Изображений Клеточная мембрана Травмы и субклеточных процессов, связанных с Ремонт

Резюме

Процесс исцеления раненых клеток включает оборотом специфических белков и субклеточных отсеков в месте повреждения клеточных мембран. Этот протокол описывает анализы, чтобы контролировать эти процессы.

Аннотация

Способность поврежденных клеток, чтобы исцелить является фундаментальным клеточный процесс, но клеточные и молекулярные механизмы, участвующие в лечебных ранения клеток изучены плохо. Вот анализы описаны контролировать способность и кинетики заживления культивируемых клеток следующий локализованной травмы. Первый протокол описывает конечную точку подхода, основанного одновременно оценить ремонта клеточной мембраны способность сотен клеток. Второй протокол описывает реального времени подход изображений для мониторинга кинетики клеточной мембраны ремонта в отдельных камерах следующие локализованной травмы с помощью импульсного лазера. Как целебные поврежденных клеток включает оборотом специфических белков и субклеточных отсеков в месте повреждения, третий протокол описывает использование подхода выше конечная точка основе для оценки один такой случай торговли людьми (лизосомные экзоцитоза) в сотнях клеток поврежденных одновременно и последний протокол описывает использование импульсного лазерного травмы вместе с TIRF микроскопиикопия отслеживать динамику отдельных субклеточных отсеков в поврежденных клеток с высоким пространственным и временным разрешением. В то время как протоколы здесь описано применение этих подходов для изучения связи между ремонта клеточных мембран и лизосом экзоцитоза в культивируемых клетках мышц, они могут быть применены как таковой для любой другой клейкого культуры клеток и субклеточном компартменте выбора.

Введение

Клеточная мембрана поддерживает целостность клеток, обеспечивая барьер между клеткой и внеклеточной среде. Химические, электрические или механические стимул, который превышает нормальное физиологическое порог, а также присутствие вторжение болезнетворных микроорганизмов может каждый привести к травме клеточную мембрану и вызвать последующую клеточный ответ, чтобы восстановить эту травму. Чтобы выжить эти повреждения к клеточной мембране, клетки обладают эффективным механизмом для ремонта. Этот механизм зависит кальция и происходит путем оборота белков, таких как аннексинов и MG53 среди других, а также субклеточных отсеков, такие как эндосомах, лизосом, аппарата Гольджи, полученных пузырьков и митохондрий потерпевшей клеточной мембраны ^1-7. Тем не менее, детали последовательности молекулярных и субклеточных событий, участвующих в ремонте поврежденной клеточной мембраны еще недостаточно изучена.

Ответ ремонта клеток могут быть отделены в ухолы и поздние ответы. Ранние реакции, которые происходят в течение нескольких секунд, чтобы минут масштабе времени, чрезвычайно важны в определении характера конце ответов ведущих успешного ремонта клеток или гибели клеток. Конец точечные анализы, основанные на объемной биохимического и клеточного анализа помогли установить причастность молекулярных и клеточных процессов в ремонте. Но, в связи с неоднородностью и быстроты реакции сотовой ремонта, конечная точка анализы не в состоянии обеспечить кинетические и пространственные детали последовательности событий, приведших к ремонту. Подходы, которые позволяют контролируемого травму клеточной мембраны и позволяют контролировать ремонт клеточной мембраны и связанные субклеточных ответов на высоким пространственным и временным разрешением, идеально подходят для таких исследований. Здесь, такие подходы были представлены. Два из протоколов описать подходы для мониторинга в режиме реального времени кинетики клеточной мембраны ремонта и субклеточных реакции, связанные с процессом в живых клетках ремонта следующие лазерный InjУри. В дополнение к этих анализах, основанных изображений живых клеток, конечная точка анализы также были описаны которые обеспечивают меру, основанную население для мониторинга ремонта отдельных клеток и соответствующих ответов субклеточных. Чтобы продемонстрировать свою полезность эти подходы были использованы для мониторинга торговли людьми и экзоцитоза лизосом в ответ на повреждение клеточных мембран.

протокол

1. Изображений Клеточная мембрана Ремонт Использование Bulk (бисер) Ранение

Этот протокол позволяет отдельно маркировки поврежденных клеток и те, которые не заживают. Количественная эти популяции клеток требует использования трех условий: 1. Тест (C1) - Клеткам давали ремонтировать в присутствии ионов Са ^{2 +,} 2. Контроль 1 (без травмы C2) - Клетки инкубируют в присутствии ^{Са2 +,} но не пострадал, и 3. Контроль 2 (без ремонта С3) - клетки позволили отремонтировать в отсутствие Ca ^{2 +.}

