תא ההדמיה ממברנה פגיעה ותהליכי subcellular המעורבים בתיקון

Summary

התהליך של ריפוי תאים נפצעו כרוך בסחר של חלבונים מסוימים ותאי subcellular לאתר של פציעת קרום תא. פרוטוקול זה מתאר מבחני כדי לפקח על תהליכים אלה.

Abstract

היכולת של תאים נפצעו לרפא היא תהליך תאי בסיסי, אך מנגנונים תאיים ומולקולריים המעורבים בתאי ריפוי פצוע הם הבינו היטב. הנה מבחני מתוארים כדי לפקח על היכולת וקינטיקה של ריפוי של תאים בתרבית בעקבות פציעה מקומית. הפרוטוקול הראשון מתאר גישה מבוססת נקודת סיום כדי להעריך את יכולת תיקון קרום תא של מאות תאים בו זמנית. הפרוטוקול השני מתאר גישת הדמיה בזמן אמת כדי לפקח על קינטיקה של תיקון קרום תא בתאים בודדים בעקבות פציעה מקומית עם לייזר פעם. ככל שתאי ריפוי נפצע כרוך בסחר של חלבונים מסוימים ותאי subcellular לאתר של פציעה, הפרוטוקול השלישי מתאר את השימוש בגישה מבוססת נקודת סיום לעיל כדי להעריך אירוע אחד כזה סחר (exocytosis lysosomal) במאות תאים נפצעו בו זמנית והפרוטוקול האחרון מתאר את השימוש של פגיעת לייזר פעם יחד עם מיקרו TIRFעותק כדי לפקח על הדינמיקה של תאי subcellular בודדים בתאים שנפגעו ברזולוציה מרחבית ובזמן גבוה. בעוד הפרוטוקולים כאן מתארים את השימוש בגישות אלה כדי לחקור את הקשר בין תיקון קרום התא וexocytosis lysosomal בתאי שריר בתרבית, הם יכולים להיות מיושמים כאמורים לכל תא אחר חסיד תרבותי ותא subcellular של בחירה.

Introduction

קרום תא שומר על שלמותם של תאים על ידי מתן חיץ בין התא לבין סביבת החוץ תאית. גירוי כימי, חשמלי או מכאני שעולה על הסף הפיזיולוגי הנורמלי, כמו גם נוכחותם של פולשים גורמי מחלה יכול כל תוצאה בפגיעה בקרום התא ולגרום לתגובה תאית לאחר לתקן פגיעה זו. כדי לשרוד פציעות אלה לממברנת התא, תאים בעלי מנגנון יעיל לתיקון. מנגנון זה הוא סידן תלוי וכרוך בסחר תאית של חלבונים כגון annexins וMG53 בין יתר, כמו גם תאי subcellular כגון endosomes, lysosomes, שלפוחית ​​Golgi נגזרת ומיטוכונדריה לקרום התא נפגע ^1-7. עם זאת, את פרטיו של הרצף של אירועים מולקולריים וsubcellular המעורבים בתיקון קרום תא פגוע נשאר הבינו היטב.

התגובה לתיקון של התא יכולה להיות מופרדת לתוך אוזןly ותגובות מאוחרות. תגובות הראשונות, אשר מתרחשות תוך שניות לזמן בקנה מידה דקות, הן חשובות מאוד בקביעת מהותן של תגובות מאוחרות שהובילו לתיקון תאים מוצלח או מוות של תאים. מבחני נקודת סיום מבוססים על אנליזה ביוכימית והתאית בתפזורת סייעו להקים את מעורבותם של תהליכים מולקולריים ותאיים בתיקון. אבל, בשל ההטרוגניות והמהירות של תגובת תיקון הסלולרי, מבחני נקודת סיום אינם מספקים פרטים הקינטית ומרחבים של הרצף של אירועים שהובילו לתיקון. גישות המאפשרות לפציעה מבוקרת של קרום תא ומאפשרים ניטור ותיקון קרום תא ותגובות subcellular קשורים במרחב ובזמן ברזולוציה גבוהה מתאימות בצורה אידיאלית ללימודים כאלה. הנה, גישות כאלה כבר הוצגו. שניים מפרוטוקולי תיאור גישות לפקח קינטיקה בזמן אמת של תיקון קרום תא ותגובות subcellular הקשורים בתהליך התיקון בתאים חיים הבאות inj הלייזרלסר אורי. כהשלמה למבחנים מבוססי הדמיה תא החי אלה, מבחני נקודת סיום יש גם תוארו המספקים מדד המבוסס אוכלוסייה לתיקון ניטור של תאים בודדים ותגובות subcellular הקשורות. כדי להדגים השירות שלהם גישות אלה היו בשימוש כדי לפקח על סחר וexocytosis של lysosomes בתגובה לפציעת קרום תא.

