이미징 세포 막 상해 및 수리에 관여하는 세포 내 프로세스

요약

치유 손상균의 처리는 세포막 손상의 사이트에 특정 단백질과 세포 내 구획의 매매를 포함한다. 이 프로토콜은 이러한 프로세스를 모니터링하는 분석을 설명합니다.

초록

치유 손상균의 능력은 기본적인 세포 과정이지만 치유 손상균 개인 세포 및 분자 메커니즘은 불완전하게 이해되어있다. 여기에 분석은 현지화 된 손상 후 배양 된 세포의 치유의 능력과 반응 속도를 모니터링 할 수 있도록 서술되어있다. 첫 번째 프로토콜은 동시에 수백 개의 셀의 세포막 수리 능력을 평가하기 위해 엔드 포인트 기반의 접근 방식에 대해 설명합니다. 제 2 프로토콜은 펄스 레이저와 지역화 부상 다음 개별 세포의 세포막 수리의 동력학을 모니터하는 실시간 이미징 방법을 설명한다. 치유 부상 세포가 상해의 사이트에 특정 단백질과 세포 내 구획의 매매를 수반으로, 세 번째 프로토콜은 동시에 부상 수백 개의 셀에 하나의 인신 매매 사건 (리소좀 세포 외 유출)을 평가하기 위해 위의 엔드 포인트 기반의 접근 방식을 사용하고 마지막 프로토콜을 설명합니다 TIRF의 마이크로 함께 펄스 레이저 부상의 사용에 대해 설명높은 공간과 시간적 해상도로 부상 세포에서 각각의 세포 내 구획의 역학을 모니터에 복사합니다. 여기 프로토콜 세포막 수리 배양 근육 세포의 리소좀 세포 외 유출 간의 링크를 연구하는 이러한 접근법의 사용을 설명하지만, 이들은 임의의 다른 부착 배양 세포 및 선택의 세포 내 구획을 위해 등을 적용 할 수있다.

서문

세포막은 세포와 세포 외 환경 사이의 장벽을 제공함으로써 세포의 무결성을 유지한다. 정상적인 생리 임계 값뿐만 아니라 병원균 침입의 존재를 초과, 화학, 전기, 기계적인 자극이 세포막에 상해에있는 각 결과와이 상처를 복구 이후의 세포 반응을 트리거 할 수 있습니다. 세포막에 이러한 부상을 살아 남기 위해서, 세포 복구를위한 효율적인 메커니즘을 가지고있다. 이 메커니즘은 칼슘 의존하고 다른 사람의 사이에 같은 annexins과 MG53 같은 단백질의 세포 내 인신 매매뿐만 아니라 손상된 세포막 ^1-7 엔도 좀, 리소좀, 골지체 파생 소포와 미토콘드리아 같은 세포 내 구획을 포함한다. 그러나 손상된 세포막을 복구에 관련된 분자 및 세포 내 일련의 이벤트의 세부 사항이 제대로 이해 남아 있습니다.

세포의 수리 응답은 귀으로 분리 할 수​​ 있습니다LY 늦게 반응. 분 시간 단위로 초 이내에 발생하는 초기 반응은 성공적으로 세포 수리 또는 세포 사망에 이르는 늦게 응답의 성격을 결정하는 데 대단히 중요하다. 대량 생화학 및 세포 분석을 기반으로 엔드 포인트 분석은 수리 분자 및 세포 프로세스의 참여를 설정 도움이있다. 그러나, 셀룰러 인해 복구 응답 이질성 및 신속성으로, 종점 분석법 복구를 초래하는 이벤트의 시퀀스의 운동 및 공간 세부 정보를 제공하지 못한다. 세포막의 부상 제어를 가능하게하고 세포막 수리 및 높은 공간 및 시간적 해상도에 관련된 세포 내 반응을 모니터링 할 수 있도록 접근은 이상적으로 그러한 연구를 위해 적합하다. 여기, 이러한 접근 방법이 제시되었다. 프로토콜의 두 레이저 INJ 따라 세포막 수리의 실시간 동역학 및 생균의 복구 과정과 연관된 세포 내 반응을 모니터링하는 방법을 설명URY. 이러한 라이브 세포 이미징 기반의 분석에 대한 보완으로, 엔드 포인트 분석은 개별 세포와 관련된 세포 내 반응의 모니터링 수리를 위해 인구를 기반으로 측정을 제공하는 기술되었다. 이러한 접근은 세포막 손상에 응답 매매 및 리소좀의 세포 외 유출을 모니터링하는 데 사용 된 그들의 실용성을 입증.

