A lungo termine comportamentale inseguimento di Liberamente Nuoto debolmente elettrico Pesce

Riepilogo

Descriviamo un insieme di tecniche per studiare il comportamento spontaneo di nuotare liberamente pesci debolmente elettrica per un periodo prolungato di tempo, in modo sincrono i misurando temporizzazione di scarico organo elettrico dell'animale, la posizione del corpo e la postura sia preciso e affidabile in un acquario appositamente progettato all'interno di un sensoriale camera di isolamento.

Abstract

Monitoraggio del comportamento a lungo termine in grado di catturare e quantificare comportamenti animali naturali, comprese quelle che si verificano di rado. Comportamenti come l'esplorazione e le interazioni sociali possono essere meglio studiate osservando sfrenato, gli animali si comportano liberamente. Pesci elettrici debolmente (WEF) di visualizzazione esplorativa facilmente osservabili e comportamenti sociali emettendo organo scarica elettrica (EOD). Qui, descriviamo tre tecniche efficaci per misurare in modo sincrono la EOD, posizione del corpo, e la postura di un WEF nuoto libero per un periodo di tempo prolungato. In primo luogo, si descrive la costruzione di un serbatoio sperimentale all'interno di una camera di isolamento progettato per bloccare fonti esterne di stimoli sensoriali come luce, suono e vibrazioni. L'acquario è stato suddiviso per ospitare quattro provini e porte automatiche controllare a distanza l'accesso degli animali per l'arena centrale. In secondo luogo, si descrive un metodo di misurazione di temporizzazione EOD in tempo reale, preciso e affidabile da banche di nuoto WEF. Distorsioni di segnale causate dai movimenti del corpo dell'animale sono corretti da media spaziale e fasi di lavorazione temporali. In terzo luogo, si descrive una configurazione subacquea di imaging nel vicino infrarosso per osservare i comportamenti degli animali notturni imperturbati. Impulsi di luce infrarossa sono stati usati per sincronizzare la temporizzazione tra il video e il segnale fisiologico per una durata di registrazione lunghi. Il nostro software di monitoraggio automatizzato di misura la posizione del corpo dell'animale e la postura in modo affidabile in una scena acquatica. In combinazione, queste tecniche consentono osservazione lungo termine del comportamento spontaneo di nuotare liberamente pesci debolmente elettrica in modo affidabile e preciso. Crediamo che il nostro metodo può essere applicato in modo simile allo studio di altri animali acquatici rapportando loro segnali fisiologici con comportamenti esplorativi o sociali.

Introduzione

Sfondo. Esperienze quantitative sul comportamento animale (ad esempio scelta forzata, shock evitamento, T-labirinto, ecc.) Sono tipicamente utilizzati per studiare ipotesi specifiche riguardanti le abilità senso-motorie, di apprendimento e di formazione della memoria. Tuttavia, questi esperimenti restrittive perdere gran parte della ricchezza del comportamento animale naturale e sono suscettibili di tradursi in modelli semplificate del sottostante basi neurali del comportamento. Esperimenti in condizioni più naturalistiche sono quindi un complemento importante con il quale possiamo esplorare più a fondo un repertorio comportamentale specie. Esperimenti su animali liberi di muoversi, tuttavia, devono affrontare sfide tecniche uniche come artefatti di registrazione indotti dal movimento. A differenza di risposte stimolo-evocato, che si verificano spontaneamente il comportamento esplorativo non può essere previsto; quindi soggetti sperimentali devono essere costantemente monitorati e tracciati per un periodo di tempo prolungato. Domande di ricerca specifiche can essere meglio affrontati da organismi accuratamente selezionati e gli strumenti tecnici disponibili. Ad esempio, la registrazione e la stimolazione tecniche ottiche come sensori di calcio geneticamente codificato ¹ e optogenetics ² sono state applicate con successo per muoversi liberamente organismi modello genetiche ^3-5. In alternativa, sistemi di telemetria neurali miniaturizzati in grado di registrare e stimolare lo spostamento piccoli animali ^6,7 liberamente.

