イメージング細胞膜の損傷および修復に関与する細胞内プロセス

要約

治癒損傷した細胞の処理は細胞膜の損傷部位に特異的なタンパク質および細胞内コンパートメントの輸送を伴う。このプロトコルは、これらのプロセスを監視するためのアッセイを説明しています。

要約

癒すために傷ついた細胞の能力は、基本的な細胞プロセスですが、治癒損傷細胞に関与する細胞および分子メカニズムはほとんどわかっていない。ここでアッセイは、局所的な損傷後の培養細胞の治癒能力および速度を監視するために記載されている。第一のプロトコルは、同時に数百の細胞の細胞膜修復能を評価するためのエンドポイントベースの手法を記載している。第二のプロトコルは、パルスレーザによる局所的な損傷後の個々の細胞における細胞膜修復の動態をモニ​​ターするリアルタイム画像化のアプローチを記載する。治癒負傷した細胞が損傷部位に特異的なタンパク質と細胞内コンパートメントの輸送を伴うように、第3のプロトコルが同時に負傷した細胞の何百ものそのような人身売買のイベント（リソソームエキソサイトーシス）を評価するには、上記のエンドポイントベースのアプローチを使用し、最後のプロトコルについて説明TIRFのミクロスと共にパルスレーザー傷害の使用を記載高い空間分解能と時間分解能で負傷した細胞では、個々の細胞内コンパートメントのダイナミクスを監視するためのコピー。ここプロトコルは、培養筋細胞における細胞膜の修復およびリソソームのエキソサイトーシスの間のリンクを調べるため、これらのアプローチの使用を記載しているが、それらは、他の接着性の培養細胞と、選択した細胞内コンパートメントにそのまま適用することができる。

概要

細胞膜は、細胞と細胞外環境との間の障壁を提供することで、細胞の完全性を維持します。正常な生理的しきい値だけでなく、侵入する病原体の存在を超えて、化学的、電気的、または機械的刺激は、細胞膜への傷害におけるそれぞれの結果とは、この傷害を修復するために、その後の細胞応答を誘発することができます。細胞膜へのこれらの損傷に耐えるために、細胞を修復するための効率的なメカニズムを有する。このメカニズムは、カルシウム依存性であり、他の中のようなアネキシンやMG53のようなタンパク質の細胞内輸送だけでなく、このような怪我を細胞膜^1-7エンドソーム、リソソーム、ゴルジ派生小胞やミトコンドリアなどの細胞内区画を必要とする。しかし、損傷した細胞膜の修復に関与する分子および細胞内イベントのシーケンスの詳細はよくわかっていないままです。

細胞の修復応答は、耳の中に分離され得るLY及び後期応答。分の時間スケールに数秒以内に起こる初期の応答は、成功した細胞修復または細胞死に至る後期応答の性質を決定するのに途方もなく重要である。バルク生化学的および細胞分析に基づいて、エンドポイントアッセイは、修理中の分子や細胞プロセスの関与を確立に貢献している。しかし、原因細胞修復応答の不均一性及び迅速性のために、エンドポイントアッセイは、修理に至る一連の事象の運動および空間の詳細を提供することができない。細胞膜の制御された傷害を有効にして、細胞膜の修復と高い空間分解能と時間分解能で、関連する細胞内応答を監視できるようなアプローチは、理想的には、そのような研究に適しています。ここで、そのようなアプローチが提示されている。プロトコルの二つは、細胞膜修復のリアルタイム動態およびレーザinjの次の生細胞における修復過程に関連付けられている細胞内応答をモニターするためのアプローチを記載ユリィ。これらの生細胞イメージングに基づくアッセイを補完するものとして、エンドポイントアッセイはまた、個々の細胞および関連する細胞内応答のモニタリング修復のための集団ベースの測定を提供するが記載されている。これらのアプローチは、細胞膜の損傷に応答して輸送およびリソソームのエキソサイトーシスをモニターするために使用されているそれらの有用性を実証する。

プロトコル

1。バルクを用いた撮像細胞膜修復（ガラスビーズ）創傷は

このプロトコルは、別々に負傷した細胞や治癒できないものをマークすることができます。 1：細胞のこれらの集団を定量化するには、次の3つの条件を使用する必要があります。試験（C1） -細胞のCa ^{2 +、2}の存在下で修復させる。対照1（無損傷C2） -細胞のCa ^{2 +}の存在下でインキュベートしたが、負傷していない、および3ている。コントロール2（なし修復C3） -細胞をCa ^{2 +}の非存在下で修復することが許可されます。