프로토콜

1. 이미징 세포막 수리 대량 사용 (유리 구​​슬) 부상

이 프로토콜은 별도로 부상 세포 치료에 실패하는 사람들을 표시 할 수 있습니다. 세포의이 인구의 양을 세 가지 조건의 사용이 필요합니다 : 1. 테스트 (C1) - 세포는 칼슘 ^{2 +,} 2의 존재에 복구 할 수 있습니다. 제어 1 (아무 부상 C2) - 세포는 ^칼슘 이온의 존재 하에서 배양,하지만 부상하지, 3됩니다. 제어 2 (노 수리 C3)는 - 세포는 칼슘 ^{2 +의} 부재에 복구 할 수 있습니다.

1. 세 멸균 커버 슬립에> 50 %의 합류로 세포 성장과 실리콘 O-링에 37 ° C 및 전송의 coverslips에서 PBS와 37 ° C 및 C3에서 CIM 회 C1과 C2를 씻어.
2. C1과 C2 또는 PBS에서 C3에 CIM에서 데워진 FITC 덱스 트란 용액 100 μl를 추가합니다.
3. 조심스럽게 수동 틸팅 커버 슬립에 의해 상온에서 커버 슬립에 40 밀리그램의 유리 구슬을 회전에 의해 C1과 C3에 세포막을 손상30 °의 각도로 앞으로 6 ~ 8 시간.
   참고 : 가벼운 부상, 따라서 반복 부상을 최소화, 유리 구슬이 균일하게 확산되도록. 샘플 사이 부상의 재현성을 향상시키기 위해, 동시에 비교 될 다른 샘플의 유리 구슬 부상을 수행한다.
4. 구슬의 추가 흔들림을 방지, 대기 CO _2에서 37 ° C 배양기에 모두 커버 슬립을 전송하고 수리가 5 분 동안 진행 할 수 있습니다.
5. 구슬이 굴러시키지 않고, 37 ℃에서 CIM (C1 및 C2) 또는 PBS (C3)로 세척하여 유리 구슬과 FITC 덱스 트란을 제거
6. 장소는 O 링에 다시 커버 슬립과 C1과 C2 또는 PBS에서 C3에 CIM에서 데워진 리신 고칠 TRITC 덱스 트란 용액 100 μl를 추가합니다.
7. 주위 CO _2에서 5 분 동안 37 ° C에서 알을 품다.
8. 데워진 CIM로 두 번 커버 슬립을 세척하고 실온에서 10 분 동안 4 % PFA로 고정합니다.
9. PBS로 두 번 세척하고 헥스 염료의 실온에서 2 분 동안 품어.
10. 세척 SAMPLES PBS로 2 회, 표면 형광 현미경을 사용하여 장착 매체 및 화상 세포를 사용하여 슬라이드 마운트.
11. 배경 빨간색과 녹색의 염색 강도를 결정하고, 모든 샘플 (C1-C3)에 대한 임계 빨간색과 녹색 채널에이 값을 사용하는 C2의 세포를 사용합니다.
12. ) 녹색 (부상 및 수리) 및 b) 적색 또는 적색과 녹색 (부상을 모두 포함하지만, C1과 C3 샘플에서) 복구하는 데 실패하는 세포의 수를 점수.
13. 백작> (100) 그린의 각 조건에 대한 부상의 모든 세포 (녹색, 적색)의 백분율로 복구하는 데 실패 세포의 일부를 발현하는 세포.