Pesci elettrici. Specie WEF generano scariche elettriche organi (EOD), che consentono loro di percepire le loro immediate vicinanze o di comunicare su distanze maggiori. Pattern temporali di EOD variano in condizioni diverse, come auto-movimenti ^8,9, stimoli sensoriali ^{10,11, 12,13} e le interazioni sociali. Pulse-specie tipo WEF producono un treno di impulsi discreti, a differenza delle specie di onda di tipo che generano forme d'onda quasi-sinusoidale continuo. In generale, di tipo impulsivo specie mostra more tasso variabile EOD rispetto alle specie d'onda di tipo e tassi EOD animali riflettere molto attentamente il contenuto della novità del loro ambiente sensoriali ^10,14. Specie Pulse-tipo possono ridurre immediatamente l'intervallo tra impulsi (IPI) all'interno di un singolo ciclo di impulso in risposta a una perturbazione sensoriale romanzo (risposta novità ^10,11,14). Il comportamento elettrico continuo di questi pesci può essere turbato da stimoli sensoriali incontrollate provenienti da fonti esterne, e diversi tipi di stimoli come vibrazione, suono, luce, e la luce sono noti risposte novità di trigger. Pertanto, speciali precauzioni devono essere adottate per bloccare o attenuare gli stimoli sensoriali esterni durante un'osservazione a lungo termine di nuotare liberamente WEF. In questo modo, variazioni della frequenza EOD e traiettorie di movimento possono essere specificamente attribuiti a stimoli presentati dallo sperimentatore.

Acquario serbatoio e camera di isolamento. Abbiamo quindi messo più strati di materiali ad assorbimento delle vibrazioni under un grande acquario (2,1 mx 2,1 mx 0,3 m), e circondato il serbatoio con un involucro isolante per bloccare le fonti esterne di luce, rumore elettrico, il suono e flusso di calore. Tasso EOD dipende dalla temperatura circostante ^15,16, quindi la temperatura dell'acqua è strettamente regolata in un intervallo tropicale (25 ± 1 ° C) per le specie Sudamericana WEF. Abbiamo costruito un ampio e poco profondo (10 cm Profondità acqua) serbatoio per osservare i comportamenti esplorativi spaziali del WEF principalmente ristrette in due dimensioni (Figura 1A). Il serbatoio è stato ripartito in un'arena centrale di osservare i comportamenti spaziali, e quattro scomparti d'angolo per ospitare separatamente singoli pesci (Figura 1B). Ogni scompartimento è stato costruito a tenuta stagna per impedire la comunicazione elettrica tra gli individui. Accesso animali all'arena centrale è stato controllato dall'esterno da quattro porte motorizzate. I cancelli sono stati collocati tra i compartimenti, e divennero stagna quando è bloccatoda nylon ala-noci. L'assenza di parti metalliche sono stati usati sott'acqua dal WEF reagiscono sensibilmente ai metalli.

Registrazione EOD. EOD vengono generati in maniera stereotipata per l'attivazione di un singolo (in Mormiridi) o più organi elettrici spazialmente distribuiti (in Gymnotiforms) ^17,18. Modulazioni temporali del tasso di EOD possono rivelare attività neurali di livello superiore, dal momento che il pacemaker midollare riceve gli input neurali diretti da regioni cerebrali superiori, come il nucleo prepacemaker diencefalica, che a sua volta riceve le proiezioni assonale dal prosencefalo ^19. Tuttavia, i tempi EOD deve essere accuratamente estratta da una registrazione della forma d'onda prima e non polarizzato da distorsioni indotti dal movimento dell'animale. Il campo elettrico generato da un WEF può essere approssimato come un dipolo; quindi EOD ampiezze di impulso a elettrodi di registrazione dipendono dalle distanze relative e orientamenti tra l'animale e gli elettrodi ^8,20. Self-movem di Animalgenitori cambiano la geometria relativa tra l'animale e gli elettrodi, così spostamenti causano le ampiezze EOD a diversi elettrodi a variare nel tempo in modo volatile (vedere la Figura 2B Giu et al. ^8). Inoltre, l'auto-movimenti cambiano anche la forma delle forme d'onda registrate EOD, perché i contributi relativi da diverso insieme di organi elettrici dipendono dalle loro posizioni lungo la lunghezza del corpo e le loro curvature locali introdotta dalla coda flessione. Le distorsioni indotti dal movimento delle ampiezze e forme EOD possono portare a misure temporanee EOD imprecise e inaffidabili. Abbiamo superato questi problemi spazialmente media di forme d'onda multiple EOD registrate in luoghi diversi, e con l'aggiunta di un filtro di estrazione busta di determinare con precisione la tempistica EOD da un WEF nuotare liberamente. Inoltre, la nostra tecnica misura le ampiezze EOD, che indicano se un animale è a riposo o in movimento attivamente in base alla variazione della EODampiezze nel tempo (vedi figure 2E e 2F). Abbiamo registrato segnali differenziale amplificati dalle coppie di elettrodi di registrazione per ridurre il rumore di modo comune. Poiché gli impulsi EOD vengono generati a intervalli di tempo irregolari, l'evento time-series EOD hanno una frequenza di campionamento variabile. La serie temporale EOD può essere convertito in una frequenza di campionamento costante mediante interpolazione se richiesto da uno strumento analitico di scelta.