1. 3無菌カバーガラス上で> 50％コンフルエンスまで細胞を成長させ、シリコンO-リング上で37℃、転送カバーグラスPBSで37℃、およびC3で、CIMで二度C1とC2を洗う。
2. C1とC2またはC3の上のPBS中のCIMにおける予め温めFITCデキストラン溶液100μlを加える。
3. 手動でバックカバースリップを傾けることによって穏やかに室温で、カバースリップ上に40mgのガラスビーズをロールC1およびC3上の形質膜を傷つけると30°の角度で前後6-8回。
   注意：軽度の負傷のために、このように繰り返しの傷害を最小限に抑え、ガラスビーズが均一に分散していることを確認してください。サンプル間の損傷の再現性を向上させるために、同時に比較すべき異なるサンプルのガラスビーズ傷害を行う。
4. ビーズのさらなる圧延を回避し、周囲のCO _2、37℃のインキュベーターにすべてカバースリップを転送し、修繕を5分間進行させる。
5. ビーズが転動させることなく、37℃でCIM（C1及びC2）又はPBS（C3）で洗浄することによりガラスビーズおよびFITCデキストランを除去する
6. 場所は、Oリングに戻ってカバースリップ、c3のC1とC2またはPBS中、CIM内の予め温めリジン固定可能TRITCデキストラン溶液100μlを加える。
7. 周囲CO ₂で5分間37℃でインキュベートする。
8. あらかじめ温めておいたCIMで二度カバース​​リップを洗浄し、室温で10分間、4％PFAで固定します。
9. PBSで2回洗浄し、ヘキスト染料での室温で2分間インキュベートする。
10. ウォッシュSAMPLエス回PBSで、落射蛍光顕微鏡を用いて実装培地および画像セルを用いてスライド上にマウントする。
11. 背景の赤と緑の染色強度を決定し、全ての試料（C1-C3）用の閾値赤と緑のチャンネルにこの値を使用するC2由来の細胞を使用する。
12. A）グリーン（負傷し、修復さ）とb）の赤または赤と緑（負傷者の両方が、が、C1とC3のサンプルで）修復に失敗している細胞の総数を獲得。
13. カウント> 100緑の各条件や負傷者のすべてのセル（緑と赤）のパーセントとして、修復に失敗した細胞の割合を発現している細胞。

2。レーザー損傷後の細胞膜修復の動態のライブイメージング

1. あらかじめ温めておいCIMで細胞を洗浄した後、FM色素で、CIMにカバースリップを置く。
2. 37℃に維持し、ステージトップインキュベーターでホルダーにカバースリップを配置
3. 細胞膜1-2 mm ^2の地域を選択し、のために照射<;パルスレーザーで10ミリ秒。ピーク電力の40〜50％のソフトウェアを介してレーザパワーを減衰させる。最適な電力は、一貫性のことができますが、非致死傷害、これが使用されている個々の楽器や細胞株について、試行錯誤によって決定されなければならない。
4. 損傷前に開始し、エピ蛍光と明視野での修理、画像ごとに10秒を監視し、損傷後3〜5分間続行します。
   注意：修理の制御のために、リピートをPBSで負傷した細胞は、FM色素を含有して2.1から2.4を繰り返します。
5. 修復の動態を定量するために、セルラFM色素の蛍光を測定し、画像化の過程強度（ΔF/F0）の変化をプロットする。このデータは、各条件で10年以上の細胞について平均し、必要に応じて、平均化したり、個々のセルの値としてプロットされるべきである。

3。イメージング·バルク（ガラスビーズ）傷害誘導リソソームエキソサイトーシス

サンプルは、> 50％まで成長し、次の細胞が含まれる合流点：1。試験（C1） -のCa ^{2 +、2}の存在下で修復させた細胞。対照1（C2、ノー損傷） - 細胞怪我もなく、一次抗体とインキュベートし、そして3もない。コントロール2（C;なし修復） - Ca ^{2 +}の非存在下で修復することができた細胞。

1. 洗浄は37℃でPBSを用いて37℃およびC3でCIMで二回C1及びC2をカバースリップシリコーンO-リング上に転送する。
2. C3の上でC1とC2上のCIMにおける予め温めリジン固定可能TRITCデキストランのPBS中に100μlを加える。
3. ステップ1.3のようにC1とC3に、細胞膜を傷つける。
4. ビーズのさらなる圧延を回避し、周囲のCO _2、37℃のインキュベーターにすべてカバースリップを転送し、修繕を5分間進行させる。
5. 再び細胞にガラスビーズのないローリングを確保していない、冷たい増殖培地中でカバーグラスを洗浄することにより、ガラスビーズおよびTRITCデキストランを削除します。
6. 冷たい成長培地で2回カバースリップをすすぎ、Oリングに転送します。
7. C1およびC3へコー​​ルド完全増殖培地中のラット抗マウスLAMP1抗体を100μlを加え、C2に寒さ、完全な増殖培地を追加します。
8. 抗体は4℃で30分間インキュベートしたカバーガラスを結合できるようにするには
9. 冷たいCIMでカバーグラスを3回洗浄し、室温で10分間、4％PFAですべてカバースリップを修正して、CIMで3回すすいでください。
10. RTで15分間溶液を遮断する100μlのすべてカバースリップをインキュベートする
11. 4℃でアレクサフルーア100μlの15分間488抗ラット抗体をすべてカバースリップをインキュベート
12. PBSで2回洗浄し、ヘキストでの室温で2分間インキュベートする。
13. PBSで2回細胞を洗浄、エピ蛍光顕微鏡を用いた実装メディアやイメージを使用して、スライド上にマウントします。
14. C2細胞の画像を用いて、赤色（TRITCデキストラン）で非特異的バックグラウンド染色を決定し、緑（アレクサフルーア488抗体）チャネルおよびスレッシュホールドに全てのサンプル（C1-C3）用の赤と緑のチャネルを、これらのバックグラウンド染色値を使用する。
15. 負傷した細胞中のLAMP1染色（緑）の強度を測定するために、C1とC3から> 100赤の標識された細胞を使用してください。成功した実験にはC3のセル内のランプ1染色はC1からの細胞よりも有意に低くなります。