1. Рост клеток до> 50% слияния на трех стерильных покровные и мыть C1 и C2 дважды CIM при 37 ° С и С3 с PBS при 37 ° С и передачи покровные силиконовых уплотнительных колец.
2. Добавить 100 мкл нагретого FITC Декстрана в CIM на С1 и С2 или в ФБР на С3.
3. Повредить плазматическую мембрану на С1 и С3, осторожно прокатки 40 мг стеклянных шариков над покровным при комнатной температуре вручную наклона назад и покровныед. 6-8 раз под углом 30 °.
   Примечание: Для легкой травмой, обеспечить стеклянные шарики распределены равномерно, таким образом минимизируя повторных травм. Для улучшения воспроизводимости травмы между образцами, одновременно проводить в бисер травмы различных образцов для сравнения.
4. Избежать дальнейшей прокатки шариков, передать все покровные в инкубаторе 37 ° C при температуре окружающей CO ₂ и позволить ремонт проводили в течение 5 мин.
5. Не выпуская шарики рулон, удаления стеклянных шариков и FITC декстран промывкой CIM (С1 и С2) или PBS (С3) при 37 ° С
6. Место покровные назад на кольце O и добавить 100 мкл нагретого лизина фиксируемой TRITC Декстрана в CIM на С1 и С2 или в PBS на С3.
7. Инкубировать при 37 ° С в течение 5 мин при комнатной CO _2.
8. Вымойте покровные дважды нагретого CIM и исправить с 4% PFA в течение 10 мин при комнатной температуре.
9. Промыть два раза с PBS и инкубировали в течение 2 мин при комнатной температуре в Hoechst краситель.
10. Вымойте SAMPLэс дважды PBS, крепление на слайде с помощью монтажных средств массовой информации и изображений клеток с использованием эпифлюорисцентной микроскопа.
11. Используйте клетки от С2 для определения фона красный и зеленый интенсивность окрашивания и использовать это значение для порога красный и зеленый каналы для всех образцов (С1-С3).
12. Оценка общего количества клеток, которые а) зеленый (ранения и ремонт) и б) красный или оба красного и зеленого (ранения, но не смогли отремонтировать) в образцах C1 и C3.
13. Граф> 100 зелень клетки для каждого условия и выражают долю клеток, которые не смогли восстановить в процентах от всех клеток поврежденных (зеленый и красный).

2. Живая съемка кинетики клеточной мембраны Ремонт итогам Лазерная травмы

1. Вымойте клеток с нагретого МГК, а затем положить покровное в МГК с FM красителя.
2. Поместите покровное в держателе в верхней этап инкубаторе, поддерживаемой при 37 ° С.
3. Выбор 1-2 мм ² область клеточной мембраны, и облучать для <; 10 мс с импульсного лазера. Ослабление мощности лазера с помощью программного обеспечения до 40-50% от пиковой мощности. Оптимальное мощность позволяет последовательно, но несмертельную травмы, и это должно быть определено методом проб и ошибок для каждого отдельного инструмента и клеточной линии используется.
4. Для мониторинга ремонт, изображение каждые 10 сек в эпифлуоресцентной и светлого, начиная до травмы и продолжаться в течение 3-5 мин после травмы.
   Примечание: Для без контроля ремонта, повторите шаги 2.1-2.4 с клетки получили ранения в PBS, содержащий FM красителя.
5. Для количественной оценки кинетики ремонта, измерения флуоресценции красителя FM сотовый и сюжет изменение интенсивности (ΔF/F0) в ходе визуализации. Эти данные должны быть усреднены в течение более 10 клеток в каждом состоянии и нанесены как усредненное или значение индивидуальной клетки, поскольку это необходимо.

3. Изображений Bulk (бисер) нарушений, индуцированных Лизосомные Экзоцитоз

Образцы включают следующие клеток, выращенных в> 50%слияние: 1. Тест (С1) - Клетки позволили восстановить в присутствии Ca ^{2 +,} 2. Контроль 1 (C2; Нет травмы) - Ячейки ни раненых, ни инкубировали с первичным антителом, и 3. Контроль 2 (С3; Нет ремонт) - Клетки позволили восстановить в отсутствие Ca ^{2 +.}

1. Wash покровные C1 и C2 дважды CIM при 37 ° С и С3 с PBS при 37 ° С и передавать их на силиконовых уплотнительных колец.
2. Добавить 100 мкл нагретого лизина фиксируемой TRITC декстрана в CIM на C1 и C2 и в ФБР на С3.
3. Ранить плазматическую мембрану на С1 и С3, как в пункте 1.3.
4. Избежать дальнейшей прокатки шариков, передать все покровные в инкубаторе 37 ° C при температуре окружающей CO ₂ и позволить ремонт проводили в течение 5 мин.
5. Удалите стеклянных шариков и TRITC декстран промывкой покровные в холодной среде роста, снова гарантируя, что ни сворачивание стеклянных шариков на клетки.
6. Промыть покровные дважды среде холодной роста и трансфер в уплотнительных колец.
7. Для С1 и С3, Добавить 100 мкл крысы анти мыши ЛАМПА1 антител в холодных полной среды роста и добавить холодную, в комплекте СМИ роста С2.
8. Чтобы разрешить связывания антител инкубировать покровные в течение 30 мин при 4 ° С.
9. Вымойте покровные три раза холодным CIM и исправить все покровные с 4% PFA в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем промыть 3 раза с CIM.
10. Инкубируйте все покровные в 100 мкл блокирующего раствора в течение 15 мин при комнатной температуре
11. Инкубируйте все покровные в 100 мкл Alexa Fluor 488 против крысиного антитела в течение 15 мин при 4 ° С.
12. Промыть два раза с PBS и инкубировали в течение 2 мин при комнатной температуре в Hoechst.
13. Вымойте клетки дважды с PBS, крепление на слайде с помощью монтажных средств массовой информации и изображения с помощью эпифлюорисцентной микроскопа.
14. Использование изображений C2 клеток, определения неспецифической фоновое окрашивание в красный (TRITC декстрана) и зеленый (Alexa Fluor 488 антитело) каналов и использовать эти фоновые окрашивания значения порога красный и зеленый каналы для всех образцов (С1-С3).
15. Используйте> 100 красные помечены клетки от С1 и С3 для измерения интенсивности ЛАМПА1 окрашивания (зеленый) в поврежденных клетках. Для успешного эксперимента ЛАМПА1 окрашивание в клетках С3 будет значительно ниже, чем в клетках от С1.