La registrazione del video. Sebbene la registrazione EOD può monitorare un'attività movimento lordo di un animale, registrazione video consente misurazioni dirette della posizione del corpo di un animale e la postura. Vicino infrarosso (NIR) illuminazione (λ = 800 ~ 900 nm) consente l'osservazione visiva imperturbabile di nuotare liberamente pesci ^21,22, dal momento che WEFs sono più attivi nelle tenebre ei loro occhi non sono sensibili alle NIR dello spettro ^23,24. La maggior parte dei sensori di immagini digitali (ad esempio, CMOS o CCD) in grado di acquisire spettro NIR con il wavelengtgamma h tra 800-900 nm, dopo aver rimosso una connessione a infrarossi (IR) bloccando il filtro ^25. Alcuni webcam consumer di fascia alta offrono alta definizione, ampio angolo di visualizzazione e una buona sensibilità low-light, che può produrre una qualità d'immagine paragonabile o superiore al livello professionale telecamere IR disponibili a costi molto maggiori. Inoltre, alcune webcam consumer-grade sono in bundle con software di registrazione che permette una durata di registrazione esteso da comprimere il video senza perdita di qualità. La maggior parte delle fotocamere di livello professionale offrono sincronizzazione TTL uscite impulsi di tempo o ingressi impulsi TTL grilletto ²⁶ per allineare i tempi tra il video con i segnali digitalizzati, ma questa caratteristica è generalmente assente in webcam consumer-grade. Tuttavia, i tempi tra una registrazione video e un digitalizzatore segnale può essere abbinato con precisione da concomitanza acquisizione di un IR periodicamente LED lampeggiante con la fotocamera e il digitalizzatore segnale. La sincronizzazione degli impulsi IR iniziale e finale può essere utilizzato uns due marcatori di calibrazione di tempo per convertire i numeri di fotogramma video l'unità di tempo segnale digitizer e viceversa.

Lighting & background. Cattura di immagini attraverso l'acqua può essere tecnicamente impegnativo a causa dei riflessi della luce sulla superficie dell'acqua. La superficie dell'acqua può agire come uno specchio per riflettere una scena visiva sopra l'acqua, e caratteristiche visive oscure subacqueo; quindi la scena di sopra dell'acqua deve essere reso featureless per evitare interferenza visiva. Per l'intera immagine acquario, una telecamera deve essere posizionato direttamente sopra l'acqua, e dovrebbe essere nascosto dietro il soffitto sopra un piccolo foro visualizzazione per impedire la sua riflessione sulla superficie dell'acqua. Inoltre, la superficie dell'acqua può produrre riflessi e illuminazione non uniforme se le sorgenti luminose sono proiettati in modo errato. Illuminazione indiretta può ottenere una luminosità uniforme su tutta acquario puntando le fonti di luce verso il soffitto, in modo tale che il soffitto e il wal circostantels può riflettere e diffondere i raggi di luce prima di raggiungere la superficie dell'acqua. Scegliere un illuminatore IR che corrisponde a una risposta spettrale della fotocamera (ad esempio 850 nm di lunghezza d'onda di picco). Il rumore elettrico dalle fonti di luce può essere minimizzato utilizzando luci a LED e piazzare i loro alimentatori in corrente continua al di fuori della gabbia di Faraday. Posizionare uno sfondo bianco sotto il serbatoio, dal pesce contrasta bene in uno sfondo bianco a lunghezze d'onda NIR. Analogamente, l'uso di colore bianco opaco sulle superfici interne della camera di isolamento fornisce uniforme e luminoso retroilluminazione.