Protocol

1. תיקון קרום תא הדמיה באמצעות גורף (חרוז זכוכית) פציעה

פרוטוקול זה מאפשר בנפרד סימון התאים נפצעו ואלה שלא מצליחים לרפא. כימות אוכלוסיות של תאים אלה מחייב שימוש בשלושה תנאים: 1. מבחן (C1) - תאים רשאים לתקן בנוכחות של Ca ^{2 +,} 2. בקרת 1 (אין C2 פציעה) - תאים מודגרת בנוכחות של Ca ^{2 +,} אך לא נפגעו, ו 3. בקרה 2 (אין C3 תיקון) - תאים רשאים לתקן בהעדר Ca ^{2 +.}

1. לגדל תאים ל> מפגש 50% בשלושה coverslips סטרילית ולשטוף C1 ו-C2 פעמיים עם CIM על 37 מעלות צלזיוס וC3 עם PBS על 37 מעלות צלזיוס וcoverslips העברה על O-טבעות סיליקון.
2. הוספה של פתרון prewarmed FITC dextran בCIM על C1 ו-C2 או ב-PBS על C3 100 μl.
3. לפגוע בקרום פלזמה על C1 ו-C3 על ידי בעדינות מגלגל 40 חרוזי זכוכית מ"ג על coverslip בטמפרטורת חדר על ידי coverslips הטיה באופן ידני חזרה ושוב 6-8 פעמים בזווית של ° 30.
   הערה: לפציעה קלה, להבטיח את חרוזי הזכוכית מפוזרים באופן אחיד, ובכך למזער את הפציעות חוזרות. כדי לשפר את שחזור של פגיעה בין דגימות, בו זמנית לבצע את פציעת חרוז זכוכית של דגימות השונות כדי להשוות.
4. הימנעות גלגול נוסף של חרוזים, להעביר את כל coverslips לחממת 37 ° C ב-CO ₂ הסביבה ולאפשר תיקון כדי להמשיך למשך 5 דקות.
5. בלי לתת חרוזים להתגלגל, להסיר את חרוזי הזכוכית וdextran FITC על ידי שטיפה עם CIM (C1 ו-C2) או PBS (C3) ב37 ° C.
6. מקום coverslips חזרה על טבעת O ולהוסיף לפתרון prewarmed יזין ניתן לתקן dextran TRITC בCIM 100 μl על C1 ו-C2 או ב-PBS על C3.
7. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בסביבת CO _2.
8. לשטוף coverslips פעמיים עם CIM prewarmed ולתקן עם PFA 4% ל10 דקות ב RT.
9. לשטוף פעמיים עם PBS ו דגירה למשך 2 דקות ב RT בצבע Hoechst.
10. לשטוף samples פעמיים עם PBS, הר בשקופית באמצעות תקשורת הרכבה ותאי תמונה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence.
11. להשתמש בתאים מC2 כדי לקבוע את עוצמת כתמים האדומה וירוקה ברקע ולהשתמש בערך הזה לסף הערוצים האדומים וירוקים לכל הדגימות (C1-C3).
12. ציון מספר כולל של תאים ש) ירוק (נפצע ומתוקן) ו ב) אדומים או שניהם אדומים וירוק (נפצע, אך לא הצליחו לתקן) בדגימות C1 ו-C3.
13. תאי ספירה> 100 הירוקים לכל מצב ולהביע את החלק היחסי של תאים שלא הצליחו לתקן כאחוז מכל נפגעו התאים (הירוק ואדום).

