimulação técnicas ópticas como sensores cálcio geneticamente codificados ^1.oe optogenética ² foram aplicado com sucesso movendo livremente organismos modelo genéticos ^3-5. Alternativamente, sistemas de telemetria neural miniaturizados pode gravar e estimular livremente mover pequenos animais ^6,7.

Peixe elétrico. Espécies WEF gerar descargas elétricas de órgãos (EODs), que lhes permitem perceber seu entorno imediato ou se comunicar através de distâncias maiores. Padrões temporais de EODS variar em diferentes condições, tais como auto-movimentos, ^8,9 estímulos sensoriais ^10,11 e interações sociais ^12,13. Espécies WEF tipo pulso produzir um trem de pulsos discretos, ao contrário de espécies do tipo de onda para que geram formas de onda quase-senoidal contínua. Em geral, do tipo pulso exposição espécie more taxa de EOD variável em comparação com as espécies do tipo de onda, e as taxas de EOD dos animais refletem intimamente conteúdo da novidade de seu entorno sensoriais ^10,14. Espécies do tipo de pulso pode reduzir imediatamente o intervalo inter-pulso (IPI) dentro de um único ciclo de pulso em resposta a uma perturbação sensorial novel (resposta novidade ^10,11,14). O comportamento elétrico contínuo desses peixes pode ser perturbado por estímulos sensoriais descontrolados de fontes externas, e diferentes tipos de estímulos, tais como vibração, som, eletricidade e luz são conhecidas respostas novidade gatilho. Portanto, devem ser tomadas precauções especiais para bloquear ou atenuar os estímulos sensoriais externos durante uma observação a longo prazo de livre-natação WEF. Deste modo, as alterações na taxa de EOD e trajectórias de movimento podem ser especificamente atribuído ao estímulo apresentado pelo experimentador.

Tanque do aquário e câmara de isolamento. Nós, portanto, colocado várias camadas de materiais absorventes de vibração under um grande tanque do aquário (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m), e cercaram o tanque com um compartimento isolado para bloquear fontes externas de luz, ruídos elétricos, som e fluxo de calor. Taxa EOD depende da temperatura em torno ^15,16, assim a temperatura da água foi estritamente regulada em uma faixa tropical (25 ± 1 º C) por espécies sul-americanas WEF. Construímos um tanque grande e raso (10 cm de profundidade de água) para observar comportamentos exploratórios espaciais da WEF principalmente restritas em duas dimensões (Figura 1A). O tanque foi dividido em uma área central para observar o comportamento espacial e quatro compartimentos de canto para alojar separadamente cada peixe (Figura 1B). Cada compartimento foi construído à prova d'água para impedir a comunicação elétrica entre os indivíduos. O acesso dos animais para a arena central foi controlado a partir do exterior por quatro portões motorizados. Os portões foram colocados entre os compartimentos, e tornaram-se estanque quando fechadaspor nylon asa-nozes. Sem partes metálicas foram usados ​​debaixo d'água desde WEF reagir com sensibilidade para os metais.

