Imágenes de células lesión de la membrana y procesos subcelulares implicadas en la reparación

Resumen

El proceso de las células de curación heridas implica el tráfico de proteínas específicas y los compartimentos subcelulares al sitio de la lesión de la membrana celular. Este protocolo describe ensayos para controlar estos procesos.

Resumen

La capacidad de las células para curar heridas es un proceso celular fundamental, pero los mecanismos celulares y moleculares implicados en las células curativas heridos son poco conocidos. Aquí se describen ensayos para controlar la capacidad y la cinética de la curación de las células cultivadas después de una lesión localizada. El primer protocolo describe un método de punto final a base de evaluar simultáneamente la capacidad de reparación de la membrana celular de cientos de células. El segundo protocolo describe un enfoque de formación de imágenes en tiempo real para controlar la cinética de la reparación de la membrana celular en las células individuales después de una lesión localizada con un láser pulsado. Como las células curativas heridos implica el tráfico de proteínas específicas y compartimentos subcelulares a la zona de la lesión, el tercer protocolo describe el uso de la aproximación al punto final más arriba basado para evaluar el tráfico de uno de esos eventos (exocitosis lisosomales) en cientos de células dañadas de forma simultánea y el último protocolo describe el uso de lesión láser pulsado junto con micros TIRFcopia para monitorear la dinámica de los compartimentos subcelulares individuales en las células dañadas en alta resolución espacial y temporal. Si bien los protocolos siguientes describen la utilización de estos enfoques para estudiar la relación entre la reparación de la membrana celular y exocitosis lisosomal en las células musculares cultivadas, que se pueden aplicar como tal para cualquier otra célula en cultivo adherente y compartimento subcelular de elección.

Introducción

La membrana de la célula mantiene la integridad de las células, proporcionando una barrera entre la célula y el medio ambiente extracelular. Un estímulo químico, eléctrico o mecánico que excede el umbral fisiológico normal, así como la presencia de los patógenos invasores puede cada resultado de lesiones a la membrana celular y desencadenar una respuesta celular posterior para reparar esta lesión. Para sobrevivir a estas lesiones a la membrana celular, las células poseen un mecanismo eficiente para la reparación. Este mecanismo es dependiente de calcio e implica el tráfico intracelular de proteínas como anexinas y MG53, entre otros, así como los compartimentos subcelulares tales como endosomas, lisosomas, vesículas de Golgi y mitocondrias derivadas de la membrana de la célula lesionada ^1-7. Sin embargo, los detalles de la secuencia de eventos moleculares y subcelulares involucrados en la reparación de la membrana celular dañada sigue siendo poco conocida.

Respuesta de reparación de la célula se puede segregar en el oídomente y las respuestas tardías. Las primeras respuestas, que se producen dentro de segundos a minutos escala de tiempo, son tremendamente importante en la determinación de la naturaleza de las respuestas tardías que conducen a la reparación celular éxito o muerte celular. Ensayos de punto final basado en el análisis bioquímico y celular a granel han ayudado a establecer la participación de los procesos moleculares y celulares de la reparación. Pero, debido a la heterogeneidad y la rapidez de respuesta de reparación celular, ensayos de punto final no proporcionan los detalles cinéticos y espaciales de la secuencia de eventos que conducen a reparar. Los enfoques que permitan lesión controlada de la membrana celular y permiten el seguimiento de la reparación de la membrana celular y subcelular respuestas asociadas a una alta resolución espacial y temporal son ideales para este tipo de estudios. En este caso, se han presentado este tipo de enfoques. Dos de los protocolos describen enfoques para controlar la cinética en tiempo real de reparación de la membrana celular y las respuestas subcelulares asociados con el proceso de reparación en células vivas siguientes inj láserury. Como complemento a estos ensayos basados ​​en imágenes de células vivas, los ensayos de punto final también se han descrito que proporcionan una medida basada en la población para la reparación de la vigilancia de las células individuales y las respuestas asociadas subcelulares. Para demostrar su utilidad estos enfoques se han utilizado para vigilar el tráfico y exocitosis de lisosomas en respuesta a la lesión de la membrana celular.