4。細胞膜損傷のライブイメージングは​​、細胞内の人身売買をトリガ

1. 蛍光標識 （リソソーム⁸用など CD63-GFP）または蛍光色素^9を使用して、適切なレポーターをトランスフェクトすることにより、目的のコンパートメント。
2. 蛍光色素で標識リソソームについては、FITC-デキストランを含有する増殖培地中で50％コンフルエンスまで増殖させた細胞をインキュベート
3. CO ₂インキュベーター中（目的の細胞株によるデキストランとの十分なエンドソーム標識に必要な以上）デキストランは2時間エンドサイトーシスすることができます。
4. 許可するように温めておいた増殖培地で細胞を洗浄して、CO ₂インキュベーター内で2時間、その中に培養するすべてのリソソームに蓄積したデキストランをエンドサイトーシス。
5. イメージングの前に、予め温め、CIM内のカバーガラスを洗浄し、37℃で、ステージトップインキュベーターにカバースリップホルダーに取り付ける
6. （細胞全体に動きのため）広視野またはTIRF（細胞表面およびエキソサイトーシスでの移動）イメージングを実施 - FITCデキストランラベルリソソームが混雑していない細胞は、個々のリソソームの動きとエキソサイトーシスを画像化するために理想的です。
7. イメージング顕微鏡用TIRFレーザーを揃える：使用60Xまたは> 1.45 NAの100X目標を。メーカーのアプローチを用いて入射全反射レーザー光に対する角度を設定します。
8. 40〜50％の減衰でパルスレーザで、<100ミリ秒のための小さい（1-2 mm ^2）で領域を照射することにより、細胞膜を傷つける。
9. 目的の細胞におけるエキソサイトーシスの動態に応じて、少なくとも2分以上4-6フレーム/秒で負傷、画像セルをセルにリソソームの応答をモニターする。

結果

単一細胞イメージングのためにここで説明するプロトコルは、細胞膜修復（プロトコール1及び2）、修復中のリソソームの細胞内輸送および融合（プロトコル3および4）の能力および速度を監視することである。

プロトコル1は、すべての傷ついた細胞をマークし、修復に失敗したものが負傷細胞を同定することができますバルクアッセイを示す。無傷細胞（ 図1A）?...

ディスカッション

インビボでの細胞膜傷害は、これらを模倣するために開発された生理学的ストレスおよびいくつかの実験的アプローチの種々発生する。これらの皿を、それらを掻き落としたり、狭い穴の注射器^9,10を通じて継代することにより接着細胞の細胞膜を傷つけています。このような傷害後の細胞を懸濁液で治癒し、それらが正常組織中でそうであるように、細胞外マトリックスに接...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma	H1387	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
HEPES	Fisher	BP410	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
FITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1820	2 mg/ml in CIM or PBS
Glass beads	Sigma	G8772
TRITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1818	2 mg/ml in CIM or PBS
PFA 16%	EMS	15710	4% in PBS
Hoechst	Invitrogen	H3570	1/10 000 in PBS
FM dye	Invitrogen	T3163	1 µg/µl in CIM or PBS
FITC dextran	Sigma	FD40S	2 mg/ml in growth medium
LAMP1	Santa Cruz	sc-19992	1/300 in growth medium
Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG	Invitrogen	A21470	1/500 in blocking solution
Mounting media	Dako	S3023
Coverslips	Fisher	12-545-86
Glass bottom petridish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Silicone O ring	Bellco	1943-33315
Coverslip holder	Bellco	1943-11111
Invitrogen	A-7816
DMEM	VWR	12001-566
FBS	VWR	MP1400-500H	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Penicillin/Sreptomycin	VWR	12001-350	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Chicken serum	Sigma	C5405	5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining
PBS (Ca2+ and Mg2+ free)	VWR	12001-664
Epifluorescence microscope	Olympus America, PA	IX81
TIRF illuminator	Olympus America, PA	Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
Epifluorescence illuminator	Sutter Instruments, Novato CA	Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD Camera	Photometrics, Tucson, AZ	Evolve 512 EMCCD
Image acquisition and anaysis software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Slidebook 5
Pulsed laser	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Ablate (3iL13)
Stage top incubator	Tokaihit, Japan	INUBG2ASFP-ZILCS