Monitoraggio video. Dopo una registrazione video, un algoritmo di inseguimento automatico immagine può misurare posizioni e posture del corpo dell'animale nel tempo. Il monitoraggio video può essere eseguita automaticamente da una software pronto per l'uso (Viewpoint o Ethovision), o il software programmabile dall'utente (OpenCV o MATLAB Processing Toolbox Image). Come primo passo di inseguimento immagine,un'area inseguimento valido deve essere definito disegnando una forma geometrica di escludere l'area esterna (funzionamento mascheratura). Successivamente, l'immagine di un animale deve essere isolato dal contesto sottraendo un'immagine di sfondo da un'immagine contenente l'animale. L'immagine sottratta viene convertito in un formato binario applicando una soglia di intensità, in modo tale che il baricentro e l'asse di orientamento possono essere calcolate dalle operazioni morfologiche binarie. In Gymnotiforms ^27-29 e ^30-32 Mormiridi, la densità electroreceptor è il più alto vicino alla regione della testa, quindi la posizione della testa in qualsiasi momento, indica una posizione di massima acutezza sensoriale. Le posizioni di testa e di coda possono essere determinate automaticamente applicando le operazioni di rotazione dell'immagine e del riquadro di delimitazione. Le estremità di testa e di coda possono essere distinti l'uno dall'altro da essi definendo manualmente nel primo frame, e tenendo traccia delle rispettive posizioni dal confronto di due quadri successivi.

Protocollo

Questa procedura è conforme ai requisiti della Università di Ottawa Comitato Animal Care. Nessun conflitto di interessi è dichiarato. Si prega di fare riferimento alla Tabella dei Materiali e reagenti per le marche e modelli di attrezzature e materiali elencati di seguito. Sono forniti scritte personalizzate Spike2 e MATLAB script e dati di esempio nel file supplementare.