Protocolo

1. Imágenes de células de reparación de membrana Usando granel (grano de cristal) Herir

Este protocolo permite el marcado por separado las células dañadas y las que no cicatrizan. La cuantificación de estas poblaciones de células requiere el uso de tres condiciones: 1. Prueba (C1) - Las células se dejan reparar en presencia de Ca ^{2 +,} 2. Control de 1 (sin lesión C2) - Las células se incubaron en presencia de Ca ^{2 +,} pero no heridos, y 3. Control 2 (sin reparación C3) - las células se les permite reparar en ausencia de Ca ^{2 +.}

1. Se cultivan las células a> 50% de confluencia en tres cubreobjetos estériles y lavar C1 y C2 dos veces con CIM a 37 ° C y C3 con PBS a 37 ° C y cubreobjetos de transferencia de juntas tóricas de silicona.
2. Añadir 100 l de solución de dextrano FITC precalentado en CIM en C1 y C2 o en PBS en C3.
3. Herir membrana plasmática en C1 y C3 por suaves ondulaciones 40 mg de perlas de vidrio sobre el portaobjetos a temperatura ambiente por cubreobjetos inclinación manualmente hacia atrás ysucesivamente 6-8 veces en un ángulo de 30 °.
   Nota: Para las lesiones leves, asegúrese de que las cuentas de vidrio se distribuyen de manera uniforme, minimizando las lesiones repetidas. Para mejorar la reproducibilidad de lesiones entre las muestras, realización simultánea de la lesiones de perlas de vidrio de las diferentes muestras que se van a comparar.
4. Evitar más de rodadura de cuentas, transferir todos los cubreobjetos a una incubadora a 37 ° C en ambiente de CO ₂ y permitir la reparación de proceder durante 5 min.
5. Sin dejar que las bolas rueden, retire las cuentas de vidrio y FITC dextrano por lavado con CIM (C1 y C2) o PBS (C3) a 37 ° C.
6. Lugar cubreobjetos de vuelta en el ring y añadir 100 l de solución precalentada lisina fixable dextrano TRITC en CIM en C1 y C2 o en PBS en C3.
7. Incubar a 37 ° C durante 5 min a temperatura ambiente de CO _2.
8. Lavar dos veces con cubreobjetos precalentado CIM y fijar con 4% PFA durante 10 minutos a temperatura ambiente.
9. Lavar dos veces con PBS y se incuba durante 2 min a temperatura ambiente en el reactivo de Hoechst.
10. Lave samples dos veces con PBS, montar en una diapositiva utilizando medio de montaje y células de imagen usando un microscopio de epifluorescencia.
11. Usar células de C2 para determinar la intensidad de la tinción de fondo rojo y verde, y utilizar este valor para el umbral de los canales rojo y verde para todas las muestras (C1-C3).
12. Puntuación número total de células que son a) verde (lesionado y reparado) yb) de color rojo o rojo y verde (lesionado, pero no pudieron reparar) en muestras C1 y C3.
13. Conde> 100 células verdes para cada condición y expresar la fracción de células que han fallado para reparar como un porcentaje de todas las células lesionadas (verde y rojo).

2. Imágenes en vivo de la cinética de la reparación de la membrana de la célula después de la lesión con láser

1. Lavar las células con precalentado CIM y luego poner el cubreobjetos en CIM con el tinte FM.
2. Coloque el cubreobjetos en un soporte en la incubadora de etapa superior se mantiene a 37 ° C.
3. Seleccione una región de 1-2 mm ² de la membrana celular, y para irradiar <; 10 mseg con el láser pulsado. Atenuar la potencia del láser a través del software para el 40-50% de la potencia de pico. Potencia óptima permite lesión consistente, pero no letal y esto debe ser determinado por ensayo y error para cada instrumento individual y célula de la línea que se utiliza.
4. Para supervisar la reparación, la imagen cada 10 segundos en epifluorescencia y campo claro, comenzando antes de la lesión y continuar durante 3-5 min después de una lesión.
   Nota: Para control de reparación, repita los pasos 2.1 a 2.4 con las células dañadas en PBS que contenía colorante FM.
5. Para cuantificar la cinética de reparación, medir FM celular colorante fluorescente y trazar el cambio en la intensidad (ΔF/F0) durante el curso de formación de imágenes. Estos datos deben promediarse durante más de 10 células de cada condición y se representa como promedio o el valor de la celda individual, según sea necesario.