4. Живая съемка клеточной мембраны травмы Срабатывает субклеточных торговлей

1. Флуоресцентно маркировать Отсек интерес путем трансфекции соответствующего репортера (например CD63-GFP для лизосом ⁸⁾ или с помощью флуоресцентных красителей ^9.
2. Для маркировки лизосом с флуоресцентным красителем, инкубировать клеток, выращенных в 50% слияния в питательной среде, содержащей FITC-декстран
3. Разрешить декстран быть эндоцитарных в течение 2 часов (или больше по мере необходимости в течение достаточного эндосом маркировки с декстраном по линии клеток интереса) в CO _{2-инкубаторе.}
4. Вымойте клеток с предварительно нагретой питательной среды и инкубировать в нем в течение 2 часов в СО _{2-инкубатор,} чтобы всеэндоцитозу декстран накапливаться в лизосом.
5. Перед изображений, промыть покровное в предварительно нагретой CIM и смонтировать в держателе покровное на стадии верхней инкубаторе при температуре 37 ° С.
6. Провести Widefield (для передвижения по всей клетке) или TIRF (движение на поверхности клетки и экзоцитоза) изображений - клетки, которые не имеют переполненные FITC декстран меченые лизосом идеально подходят для работы с изображениями движение и экзоцитоз отдельных лизосом.
7. Выравнивание TIRF лазеры для визуализации микроскопа: Используйте 60X или 100X объектив с> 1,45 NA. Настройте угол для падающего TIRF лазерного луча с помощью подход производителя.
8. Ранить клеточную мембрану путем облучения небольшой (1-2 мм ²⁾ область для <100 мс, с импульсным лазером на 40-50% затухания.
9. Для наблюдения за ответ лизосом в ячейку травмы, изображения клеток в 4-6 кадров / с, по крайней мере 2 мин или больше в зависимости от динамики экзоцитоза в клетках интерес.

Результаты

Протоколы, описанные здесь, для работы с изображениями одного клеток являются контролировать способность и кинетика клеточных мембран ремонта (Протоколы 1 и 2) и субклеточной торговлей и слияние лизосом во время ремонта (Протоколы 3 и 4).

Протокол 1 показывает объемную ана...

Обсуждение

Травмы Клеточная мембрана в естественных условиях происходит из-за различных физиологических факторов стресса и несколько экспериментальных подходов были разработаны, чтобы имитировать их. К ним относятся ранив клеточную мембрану прилипшие клетки, очищая их от блюдо или пассаж...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma	H1387	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
HEPES	Fisher	BP410	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
FITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1820	2 mg/ml in CIM or PBS
Glass beads	Sigma	G8772
TRITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1818	2 mg/ml in CIM or PBS
PFA 16%	EMS	15710	4% in PBS
Hoechst	Invitrogen	H3570	1/10 000 in PBS
FM dye	Invitrogen	T3163	1 µg/µl in CIM or PBS
FITC dextran	Sigma	FD40S	2 mg/ml in growth medium
LAMP1	Santa Cruz	sc-19992	1/300 in growth medium
Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG	Invitrogen	A21470	1/500 in blocking solution
Mounting media	Dako	S3023
Coverslips	Fisher	12-545-86
Glass bottom petridish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Silicone O ring	Bellco	1943-33315
Coverslip holder	Bellco	1943-11111
Invitrogen	A-7816
DMEM	VWR	12001-566
FBS	VWR	MP1400-500H	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Penicillin/Sreptomycin	VWR	12001-350	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Chicken serum	Sigma	C5405	5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining
PBS (Ca2+ and Mg2+ free)	VWR	12001-664
Epifluorescence microscope	Olympus America, PA	IX81
TIRF illuminator	Olympus America, PA	Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
Epifluorescence illuminator	Sutter Instruments, Novato CA	Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD Camera	Photometrics, Tucson, AZ	Evolve 512 EMCCD
Image acquisition and anaysis software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Slidebook 5
Pulsed laser	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Ablate (3iL13)
Stage top incubator	Tokaihit, Japan	INUBG2ASFP-ZILCS