Gravação EOD. EODS são gerados de forma estereotipada pela ativação de um único (em Mormyrids) ou múltiplos órgãos elétricos espacialmente distribuídos (em gymnotiforms) ^17,18. Modulações temporais na taxa EOD pode revelar atividades neurais de nível superior, uma vez que o marcapasso medular recebe entradas neurais diretos a partir de regiões mais elevadas do cérebro, como o núcleo prepacemaker diencefálica, que por sua vez recebe projeções axonais do cérebro anterior ^19. No entanto, o momento EOD deve ser cuidadosamente extraído de uma gravação do sinal bruto e não influenciada por distorções induzidas pelo movimento do animal. O campo elétrico gerado por um WEF pode ser aproximado como um dipolo, assim EOD amplitudes de pulso de eletrodos de registro depende das distâncias relativas e orientações entre o animal e os eletrodos ^8,20. Auto-movem de Animaisentos alterar a geometria relativa entre o animal e os eléctrodos, assim, fazer com que os movimentos das amplitudes EOD em diferentes eléctrodos para variar ao longo do tempo de uma forma volátil (ver Figura 2B em junho et al. ^8). Além disso, a auto-movimentos também mudar a forma de ondas EOD gravadas, porque as contribuições relativas de jogo diferente dos órgãos elétricos dependem de suas posições ao longo do comprimento do corpo e suas curvaturas locais introduzida pela cauda flexão. As distorções induzidas pelo movimento nas amplitudes e formas EOD pode levar a medições imprecisas e não confiáveis ​​de tempo EOD. Nós superamos estes problemas espacialmente média de múltiplas formas de onda EOD gravados em diferentes locais, e pela adição de um filtro de extração de envelope para determinar com precisão o momento de uma EOD WEF livre de natação. Além disso, a técnica também mede as amplitudes EOD, que indicam se um animal está em repouso ou em movimento activa com base na mudança da EODamplitudes ao longo do tempo (ver Figuras 2E e 2F). Gravamos sinais diferencialmente amplificados dos pares de eletrodos de gravação para reduzir o ruído de modo comum. Uma vez que os impulsos são gerados EOD em intervalos de tempo irregulares, o evento de séries temporais EOD tem uma taxa de amostragem variável. As séries de tempo EOD pode ser convertido para uma taxa de amostragem constante, por interpolação, se necessário por uma ferramenta analítica de escolha.

A gravação de vídeo. Embora a gravação EOD pode monitorar uma atividade de movimento bruto de um animal, gravação de vídeo permite que medições diretas de posição do corpo de um animal e postura. Near-infrared (NIR) iluminação (λ = 800 ~ 900 nm) permite a observação visual imperturbável de nadar livremente peixe ^21,22, uma vez que WEFs são mais ativos nas trevas e seus olhos não são sensíveis ao espectro NIR ^23,24. A maioria dos sensores de imagem digital (por exemplo, CMOS ou CCD) pode capturar espectro NIR com o wavelength intervalo entre 800-900 nm, após a remoção de uma ligação por infravermelhos (IR), o bloqueio do filtro ^25. Alguns high-end webcams consumidor da classe oferecem alta definição, amplo ângulo de visão e boa sensibilidade de pouca luz, o que pode produzir uma qualidade de imagem comparável ou superior ao nível profissional câmeras IR disponíveis em muito maiores custos. Além disso, algumas webcams consumidor da classe são empacotados com o software de gravação que permite uma duração de gravação estendida através da compressão de vídeo sem perda de qualidade. A maioria das câmeras de nível profissional oferecer sincronização saídas de pulso TTL de tempo ou entradas de pulso TTL gatilho ²⁶ para alinhar o sincronismo entre o vídeo com os sinais digitalizados, mas esse recurso é geralmente ausente em webcams consumidor da classe. No entanto, o tempo entre a gravação de vídeo e um digitalizador de sinal pode ser combinado com precisão por simultaneamente capturando uma IR piscar periodicamente LED com a câmera eo digitador sinal. O tempo inicial e final de pulso de IR pode ser usado ums dois marcadores de calibração de tempo para converter os números de quadro de vídeo para a unidade de tempo digitalizador de sinal e vice-versa.

Iluminação e fundo. Captura de imagens através da água pode ser tecnicamente desafiadora devido aos reflexos de luz na superfície da água. A superfície da água pode atuar como um espelho para refletir uma cena visual acima da água, e as características visuais obscuros subaquático; assim, a cena acima da água deve ser processado inexpressivo para evitar a interferência visual. A fim de imagem de todo o aquário, uma câmera precisa ser colocado diretamente sobre a água, e ele deve ser escondido atrás do teto ao longo de um pequeno buraco de visão para evitar a sua reflexão sobre a superfície da água. Além disso, a superfície da água pode produzir brilhos e iluminação não uniforme, se as fontes de luz são incorretamente projetada. Iluminação indireta pode alcançar brilho uniforme ao longo de todo o aquário apontando as fontes de luz em direção ao teto, de modo que o teto eo wal circundantels pode refletir e difundir os raios de luz antes de atingir a superfície da água. Escolha um iluminador IR que corresponde a uma resposta espectral da câmera (por exemplo, 850 nm de comprimento de onda de pico). O ruído elétrico das fontes de luz podem ser minimizados usando luzes de LED e colocando suas fontes de alimentação de corrente contínua fora da gaiola de Faraday. Coloque um fundo branco por baixo do tanque, uma vez que os peixes contrasta bem em um fundo branco em comprimentos de onda NIR. Da mesma forma, a utilização de mate cor branca sobre as superfícies internas da câmara de isolamento proporciona uma iluminação de fundo uniforme e brilhante.