2. הדמיה חיה של קינטיקה של תיקון קרום תא בעקבות פגיעה הלייזר

1. שטוף תאים עם CIM prewarmed ולאחר מכן לשים את coverslip בCIM עם צבע FM.
2. מקום coverslip בבעל בחממה העליונה שלב נשמרה על 37 ° C.
3. בחר אזור 1-2 מ"מ ² של קרום התא, ולהקרין ל<; 10 אלפיות שני עם לייזר הפעם. להחליש את כוח הלייזר דרך התוכנה כדי 40-50% מהחשמל בשעתי השיא. כוח אופטימלי מאפשר פגיעה עקבית, אך לא קטלנית וזה צריך להיקבע על ידי ניסוי וטעייה עבור קו מכשיר והתא בודדים כל אחד בשימוש.
4. כדי לפקח על תיקון, תמונה כל 10 שניות בepifluorescence וbrightfield, החל לפני פציעה ולהמשיך ל3-5 דקות בעקבות פציעה.
   הערה: אין שליטת תיקון, חזור על שלבים 2.1-2.4 עם התאים נפצעו בPBS המכילים צבע FM.
5. כדי לכמת את קינטיקה של תיקון, למדוד הקרינה לצבוע FM הסלולרי, ותתאר את השינוי בעוצמת (ΔF/F0) במהלך ההדמיה. נתונים אלו צריכים להיות בממוצע במשך 10 תאים בכל תנאי וזממו כממוצע או הערך של התא בודד, לפי צורך.

3. גורף הדמיה (חרוז זכוכית) פגיעה הנגרם על lysosomal exocytosis

דוגמאות כוללות תאים הבאים גדלו> 50%נקודת המפגש: 1. מבחן (C1) - תאים אפשרו לתקן בנוכחות של Ca ^{2 +,} 2. בקרת 1 (C2; אין פגיעה) - תאים לא נפגעו ולא הודגרו עם נוגדן ראשוני, ו 3. בקרה 2 (C3; לא תיקון) - תאים אפשרו לתקן בהעדר Ca ^{2 +.}

1. לשטוף coverslips C1 ו-C2 פעמיים עם CIM על 37 מעלות צלזיוס וC3 עם PBS על 37 מעלות צלזיוס ולהעביר אותם על O-טבעות סיליקון.
2. הוספה של דקסטראן prewarmed יזין ניתן לתקן TRITC בCIM על C1 ו-C2 ובPBS על C3 100 μl.
3. לפגוע בקרום פלזמה על C1 ו-C3 כמו בשלב 1.3.
4. הימנעות גלגול נוסף של חרוזים, להעביר את כל coverslips לחממת 37 ° C ב-CO ₂ הסביבה ולאפשר תיקון כדי להמשיך למשך 5 דקות.
5. הסר את חרוזי הזכוכית וdextran TRITC ידי שטיפת coverslips במדיום גידול קר, שוב הבטחה אין מתגלגל של חרוזי זכוכית על התאים.
6. שטוף את coverslips פעמיים עם מדיום גידול קר ולהעביר לטבעות האטימות.
7. לC1 ו-C3, להוסיף נוגדן LAMP1 עכברוש אנטי עכבר 100 μl בתקשורת צמיחה מלאה קרה ולהוסיף את תקשורת הצמיחה הקרה, המלאה לC2.
8. כדי לאפשר לנוגדנים מחייבים coverslips דגירה למשך 30 דקות ב 4 ° C.
9. שטוף את coverslips שלוש פעמים עם CIM הקר ולתקן את כל coverslips עם PFA 4% ל10 דקות ב RT ולאחר מכן לשטוף 3x עם CIM.
10. דגירה כל coverslips בחסימת פתרון ל15 דקות ב RT 100 μl
11. דגירה כל coverslips ב100 μl אלקסה פלואוריד 488 נוגדן אנטי עכברוש ל15 דקות ב 4 ° C.
12. לשטוף פעמיים עם PBS ו דגירה למשך 2 דקות ב RT בHoechst.
13. שטוף תאים פעמיים עם PBS, הר בשקופית באמצעות תקשורת ותדמית הרכבה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence.
14. שימוש בתמונות של תאי C2, לקבוע את מכתים ספציפי רקע באדום (dextran TRITC) וירוק ערוצים (נוגדן אלקסה פלואוריד 488) ולהשתמש בערכי מכתים רקע אלה לסף הערוצים האדומים וירוקים לכל הדגימות (C1-C3).
15. השתמש ב> 100 התאים האדומים שכותרתו מC1 ו-C3 כדי למדוד את עוצמת כתמי LAMP1 (ירוק) בתאים פגועים. לניסוי מוצלח מכתים LAMP1 בתאים מC3 יהיה נמוך יותר באופן משמעותי מאשר בתאים מC1.