2. 레이저 손상 후 세포의 막 수리의 속도론의 라이브 영상

1. 데워진 CIM으로 세포를 세척 한 다음 FM 염료와 CIM에 커버 슬립을 넣어.
2. 37 ℃에서 무대 위에 배양기에서 홀더에 커버 슬립을 배치
3. 세포막의 1-2 MM ² 지역을 선택하고 대한 조사 <, 펄스 레이저와 10 밀리. 피크 파워 40-50 %로 소프트웨어를 통해 레이저 파워를 감쇄. 최적의 전력이 일치하지만, 치명적 부상을 허용하고이 사용되는 각각의 악기와 세포 라인에 대한 시행 착오에 의해 결정되어야한다.
4. 이전에 부상을 시작, 표면 형광 및 시야에 수리, 이미지마다 10 초를 모니터링하고 손상 후 3 ~ 5 분 동안 계속합니다.
   참조 : 수리 컨트롤의 반복 PBS의 부상 세포가 FM 염료를 함유하는 2.1-2.4 단계를 반복합니다.
5. 수리의 반응 속도를 정량화하기 위해 휴대 FM 염료의 형광을 측정 및 이미징의 과정 동안 강도 (ΔF/F0)의 변화를 플롯. 이 데이터는 각 조건에서 10 셀에 대한 평균과 필요에 따라, 평균 또는 개별 셀의 값으로 그릴 수 있어야합니다.

3. 영상 벌크 (유리 구​​슬) 상해 유도 리소좀 세포 외 유출

샘플은> 50 %로 성장 다음 세포를 포함합류 : 1. 테스트 (C1) - 칼슘 ^{2 +,} 2의 존재에 복구 할 수 세포. 제어 1 (C2, 아니 부상) - 세포 손상되거나 차 항체와 함께 배양, 3 어느 쪽도. 제어 2 (C3, 아니 수리) - 칼슘 ^{2 +의} 부재에 복구 할 수 세포.

1. 세탁은 37 ° C에서 PBS와 37 ° C 및 C3에서 CIM 회 C1과 C2를 커버 슬립 실리콘 O-링에 전송할 수 있습니다.
2. C3에 C1과 C2에 CIM과 PBS에서 데워진 리신 고칠 TRITC 덱스 트란의 100 μl를 추가합니다.
3. 단계 1.3에서와 같이 C1과 C3에 세포막을 손상.
4. 구슬의 추가 흔들림을 방지, 대기 CO _2에서 37 ° C 배양기에 모두 커버 슬립을 전송하고 수리가 5 분 동안 진행 할 수 있습니다.
5. 다시 세포에 유리 구슬의 더 롤링을 보장하지, 차가운 성장 매체에 커버 슬립을 세척하여 유리 구슬과 TRITC 덱스 트란을 제거합니다.
6. 차가운 성장 매체로 두 번 커버 슬립을 씻어 O-링에 전송할 수 있습니다.
7. C1과 C3에차가운 완벽한 성장 미디어 쥐 반대로 마우스 램프 1 항체의 100 μl를 추가하고 C2에 감기, 완전 성장 매체를 추가 할 수 있습니다.
8. 항체를 4 ℃에서 30 분 동안 품어 커버 슬립을 결합 수 있도록하려면
9. 차가운 CIM과 커버 슬립을 세 번 세척하고 실온에서 10 분 동안 4 % PFA 모두의 coverslips를 해결하고 CIM으로 배를 씻어.
10. 실온에서 15 분 동안 차단 솔루션의 100 μL의 모든 커버 슬립을 품어
11. 4 ℃에서 알렉사 플 루어 100 μL에 15 분 동안 488 안티 쥐의 항체를 모두 커버 슬립을 품어
12. PBS로 두 번 세척하고 훽스트에서 실온에서 2 분 동안 품어.
13. PBS로 두 번 세포를 세척, 표면 형광 현미경을 사용하여 설치 미디어 및 이미지를 사용하여 슬라이드에 탑재합니다.
14. C2 셀의 이미지를 사용하여 비특이적 배경 빨간색으로 염색 (TRITC 덱스 트란)과 녹색 (알렉사 플 루어 488 항체) 채널을 결정하고 모든 샘플 (C1-C3)의 빨간색과 녹색 채널 임계 값이 배경 염색 값을 사용합니다.
15. 손상된 세포의 램프 1 염색 (녹색)의 강도를 측정하기 위해 C1과 C3에서> (100) 레드 라벨 ​​세포를 사용합니다. 성공적인 실험을 위해 C3의 세포에있는 램프 1 염색은 C1의 세포에 비해 크게 낮은 것입니다.