1. Acquario serbatoio e isolamento Camera Setup

1. Anti-v piano ibration. Costruire una superficie anti-vibrazione (2,1 mx 2,1 m) impilando tamponi in gomma, polistirolo acustico, pannello di compensato marino e cuscinetti in schiuma di poliuretano dal basso verso l'alto (Figura 1A). Lay quattro perni di legno (5 cm x 10 cm) sul pannello compensato per sostenere i bordi della vasca acquario.
2. Riscaldamento a pavimento. Posare un elemento di riscaldamento schermato elettricamente oltre classificato termicamente imbottitura in schiuma (vedi Figura 1D in basso). Coprire l'elemento riscaldante con un metallolic maglia di schermatura elettrica.
3. Serbatoio spaziale. Costruire un ampio e poco profondo acquario (1.8 mx 1.8 mx 30 cm) con 1,3 centimetri di spessore pannelli di vetro temperato, telaio in alluminio a forma di L e silicone acquario-grade (vedere Figura 1A). Coprire la parte inferiore del serbatoio con un grande foglio di sfondo bianco per fornire contrasto elevato per immagini (vedi protocollo 3).
4. Dividere il serbatoio acquario in un'arena centrale (1,5 m di diametro) e quattro scomparti angolari (vedi Figura 1B) da pareti installazione (altezza 22,5 centimetri) fatte di lastre acriliche (opaco bianco, spessore di 0,64 centimetri).
   1. Bend quattro lastre acriliche (22,5 centimetri x 102,7 centimetri) mediante l'applicazione di calore per creare quattro sezioni parete curva, e fissarle al fondo del serbatoio utilizzando mastice siliconico per separare l'arena centrale da quattro vani d'angolo. Lasciare 20 cm di spazio tra i tratti curvi per l'installazione del cancello.
   2. Separa i compartimenti angolo confinanti con l'installazione di quattro doppie pareti wi° 15 centimetri lacune, che forniscono l'isolamento elettrico supplementare e luoghi per sensori sottomarini come un idrofono.
5. Montare quattro cancelli motorizzati, e installarli tra i vani d'angolo e l'arena centrale.
   1. Montare quattro telai come mostrato nella Figura 1C. Creare sei pozzi (0,64 centimetri di profondità) su ogni telaio della porta, incorporare le noci nylon ghianda (filo diametro 0,64 centimetri) e fissarli con resina epossidica.
   2. Tagliate quattro pannelli porta in acrilico e fogli di gomma, e creare sei fori (0,64 centimetri di diametro) sul acrilico e pannelli in gomma per il meccanismo di bloccaggio. Unisciti alla acrilico e pannelli in gomma con silicone sigillante.
   3. Installare acrilico cerniere per unire i pannelli delle porte con le cornici delle porte.
   4. Mount bracci oscillanti sui servomotori e le inserisce sulla parte superiore dei telai (vedere Figura 1C). Effettuare cicli con le fascette per collegare i bracci oscillanti per i pannelli delle porte.
   5. Posizionare le assemblee cancello sulla gaps creato tra le sezioni parete curva, e fissarle con silicone sigillante.
   6. Collegare tutti i servomotori a un controller servo, e collegarlo ad una fonte di alimentazione e un computer tramite un cavo di estensione USB attiva. Testare le porte utilizzando il software di controllo in dotazione con il controller servo.
   7. Dopo indurisce il silicone, verificare la presenza di impermeabilità bloccando tutti i cancelli con le viti in nylon e riempiendo uno scomparto alla volta.
6. Camera di isolamento. Costruire una camera di isolamento per circondare l'acquario e bloccare le fonti esterne di luce, suono e rumore elettrico (vedi Figura 1D).
   1. Fare tre pannelli a muro (2 mx 2 mx 5 centimetri) e quattro pannelli delle portiere (1,9 mx 0,95 mx 5 cm). Per ogni pannello, unire modanature in alluminio (5 centimetri x 2,5 cm) per creare una cornice rettangolare, e rivetto bianco pannello di plastica ondulata sul telaio in alluminio. Riempire Batts vetroresina acustici nei pannelli, e chiudere con un pannello di plastica ondulata nera.
   2. Installare tre pannelli sul pavimento anti-vibrazione, e installare pianoforte cerniere per unire i quattro pannelli porta sui pannelli a parete.
   3. Circondano la camera di isolamento con maglie in alluminio, e la terra maglie su tutti i lati per creare una gabbia di Faraday.
7. Il controllo dell'umidità. Installare una ventola di scarico a bassa rumorosità (Figura 1F in alto) per rimuovere l'eccesso di umidità accumulo da riscaldamento. Posizionare la ventola di scarico di almeno 2 m di distanza dal luogo di registrazione, e installare un condotto d'aria tra la camera di isolamento e la ventola di scarico.
8. Ordinariamente monitorare e mantenere le condizioni dell'acqua della vasca e gli animali.
   1. Mantenere le condizioni dell'acqua costante a 10 cm di profondità, 100 S / cm di conducibilità e pH 7.0 con l'aggiunta di acqua o soluzione salina magazzino (fare riferimento alla Knudsen ³³ per la ricetta). Aggiungere un sacchetto di corallo schiacciato se il pH è inferiore a 6,5.
   2. Installare filtri per acquari verticali che possono funzionare da acque poco profonde per la pulizia eAi fini di aerazione (Figura 1F basso). Staccare i filtri e portarli fuori l'arena centrale durante le sessioni di registrazione.
   3. Invia mealworms vivi sul fondo della vasca allegandoli a ventose con elastici. Evitare di prede free-floating come blackworms per impedire l'alimentazione incontrollata di prede randagi durante la registrazione.