Monitoramento de vídeo. Depois de uma gravação de vídeo, um algoritmo automatizado de seguimento de imagem podem medir posições e posturas do corpo do animal ao longo do tempo. O rastreamento de vídeo pode ser realizado automaticamente por qualquer software pronto para uso (ou Ponto de Vista Ethovision), ou software programável pelo usuário (OpenCV ou MATLAB Imagem processamento caixa de ferramentas). Como primeiro passo de rastreamento de imagem,uma área de rastreamento válido precisa ser definido pelo desenho de uma forma geométrica para excluir a área externa (mascarando a operação). Em seguida, a imagem de um animal precisa de ser isolado a partir da base, subtraindo uma imagem de fundo a partir de uma imagem que contém o animal. A imagem subtraída é convertido para um formato binário pela aplicação de um limiar de intensidade, de modo a que o baricentro e o eixo de orientação pode ser calculado a partir de operações morfológicas binários. Em gymnotiforms ^27-29 e ^30-32 Mormyrids, a densidade electroreceptor é a mais alta perto da região de cabeça, assim, a posição da cabeça a qualquer momento indica uma localização da maior acuidade sensorial. Os locais da cabeça e da cauda pode ser determinado automaticamente pela aplicação das operações de rotação de imagem e da caixa envolvente. A cabeça ea cauda extremidades podem ser distinguidos um do outro, definindo-os manualmente no primeiro quadro, e por manter o controle de seus locais de comparar dois quadros sucessivos.

Protocolo

Este processo satisfaz os requisitos da Universidade de Ottawa Comité Animal Care. Não há conflito de interesse é declarada. Por favor, consulte a Tabela de Materiais e reagentes para as marcas e modelos de equipamentos e materiais listados abaixo. Matlab e Spike2 scripts personalizados escritos e dados de exemplo são fornecidos no arquivo Suplementar.