4. הדמיה חיה של קרום תא פגיעה מופעלת על סחר subcellular

1. Fluorescently לתייג תא של עניין על ידי transfecting כתב מתאים (למשל CD63-GFP לlysosomes ⁸⁾ או על ידי שימוש בצבעי ניאון ^9.
2. לlysosomes תיוג עם צבע פלואורסצנטי, דגירה תאים המבוגרים כדי מפגש 50% בתקשורת צמיחה המכילה FITC-dextran
3. לאפשר dextran להיות endocytosed עבור שעה 2 (או יותר בהתאם לצורך תיוג מספיק endosomal עם dextran ידי שורת התאים של עניין) בחממת CO _2.
4. שטוף תאים עם תקשורת צמיחת prewarmed דגירה בזה במשך שעה 2 בחממה CO ₂ כדי לאפשר לכלendocytosed dextran להצטבר בליזוזום.
5. לפני ההדמיה, יש לשטוף את coverslip בCIM prewarmed ולעלות בבעל coverslip על החממה העליונה שלב ב 37 ° C.
6. לבצע widefield (לתנועה ברחבי התא) או TIRF (תנועה על פני התא וexocytosis) הדמיה - תאים שאין להם צפופים dextran FITC lysosomes שכותרתו הם אידיאליים עבור ההדמיה התנועה וexocytosis של lysosomes הבודד.
7. יישור לייזרי TIRF למיקרוסקופ הדמיה: השימוש 60x או אובייקטיבי 100X עם> 1.45 NA. להגדיר את הזווית לאירוע קרן לייזר TIRF שימוש בגישה של היצרן.
8. לפצוע את קרום התא על ידי הקרנת אזור קטן (1-2 מ"מ ²⁾ ל< 100 אלפית שניים, עם לייזר הפעם בהנחתת 40-50%.
9. כדי לפקח על התגובה של הליזוזום לתא פציעה, תאי תמונה ב4-6 מסגרות / השני לפחות 2 דקות או יותר בהתאם לדינמיקה של exocytosis בתאים של עניין.

תוצאות

פרוטוקולים שתוארו כאן להדמית תא בודדת הם לפקח על היכולת וקינטיקה של תיקון קרום תא (פרוטוקולי 1 ו -2) והסחר subcellular וההיתוך של lysosomes במהלך תיקון (פרוטוקולי 3 ו -4).

פרוטוקול 1 מציג assay בתפזורת המאפשר סימון כל התאים נפגעו וזיהוי תאים אלה נפ...

Discussion

פציעת קרום תא in vivo מתרחשת עקב מגוון של גורמי לחץ פיסיולוגיים וכמה גישות ניסיוניות פותחו לחקות אלה. אלה כוללים פצעו קרום תא של תאים חסיד על ידי גירוד אותם מהצלחת או על ידי passaging דרך ^9,10 מזרק שעמם צר. בעקבות פציעות כגון התאים לרפא בהשעיה ולא פעל בהתאם למטריצה ​?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma	H1387	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
HEPES	Fisher	BP410	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
FITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1820	2 mg/ml in CIM or PBS
Glass beads	Sigma	G8772
TRITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1818	2 mg/ml in CIM or PBS
PFA 16%	EMS	15710	4% in PBS
Hoechst	Invitrogen	H3570	1/10 000 in PBS
FM dye	Invitrogen	T3163	1 µg/µl in CIM or PBS
FITC dextran	Sigma	FD40S	2 mg/ml in growth medium
LAMP1	Santa Cruz	sc-19992	1/300 in growth medium
Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG	Invitrogen	A21470	1/500 in blocking solution
Mounting media	Dako	S3023
Coverslips	Fisher	12-545-86
Glass bottom petridish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Silicone O ring	Bellco	1943-33315
Coverslip holder	Bellco	1943-11111
Invitrogen	A-7816
DMEM	VWR	12001-566
FBS	VWR	MP1400-500H	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Penicillin/Sreptomycin	VWR	12001-350	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Chicken serum	Sigma	C5405	5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining
PBS (Ca2+ and Mg2+ free)	VWR	12001-664
Epifluorescence microscope	Olympus America, PA	IX81
TIRF illuminator	Olympus America, PA	Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
Epifluorescence illuminator	Sutter Instruments, Novato CA	Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD Camera	Photometrics, Tucson, AZ	Evolve 512 EMCCD
Image acquisition and anaysis software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Slidebook 5
Pulsed laser	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Ablate (3iL13)
Stage top incubator	Tokaihit, Japan	INUBG2ASFP-ZILCS