2. EOD inseguimento

1. Installazione elettrodi. Montare otto elettrodi di grafite, e lo spazio in modo uniforme su parete curva dell'arena centrale.
   1. Ottenere disegno cavi (15 centimetri di lunghezza; Mars Carbon tipo 2 mm HB) e radersi il rivestimento esterno dei cavi.
   2. Tagliare otto dieci centimetri segmenti di cavo coassiale (RG-174), avvolgere il nucleo del cavo intorno un'estremità delle barre di grafite, e applicare guaina termoretraibile su di loro per il collegamento elettrico forte e stabile. Fissare i connettori jack BNC alle estremità opposte (figura 2A a sinistra).
   3. Posizionare gli elettrodi sulla parete con nastro adesivo, e applicare sottili strisce di nastro adesivo sulle superfici degli elettrodi per proteggere da silicone. Applicare il silicone sigillante per tenere permanentemente gli elettrodi, e rimuovere tutto il nastro prima che la indurisce in silicone (Figura 2a a destra).
2. Costruire otto gruppi di cavi misurando la distanza da ciascun elettrodo al amplificatore, e taglio cavi coassiali (RG-54) in lunghezze. Attaccare connettori BNC su entrambe le estremità dei cavi.
3. Utilizzare i gruppi di cavi per collegare tutti gli elettrodi per l'amplificatore. Differenziale amplifica abbinando due 90 ° elettrodi orientati (vedi Figura 2B), e la terra tutti i fili di schermatura coassiali collegandoli alla gabbia di Faraday.
4. Impostare il guadagno dell'amplificatore di sotto del limite di saturazione del segnale, e applicare un filtro passa-banda (200 Hz-5 kHz) per rimuovere il rumore. Digitalizzare le quattro coppie di elettrodi di registrazione a 40 kS / sec.
5. Onlineelaborazione del segnale. Le istruzioni sono scritte per il software Spike2, e le impostazioni dei parametri sono ottimizzate per gimnoto sp. (Vedi Figura 2C per sintesi).
   1. Aggiungere un DC rimuovere processo (τ = 0.1 sec) per tutti i canali di registrazione.
   2. Aggiungere un processo di rettificare a tutti i canali registrazioni.
   3. Creare un canale virtuale sommando tutti e quattro i canali di registrazione.
   4. Estrarre una busta unimodale per EOD impulso con l'aggiunta di RMS (root-mean-squared, ) Processo (τ = 0,25 msec) al canale virtuale, per generare un singolo picco per ciclo EOD per determinare in modo univoco la sincronizzazione degli impulsi.
   5. Creare un canale realmark dal canale virtuale e registrare il tempo ei valori delle ampiezze di picco, dopo aver impostato una soglia appropriata per catturare tutta EOD impulsi wiThout manca un impulso, evitando i falsi positivi.
   6. Monitorare il tasso di EOD istantanea in tempo reale impostando l'opzione di visualizzazione del canale di realmark ad una modalità di frequenza istantanea.
   7. Monitorare il movimento del pesce in tempo reale duplicando il canale realmark, e impostare l'opzione di visualizzazione in una modalità forma d'onda.
   8. Quantificare un livello di attività dai RMS di ampiezza versante EOD creando un canale virtuale dal canale realmark (0.01 sec periodo di campionamento), e aggiungere pendenza (τ = 0.25 msec) e RMS (τ = 0.5 msec) processi.
   9. Esportare il canale realmark nel software Spike2 al formato MATLAB.