1. Tanque do aquário e Isolamento Câmara Setup

1. Anti-v chão ibration. Construir uma superfície anti-vibração (2,1 mx 2,1 m) empilhando almofadas de borracha, isopor acústico, painel de contraplacado marítimo, e almofadas de espuma de poliuretano de baixo para cima (Figura 1A). Lay quatro vigas de madeira (5 cm x 10 cm) no painel de madeira para suportar as extremidades do tanque de aquário.
2. Aquecedor Floor. Coloque um elemento de aquecimento elétrico blindado sobre enchimento de espuma classificados termicamente (ver figura inferior 1D). Cobrir o elemento de aquecimento com um metallic malha de blindagem elétrica.
3. Tanque espacial. Construir um aquário largo e raso (1,8 mx 1,8 mx 30 cm) com 1,3 centímetros de espessura temperado painéis de vidro, estrutura de alumínio em forma de L e silicone aquário grau (ver Figura 1A). Cobrir a parte inferior do tanque com uma grande folha de fundo branco a fornecer alto contraste de imagem (ver Protocolo 3).
4. Divida o tanque do aquário em uma arena central (1,5 m de diâmetro) e quatro compartimentos de canto (ver Figura 1B) através da instalação de paredes (22,5 cm de altura) feita de placas de acrílico (branco fosco, 0,64 cm de espessura).
   1. Dobre quatro placas de acrílico (22,5 cm x 102,7 centímetros) por aplicação de calor para criar quatro seções parede curva, e anexá-los para o fundo do tanque usando calafetar silicone para separar a área central, a partir dos quatro compartimentos de canto. Deixar 20 centímetros espaço entre as secções curvas para a instalação de portão.
   2. Separados compartimentos canto vizinho, instalando quatro paredes duplas wiª 15 centímetros lacunas, que proporcionam isolamento elétrico extra e locais para sensores submarinos, como um hidrofone.
5. Montar quatro portões motorizados, e instalá-los entre os compartimentos de canto e na arena central.
   1. Montar quatro molduras de portas, como mostrado na Figura 1C. Criar seis poços (0,64 cm de profundidade) em cada moldura da porta, inserir as porcas de nylon bolota (rosca diâmetro 0,64 centímetros) e prenda-os com epóxi.
   2. Cortar quatro painéis de porta a partir de folhas de borracha e acrílico, e criar seis furos (0,64 cm de diâmetro) sobre o acrílico e painéis de borracha para o mecanismo de bloqueio. Junte-se ao acrílico e painéis de borracha usando calafetagem silicone.
   3. Instale acrílico dobradiças para juntar os painéis das portas com as molduras de portas.
   4. Monte balançando os braços em servomotores, e instalá-los no topo dos quadros de porta (ver Figura 1C). Faça laços com abraçadeiras para ligar os braços balançando para os painéis das portas.
   5. Posicione as assembléias portão do gaps criado entre as seções de parede curva, e fixá-los usando calafetar silicone.
   6. Conecte todos os servomotores para um controlador de servo, e conectá-lo a uma fonte de energia e um computador através de um cabo de extensão USB ativa. Teste as portas usando o software de controle fornecido com o controlador servo.
   7. Depois do silicone endurece, verifique se há estanqueidade, bloqueando todas as portas com parafusos de nylon e preenchendo um compartimento de cada vez.
6. Câmara de isolamento. Construa uma câmara de isolamento ao redor do aquário e bloquear fontes externas de luz, som e ruído elétrico (ver Figura 1D).
   1. Faça três painéis de parede (2 mx 2 mx 5 cm) e quatro painéis de porta (1,9 mx 0,95 mx 5 cm). Para cada painel, molduras de alumínio juntar (5 cm x 2,5 cm) para criar uma moldura retangular e rebite um painel de plástico corrugado branco na armação de alumínio. Preencha chumaços de fibra de vidro acústico nos painéis, e fechar com um painel de plástico preto corrugado.
   2. Instale três painéis de parede no chão anti-vibração, e instalar dobradiças de piano para se juntar aos quatro painéis das portas em painéis de parede.
   3. Cerque a câmara de isolamento com malhas de alumínio e chão malhas de todos os lados para criar uma gaiola de Faraday.
7. Controle de umidade. Instale um exaustor de baixo ruído (Figura topo 1F) para remover o excesso de umidade build-up de aquecimento. Coloque o exaustor pelo menos 2 m de distância do local de gravação, e instalar um duto de ar entre a câmara de isolamento e do exaustor.
8. Rotineiramente monitorar e manter as condições da água do tanque e os animais.
   1. Manter as condições da água constante a 10 cm de profundidade, a 100 mS / cm de condutividade e pH 7,0 por adição de água ou uma solução estoque de sal (ver Knudsen ³³ para a receita). Adicione um saco de coral esmagado se o pH cai abaixo de 6,5.
   2. Instalar filtros de aquário verticais, que podem operar a partir de águas rasas para a limpeza efins gaseificar (Figura fundo 1F). Desligue os filtros e levá-los para fora da arena central durante as sessões de gravação.
   3. Entregar larvas de farinha ao vivo na parte inferior do tanque, anexando-os em ventosas com elásticos. Evite presas livre flutuação, como blackworms para evitar alimentação descontrolada de presas perdidas durante a gravação.