4. 셀 멤브레인 손상의 라이브 영상은 세포 내 인신 매매를 트리거

1. 형광 라벨 (리소좀 ^8에 대한 예를 들어, CD63-GFP) 또는 형광 염료 ^(9)를 사용하여 해당 기자를 형질 전환하여 관심의 구획.
2. 형광 염료와 라벨 리소좀를 들어, FITC-덱스 트란을 포함하는 성장 매체에 50 %의 합류로 성장 세포를 배양
3. CO ₂ 인큐베이터 (관심 세포주로 덱스 트란과 충분한 엔도 좀의 표시에 필요한 이상) 덱스 트란 2 시간 동안 endocytosed 할 수 있습니다.
4. 수 있도록 데워진 성장 매체와 세포를 세척하고 CO ₂ 배양기에서 2 시간 동안 그 안에 품어 모든리소좀 축적하는 덱스 트란을 endocytosed.
5. 촬영하기 전에 예비 가온 CIM에서 커버 슬립을 씻어 37 ℃에서 무대 위에 인큐베이터에 커버 슬립 홀더에 장착
6. (셀에 걸쳐 이동) 위드 또는 TIRF (세포 표면 및 세포 외 유출에 운동) 이미징을 수행 - FITC 덱스 트란 혼잡이없는 세포가 표시 리소좀 개별 리소좀의 이동과 세포 외 유출 이미징에 이상적입니다.
7. 영상 현미경에 대한 TIRF 레이저 정렬 : 사용 60X 또는> 1.45 NA와 100X의 목표를. 제조업체의 접근 방식을 사용하여 사건 TIRF 레이저 빔의 각도를 설정합니다.
8. 40~50% 감쇠의 펄스 레이저로, <100 밀리 위해 작은 (1-2 MM ²⁾ 영역을 조사함으로써 세포막을 손상.
9. 관심의 세포에서 세포 외 유출의 역학에 따라 최소 2 분 이상 4-6 프레임 / 초에 부상, 이미지 셀 셀에 리소좀의 반응을 모니터링 할 수 있습니다.

결과

단일 세포 이미징 여기에 설명 된 프로토콜은 능력과 반응 속도 세포막 수리 (프로토콜 1, 2) 및 복구하는 동안 세포 내 인신 매매와 리소좀의 융합 모니터링 할 수 있습니다 (프로토콜 3, 4).

프로토콜 1은 모든 부상 세포를 표시하고 복구하는 데 실패하는 부상 세포를 식별 할 수있는 대량 분석을 보여줍니다. 손상되지 않은 세포 (그림 1A)가 레이블을 유지하면서, F...

토론

생체 내에서 세포막 손상으로 인해 생리적 스트레스 요인의 다양성과 여러 가지 실험 방법이 모방하기 위해 개발되었습니다 발생합니다. 이러한 요리를 긁어 또는 좁은 구멍 주사기 ^9,10 통해 계대에 의해 부착 세포의 세포막을 손상 있습니다. 등의 부상에 따라 세포 현탁액 치유하고 그들이 일반적으로 조직에서와 마찬가지로 세포 외 기질을 준수하지. 이러한 기공 형성 독소의 사...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma	H1387	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
HEPES	Fisher	BP410	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
FITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1820	2 mg/ml in CIM or PBS
Glass beads	Sigma	G8772
TRITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1818	2 mg/ml in CIM or PBS
PFA 16%	EMS	15710	4% in PBS
Hoechst	Invitrogen	H3570	1/10 000 in PBS
FM dye	Invitrogen	T3163	1 µg/µl in CIM or PBS
FITC dextran	Sigma	FD40S	2 mg/ml in growth medium
LAMP1	Santa Cruz	sc-19992	1/300 in growth medium
Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG	Invitrogen	A21470	1/500 in blocking solution
Mounting media	Dako	S3023
Coverslips	Fisher	12-545-86
Glass bottom petridish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Silicone O ring	Bellco	1943-33315
Coverslip holder	Bellco	1943-11111
Invitrogen	A-7816
DMEM	VWR	12001-566
FBS	VWR	MP1400-500H	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Penicillin/Sreptomycin	VWR	12001-350	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Chicken serum	Sigma	C5405	5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining
PBS (Ca2+ and Mg2+ free)	VWR	12001-664
Epifluorescence microscope	Olympus America, PA	IX81
TIRF illuminator	Olympus America, PA	Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
Epifluorescence illuminator	Sutter Instruments, Novato CA	Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD Camera	Photometrics, Tucson, AZ	Evolve 512 EMCCD
Image acquisition and anaysis software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Slidebook 5
Pulsed laser	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Ablate (3iL13)
Stage top incubator	Tokaihit, Japan	INUBG2ASFP-ZILCS