3. Sincronizzata Monitoraggio Video

1. Creare una scena di sfondo.
   1. Nascondere qualsiasi oggetto che getta una riflessione sulla superficie dell'acqua coprendo con pellicola opaca controsoffitto bianco.
   2. Installare un bianco opacopannello di plastica ondulata 15 centimetri sotto il soffitto per nascondere la telecamera e lo sfiato.
   3. Stampa modelli di griglia su un grande foglio di carta bianca per calibrare una macchina fotografica, e posarlo sotto il serbatoio per fornire uno sfondo ad alto contrasto.
2. Installare fonti di luce.
   1. Ottenere IR LED luci e rimuovere i fan built-in per ridurre il rumore. Guidare il led con alimentazione corrente continua regolata collocato al di fuori della gabbia di Faraday.
   2. Installare IR LED si illumina per l'imaging nelle tenebre, e di luci bianche a LED per la guida di un ciclo di luce diurna nel pesce di prova. Scalo tutte le sorgenti luminose verso il soffitto per ottenere l'illuminazione indiretta e uniforme (Figura 3A).
   3. Regolare il ciclo di luce diurna guidando il LED bianco con un timer controllato (ad esempio 12 ore on/12 ore off).
3. Installare una telecamera direttamente sopra l'acquario.
   1. Ottenere una telecamera NIR-sensibili, o rimuovere un filte blocco IRr rompendo un sottile foglio di vetro colorato sul retro del gruppo ottico. Assicurarsi che l'angolo di visione è sufficientemente ampia per l'immagine tutta l'arena centrale.
   2. Fai un piccolo foro di osservazione nel centro del pannello del soffitto, e posizionare la telecamera direttamente sopra il foro.
   3. Installare una guardia anello bianco intorno alla lente se le sorgenti luminose generano riflessi.
4. Effettuare una registrazione video sincronizzato.
   1. Inserire un IR LED in uno dei quattro angoli del serbatoio per generare impulsi di sincronizzazione di tempo (1 durata msec, 10 d'epoca sec). Aggiungere un resistore limitatore di carico (1 k) in serie, e guidare il LED IR da una porta di uscita digitale del digitalizzatore hardware.
   2. Utilizzare il software di registrazione video in dotazione con la fotocamera, se disponibile. Selezionare la più alta qualità di registrazione (ad esempio la compressione lossless) e le più alte risoluzioni supportate.
   3. Avviare la registrazione video immediatamente prima di iniziare la registrazione EOD, e fermare la immediata registrazione videodiatamente dopo la registrazione EOD.
   4. Dopo la registrazione, convertire i numeri di frame di immagine per l'unità di tempo digitalizzatore interpolando linearmente tra il primo e l'ultimo impulsi luminosi catturati dal digitalizzatore segnale e la registrazione video.
5. Monitoraggio automatica delle immagini
   Le istruzioni sono scritte per l'elaborazione delle immagini MATLAB toolbox, e fare uso delle sue funzioni. Uno script MATLAB personalizzato è dotato di questo mezzo per il monitoraggio automatizzato di immagine.
   1. Importare video. Importare un file di registrazione video direttamente nell'area di lavoro MATLAB con "Videoreader. Leggere" la funzione.
   2. Creare un'immagine di sfondo composta dalla combinazione di due fotogrammi dell'immagine. Sostituire l'area di immagine occupata da un animale con un'immagine non occupata della stessa regione da un altro frame (vedere Figura 3B).
   3. Specificare un'area di immagine per tenere traccia disegnando una maschera circolare intorno alla scena centrale di escludere l'unarea all'esterno (Figura 3B basso), e moltiplicare per una costante (r _int) di fissare una soglia minima per la differenza di intensità. Ad esempio, impostando tampa = 0.85 saranno sopprimere le fluttuazioni di intensità del 15% = (1 - r _int) sotto lo sfondo.
   4. Sottrazione Immagine. Sottrarre una cornice immagine (= _k IM) dalla immagine di sfondo (IM = ₀₎ per ottenere l'immagine differenza (= ΔIM _k). Utilizzare intero senza segno precisione numerica per memorizzare i valori di intensità di immagine come numeri interi non negativi.
   5. Segmento l'immagine differenza applicando una soglia di intensità determinata dalla funzione graythresh. Pulire l'immagine binaria utilizzando la funzione bwmorph e selezionare il più grande blob corrispondente ad un animale dopo aver calcolato tutte le aree blob utilizzando la funzione regionprops.
   6. Determinare il baricentro e l'orientamento principale di unxis del grande blob applicando la funzione regionprops, e ruotare l'immagine per allineare l'asse maggiore con l'asse x. Dividere l'immagine per le parti di testa e di coda del baricentro (top Figura 3D).
   7. Determinare l'asse maggiore della parte di testa, e ruotare l'intera immagine di allinearsi con l'asse x (Figura 3D in basso a sinistra). Montare delimitazione box intorno alla testa e le parti posteriori parallele al loro assi principali utilizzando la funzione regionprops.
   8. Determinare i mediani coordinate y del blob a sinistra, centro e bordi verticali destra delle caselle di delimitazione (punti verdi in fondo la figura in 3D), e assegnarli a cinque punti caratteristici (testa-punta, metà testa, metà corpo , mid-coda, punta della coda).
   9. Elaborare fotogrammi successivi dopo il ritaglio una cornice immagine centrata al baricentro dell'animale determinata dal suo fotogramma precedente.
   10. Assegnare manualmente l'orientamento della testa per il primo fotogramma, e utilizzare un betwe dot-prodottoen i vettori di orientamento di due fotogrammi successivi per determinare automaticamente l'orientamento della testa. Controllare il risultato, e capovolgere manualmente l'orientamento della testa se assegnato in modo errato.
6. Tracciare una traiettoria animale unendo i testa-punte, e liscio con mediana e filtri medi (n = 3) se ha un aspetto nervoso. Sovrapporre la traiettoria con un'immagine di sfondo, e interpolare linee mediane di pesce con i cinque punti caratteristici (vedi Figura 2E).
7. Calcolare il tasso medio EOD ad ogni immagine tempo di acquisizione da parte ricampionamento il tasso EOD istantanea (100 Hz frequenza di campionamento) e media (finestra di tempo 0,0625 sec). Tracciare la traiettoria in pseudo-colori determinate dal tasso EOD-time abbinati, e sovrapporre un'immagine di sfondo (vedi Figura 2F) con.