3. Imaging granel (grano de cristal) lesión inducida Lysosomal Exocitosis

Las muestras incluyen siguientes células cultivadas hasta> 50%confluencia: 1. Test (C1) - Las células se permiten reparar en la presencia de Ca ^{2 +,} 2. Control de 1 (C2; Ninguna lesión) - Las células no lesionadas ni incubadas con el anticuerpo primario, y 3. Control 2 (C3; Ninguna reparación) - Las células se permiten reparar en ausencia de Ca ^{2 +.}

1. Lave cubreobjetos C1 y C2 dos veces con CIM a 37 ° C y C3 con PBS a 37 º C y transferirlos en silicona las juntas tóricas.
2. Añadir 100 l de precalentado lisina fixable dextrano TRITC en CIM en C1 y C2 y C3 en PBS.
3. Herir membrana plasmática en C1 y C3 como en el paso 1.3.
4. Evitar más de rodadura de cuentas, transferir todos los cubreobjetos a una incubadora a 37 ° C en ambiente de CO ₂ y permitir la reparación de proceder durante 5 min.
5. Retire las perlas de vidrio y TRITC dextrano mediante el lavado de los cubreobjetos en medio de crecimiento frío, asegurando de nuevo sin rodadura de las perlas de vidrio en las células.
6. Enjuagar los portaobjetos dos veces con medio de crecimiento frío y la transferencia a las juntas tóricas.
7. Para C1 y C3, Añadir 100 ml de rata anticuerpo anti ratón LAMP1 en medio de crecimiento completo de frío y añadir el, medio de crecimiento completo fría para C2.
8. Para permitir la unión del anticuerpo cubreobjetos se incuba durante 30 min a 4 ° C.
9. Lavar los cubreobjetos tres veces con CIM frío y corregir todos los cubreobjetos con PFA al 4% durante 10 min a TA y luego enjuague 3x con la CIM.
10. Incubar todos los cubreobjetos en 100 l de solución de bloqueo durante 15 min a TA
11. Incubar todos los cubreobjetos en 100 l Alexa Fluor 488 anticuerpo anti rata durante 15 min a 4 ° C.
12. Lavar dos veces con PBS y se incuba durante 2 min a RT en Hoechst.
13. Lavar las células dos veces con PBS, montar en una diapositiva utilizando medio de montaje y la imagen usando un microscopio de epifluorescencia.
14. El uso de imágenes de células C2, determinar la tinción inespecífica de fondo en el rojo (dextrano TRITC) y verde (Alexa Fluor 488 anticuerpos) canales y utilizar estos valores de tinción de fondo con el umbral de los canales rojo y verde para todas las muestras (C1-C3).
15. Utilice los> 100 marcados con rojo células de C1 y C3 para medir la intensidad de la tinción LÁMPARA1 (verde) en células lesionadas. Para un experimento exitoso la tinción LÁMPARA1 en las células de C3 será significativamente menor que en las células de C1.