2. EOD Rastreamento

1. Instalação eletrodos. Montar oito eletrodos de grafite e espaço-los igualmente na parede curvada da arena central.
   1. Obter desenho leads (15 cm de comprimento; Mars tipo carbono 2 milímetros HB) e raspar o revestimento exterior dos leads.
   2. Corte 10 centímetros oito segmentos de cabo coaxial (RG-174), enrole o núcleo do cabo em torno de uma das extremidades das hastes de grafite, e aplicar a tubulação sobre eles para conexão elétrica forte e estável encolher ao calor. Anexar conectores BNC nas extremidades opostas (Figura 2A esquerda).
   3. Posicione os eletrodos na parede gravando, e aplicar finas tiras de fita adesiva sobre a superfície do eletrodo para proteger de silicone. Aplicar calafetar silicone para manter permanentemente os eletrodos, e remover toda a fita antes que os endurece silicone (Figura 2A direita).
2. Construir oito conjuntos de cabos medindo a distância de cada eletrodo para a unidade de amplificador, e corte de cabos coaxiais (RG-54) em comprimentos. Anexar conectores BNC em ambas as extremidades dos cabos.
3. Use os conjuntos de cabos para conectar todos os eletrodos para a unidade de amplificador. Diferencialmente amplificar emparelhando dois 90 º eletrodos orientados (ver Figura 2B), e terra todos os fios de blindagem coaxial, ligando-os para a gaiola de Faraday.
4. Ajustar o ganho do amplificador abaixo do limite de saturação do sinal, e aplica um filtro passa-banda (200 Hz a 5 kHz) para eliminar o ruído. Digitalize os quatro pares de eletrodos de gravação em 40 kS / s.
5. On-lineprocessamento de sinais. As instruções são escritas para o software Spike2, e os ajustes de parâmetros são otimizados para Gymnotus sp. (Veja a Figura 2C para resumo).
   1. Adicionar um DC remover processo (τ = 0,1 seg) a todos os canais de gravação.
   2. Adicionar um processo de retificar a todos os canais de gravações.
   3. Criar um canal virtual, somando todos os quatro canais de gravação.
   4. Extrair um envelope unimodal por pulso EOD adicionando RMS (root-mean squared, ) Processo (τ = 0,25 ms) para o canal virtual, para gerar um único pico por ciclo EOD para determinar inequivocamente o tempo de pulso.
   5. Criar um canal realmark do canal virtual e registrar o tempo e os valores das amplitudes de pico, depois de definir um limite apropriado para capturar todas EOD pulsos without faltando um pulso, evitando falsos positivos.
   6. Monitorar a taxa de EOD instantânea, em tempo real, configurando a opção do canal realmark exibição do canal para um modo de frequência instantânea.
   7. Monitorar o movimento dos peixes em tempo real através da duplicação do canal realmark e definir a opção de exibição para um modo de forma de onda.
   8. Quantificar um nível de atividade dos RMS da amplitude inclinação EOD, criando um canal virtual do canal realmark (período de amostragem de 0,01 seg), e adicionar inclinação (τ = 0,25 ms) e RMS (τ = 0,5 ms) processos.
   9. Exportar o canal realmark no software Spike2 para o formato MATLAB.