Risultati

Monitoraggio dei risultati EOD

Le forme d'onda EOD registrate da diverse coppie di elettrodi varia in ampiezze e forme come previsto dalle loro posizioni uniche e orientamenti (Figura 2C alto). L'uso di più coppie di elettrodi assicurata forte ricezione del segnale a tutte le possibili posizioni e orientamenti del WEF all'interno del serbatoio. La forma d'onda busta (Figura 2C sotto, tracce verde) conteneva sempre un unico picco per ciclo EOD, ...

Discussione

Importanza delle nostre tecniche. In sintesi, abbiamo prima descritto la costruzione di un grande acquario e una camera di isolamento per osservare i comportamenti esplorativi spontanee prodotte dal WEF. Successivamente, abbiamo dimostrato la tecnica di registrazione e il monitoraggio del tasso di EOD e gli stati di movimento dal pesce sfrenato in tempo reale utilizzando più coppie di elettrodi. Infine, abbiamo descritto la tecnica dell'infrarosso registrazione video attraverso l'acqua in modo sincroni...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
			[Aquarium construction]
Electrically shielded floor heater	ThermoSoft Corp., IL, USA	ThermoTile	www.thermosoft.com
Tempered glass panel	generic		.5 inch thick, used for the aquarium construction
Aquarium grade silicone	generic
Acrylic sheet	generic		.25 inch thick, matt white
Natural rubber sheet	generic		.25 inch thick
Servomotor	HITECHRCD Inc., Korea	HS-325HB, 180deg rotation	www.servocity.com
Servomotor arm mount	HITECHRCD Inc., Korea	56362 Large Spline	www.servocity.com
Servomotor controller (6 chan.)	sparkfun.com	ROB-09664	Micro Maestro 6-channel USB Servo Controller
Active USB extension cable	C2G	38990	12m USB 2.0 A Male to A Female 4-Port Active Extension Cable
Exhaust fan	Nutone	ILFK120	www.homedepot.com
Vertical aquarium filter	Tetra, Germany	Whisper Internal Power Filter - 40i
Crushed coral			Used to increase the pH of the tank water
			[EOD recording setup]
Graphite Electrodes	Staedtler, Germany	Mars Carbon 2-mm type HB	Shave the outer coating
Physiological Amplifier/Filter	Intronix, Canada	2015F
Coaxial Cable	generic	RG174	For electrodes assembly
Coaxial Cable	generic	RG54	For wiring use
BNC jack connector for RG-174	Amphenol Connex	112160	For electrodes assembly
BNC plug connector for RG-54	Amphenol Connex	112116	For wiring use
Signal digitizer hardware	Cambridge Electronic Design, UK	Power MKII 1401
Signal digitizer software	Cambridge Electronic Design, UK	Spike 2. ver 7
			[Visual tracking setup]
White LED light	IKEA, Sweden	DIODER 201.194.18	www.ikea.com
Infrared LED light (850 nm)	Scene Electronics, China	S8100-60-B/C-IR	Remove built-in fan
USB webcam	Logitech Inc., CA, USA	C910	Remove Infrared blocking filter
Motorized camera	Logitech Inc., CA, USA	Quickcam Orbit	Remove Infrared blocking filter
Video recording software	Logitech Inc., CA, USA	Logitech Quickcam Software	Download from www.logitech.com
Matlab	Mathworks, MA, USA	2012a	Image processing toolbox