4. Imágenes en vivo del daño celular membrana Se activa el Tráfico subcelular

1. Fluorescently etiquetar el compartimento de interés transfectando reportero apropiado (por ejemplo CD63-GFP para lisosomas ⁸⁾ o mediante el uso de colorantes fluorescentes ^9.
2. Para lisosomas etiquetado con colorante fluorescente, incubar las células cultivadas a 50% de confluencia en medio de cultivo conteniendo FITC-dextrano
3. Permitir dextrano a ser endocitosis durante 2 horas (o más largo, según sea necesario para el etiquetado suficiente endosomal con dextrano por la línea celular de interés) en la incubadora de CO _2.
4. Lavar las células con medio de cultivo y se incuban precalentadas en ella durante 2 horas en una incubadora de _CO2 para permitir a todosendocitosis dextrano a acumularse en el lisosoma.
5. Antes de imágenes, enjuague el cubreobjetos precalentado CIM y montar en un soporte de portaobjetos en la incubadora de etapa superior a 37 ° C.
6. Realizar campo amplio (para el movimiento a lo largo de la célula) o TIRF (movimiento en la superficie celular y la exocitosis) de imágenes - las células que no tienen abarrotadas FITC dextrano lisosomas marcados son ideales para obtener imágenes de los movimientos y la exocitosis de los lisosomas individuales.
7. Alineación de los láseres TIRF para microscopio de imagen: Use 60X o 100X objetivo con> 1,45 NA. Configure el ángulo de incidencia del rayo láser TIRF utilizando el enfoque del fabricante.
8. Lesionar la membrana celular mediante la irradiación de una región pequeña (1-2 mm ²⁾ de <100 ms, con el láser pulsado a 40-50% de atenuación.
9. Para monitorear la respuesta del lisosoma a la celda de lesiones, celdas de imagen a los 4-6 cuadros / seg durante al menos 2 minutos o más dependiendo de la dinámica de la exocitosis en las células de interés.

Resultados

Protocolos que se describen aquí para obtener imágenes de células individuales son para controlar la capacidad y la cinética de la reparación de la membrana celular (Protocolos 1 y 2) y el tráfico subcelular y fusión de lisosomas durante la reparación (Protocolos 3 y 4).

Protocolo 1 muestra un ensayo mayor que permite el marcado todas las células dañadas y la identificación de las células dañadas que no pudieron reparar. Los resultados en la Figura 1 muestran qu...

Discusión

Lesión de la membrana celular in vivo se produce debido a una variedad de factores de estrés fisiológicos y se han desarrollado varios enfoques experimentales para imitar éstos. Estos incluyen hiriendo membrana celular de las células adherentes al quitarlas de la antena o haciendo pasar a través de un estrecho orificio ^9,10 jeringa. Después de este tipo de lesiones se curan las células en suspensión y no adherido a la matriz extracelular como lo hacen normalmente en el tejido. Y otros, tales...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma	H1387	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
HEPES	Fisher	BP410	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
FITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1820	2 mg/ml in CIM or PBS
Glass beads	Sigma	G8772
TRITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1818	2 mg/ml in CIM or PBS
PFA 16%	EMS	15710	4% in PBS
Hoechst	Invitrogen	H3570	1/10 000 in PBS
FM dye	Invitrogen	T3163	1 µg/µl in CIM or PBS
FITC dextran	Sigma	FD40S	2 mg/ml in growth medium
LAMP1	Santa Cruz	sc-19992	1/300 in growth medium
Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG	Invitrogen	A21470	1/500 in blocking solution
Mounting media	Dako	S3023
Coverslips	Fisher	12-545-86
Glass bottom petridish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Silicone O ring	Bellco	1943-33315
Coverslip holder	Bellco	1943-11111
Invitrogen	A-7816
DMEM	VWR	12001-566
FBS	VWR	MP1400-500H	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Penicillin/Sreptomycin	VWR	12001-350	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Chicken serum	Sigma	C5405	5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining
PBS (Ca2+ and Mg2+ free)	VWR	12001-664
Epifluorescence microscope	Olympus America, PA	IX81
TIRF illuminator	Olympus America, PA	Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
Epifluorescence illuminator	Sutter Instruments, Novato CA	Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD Camera	Photometrics, Tucson, AZ	Evolve 512 EMCCD
Image acquisition and anaysis software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Slidebook 5
Pulsed laser	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Ablate (3iL13)
Stage top incubator	Tokaihit, Japan	INUBG2ASFP-ZILCS