3. Rastreamento de Vídeo Sincronizado

1. Criar uma cena de fundo.
   1. Esconder qualquer objeto que lança uma reflexão sobre a superfície da água, cobrindo com filme bancada branco fosco.
   2. Instale um branco foscopainel de plástico corrugado 15 centímetros abaixo do teto para esconder a câmera ea entrada de ar.
   3. Imprimir padrões de grade em uma grande folha de papel em branco para calibrar uma câmera, e colocá-lo debaixo do tanque para fornecer um fundo de alto contraste.
2. Instalar fontes de luz.
   1. Obter IR luzes de LED e, remova fãs internas para reduzir o ruído. Dirija o LED com uma fonte de alimentação DC atual regulada colocado fora da gaiola de Faraday.
   2. Instalar luzes IR para imagens em escuridão, e as luzes LED branco para a condução de um ciclo de luz diurna no peixe teste de LED. Diretos todas as fontes luminosas para o teto para alcançar a iluminação indireta e uniforme (Figura 3A).
   3. Regular o ciclo de luz diurna, conduzindo o branco luzes LED com um interruptor controlado por temporizador (por exemplo, 12 horas on/12 hr off).
3. Instalar uma câmera diretamente acima do aquário.
   1. Obter uma câmera NIR-sensível, ou remover um bloqueio filte IRr por quebra de uma folha fina de vidro colorido na parte de trás do conjunto de lentes. Certifique-se que o ângulo de visão é grande o suficiente para a imagem toda a arena central.
   2. Faça um pequeno furo no meio de visualização do painel de teto, e coloque a câmera diretamente acima do buraco.
   3. Instale um guarda anel branco ao redor da lente se as fontes de luz geram brilhos.
4. Faça uma gravação de vídeo sincronizadas em tempo.
   1. Coloque um IR LED em um dos quatro cantos do tanque para gerar pulsos de sincronização de tempo (1 ms de duração de 10 períodos seg). Adicionar um resistor limitador de carga (1 kW) em série, e dirigir o LED de IR a partir de uma porta de saída digital do hardware digitalizador.
   2. Use um software de gravação de vídeo junto com a câmera, se disponível. Escolha a melhor qualidade de gravação (por exemplo, compressão sem perdas) e as resoluções mais altas suportados.
   3. Inicie a gravação de vídeo imediatamente antes de iniciar a gravação do EOD, e parar a gravação de vídeo imediatamente após a gravação EOD.
   4. Depois da gravação, converter os números de quadro de imagem para a unidade de tempo do digitalizador através da interpolação linear entre o primeiro e os últimos pulsos de luz captados pelo digitalizador de sinal e a gravação vídeo.
5. Rastreamento de imagem automatizado
   As instruções são escritas para a caixa de ferramentas de processamento de imagem MATLAB, e fazer uso de suas funções. Um script MATLAB personalizado é fornecido com este envio para o rastreamento automático de imagem.
   1. Importar vídeo. Importar um arquivo de gravação de vídeo diretamente para o espaço de trabalho MATLAB usando "Videoreader. Ler" função.
   2. Criar uma imagem de fundo composto pela combinação de dois quadros de imagem. Substituir a região de imagem ocupada por um animal com uma imagem desocupado da mesma região da outra moldura (ver Figura 3B).
   3. Especifique uma região de imagem para acompanhar desenhando uma máscara circular ao redor da arena central para excluir a umrea externa (Figura 3B inferior), e multiplicar por uma constante (r _int) para definir um limite mínimo para a diferença de intensidade. Por exemplo, a configuração Rint = 0,85 irá suprimir as flutuações de intensidade de 15% = (1 - r _int) abaixo do fundo.
   4. Subtração de imagem. Subtraia um quadro de imagem (= _k IM) a partir da imagem de fundo (IM = ₀₎ para obter a imagem diferença (= ΔIM _k). Use inteiro sem sinal de precisão numérica para armazenar os valores de intensidade de imagem como inteiros não negativos.
   5. Segmento a imagem através da aplicação de uma diferença de limiar de intensidade determinada a partir da função graythresh. Limpe a imagem binária utilizando a função bwmorph e selecione a maior mancha correspondente a um animal depois de calcular todas as áreas blob utilizando a função regionprops.
   6. Determinar o baricentro e principal orientação axis da maior bolha por aplicação da função regionprops, e rodar a imagem para alinhar o eixo maior com o eixo x. Divida a imagem para a cabeça ea cauda partes no baricentro (top Figura 3D).
   7. Determinar o eixo principal da parte de cabeça, e rodar a imagem inteira para se alinhar com o eixo x (Figura 3D inferior esquerdo). Coloque delimitadoras caixas ao redor da cabeça e partes da cauda paralelo aos seus principais eixos utilizando a função regionprops.
   8. Determine as coordenadas y medianos do blob na esquerda, centro e direita bordas verticais das caixas delimitadoras (pontos verdes na parte inferior Figura 3D), e atribuí-los a cinco pontos característicos (cabeça-ponta, no meio da cabeça, meio-corpo , no meio da cauda, ​​ponta da cauda).
   9. Processe quadros sucessivos após a colheita um quadro de imagem centrada no baricentro do animal determinado a partir de sua estrutura anterior.
   10. Atribuir manualmente a orientação de cabeça para o primeiro quadro, e usar um betwe dot-produtoen os vetores de orientação de dois quadros sucessivos para determinar automaticamente a orientação da cabeça. Inspecione o resultado, e virar manualmente a orientação da cabeça se atribuído incorretamente.
6. Trace uma trajetória animais juntando os cabeça-dicas, e alise usando mediana e filtros médios (n = 3) se ele tem uma aparência nervosa. Sobreponha a trajetória uma imagem de fundo, e interpolar midlines peixes usando os cinco pontos característicos (ver Figura 2E).
7. Calcule a taxa de EOD média em cada momento de captura de imagem por reamostragem a taxa EOD instantânea (100 taxa de amostragem Hz) e média (janela de tempo 0,0625 seg.) Traçar a trajetória em pseudo-cores determinadas a partir da taxa de EOD pareados por vez, e sobrepor uma imagem de fundo (ver Figura 2F) com.

Resultados

Resultados de rastreamento EOD

As formas de onda EOD gravadas em diferentes pares de eletrodos variou em amplitudes e formas como se espera de suas posições originais e orientações (figura superior 2C). A utilização de vários pares de eléctrodos assegurada forte recepção de sinal em todas as posições possíveis e as orientações da FEM no interior do tanque. A forma de onda envelope (Figura inferior 2C, traço verd...

Discussão

Significado das nossas técnicas. Em resumo, o primeiro a descrever a construção de um grande aquário e uma câmara de isolamento para observar comportamentos exploratórios espontâneas produzidas pelo WEF. Em seguida, demonstrou a técnica de gravação e monitoramento da taxa de EOD e os estados de movimento de peixes desenfreada em tempo real usando vários pares de eletrodos. Finalmente, descreveu a técnica de infravermelho gravação de vídeo através da água de forma sincronizada em tempo, eo algor...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
			[Aquarium construction]
Electrically shielded floor heater	ThermoSoft Corp., IL, USA	ThermoTile	www.thermosoft.com
Tempered glass panel	generic		.5 inch thick, used for the aquarium construction
Aquarium grade silicone	generic
Acrylic sheet	generic		.25 inch thick, matt white
Natural rubber sheet	generic		.25 inch thick
Servomotor	HITECHRCD Inc., Korea	HS-325HB, 180deg rotation	www.servocity.com
Servomotor arm mount	HITECHRCD Inc., Korea	56362 Large Spline	www.servocity.com
Servomotor controller (6 chan.)	sparkfun.com	ROB-09664	Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller
Active USB extension cable	C2G	38990	12m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable
Exhaust fan	Nutone	ILFK120	www.homedepot.com
Vertical aquarium filter	Tetra, Germany	Whisper Internal Power Filter - 40i
Crushed coral			Used to increase the pH of the tank water
			[EOD recording setup]
Graphite Electrodes	Staedtler, Germany	Mars Carbon 2-mm type HB	Shave the outer coating
Physiological Amplifier/Filter	Intronix, Canada	2015F
Coaxial Cable	generic	RG174	For electrodes assembly
Coaxial Cable	generic	RG54	For wiring use
BNC jack connector for RG-174	Amphenol Connex	112160	For electrodes assembly
BNC plug connector for RG-54	Amphenol Connex	112116	For wiring use
Signal digitizer hardware	Cambridge Electronic Design, UK	Power MKII 1401
Signal digitizer software	Cambridge Electronic Design, UK	Spike 2. ver 7
			[Visual tracking setup]
White LED light	IKEA, Sweden	DIODER 201.194.18	www.ikea.com
Infrared LED light (850 nm)	Scene Electronics, China	S8100-60-B/C-IR	Remove built-in fan
USB webcam	Logitech Inc., CA, USA	C910	Remove Infrared blocking filter
Motorized camera	Logitech Inc., CA, USA	Quickcam Orbit	Remove Infrared blocking filter
Video recording software	Logitech Inc., CA, USA	Logitech Quickcam Software	Download from www.logitech.com
Matlab	Mathworks, MA, USA	2012a	Image processing toolbox