El uso de proteínas fluorescentes para visualizar y cuantificar<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuola dinámica de crecimiento en las células vivas

Resumen

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Resumen

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C. trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Introducción

Las enfermedades infecciosas causadas por especies de la bacteria Chlamydia intracelular provocan una carga importante en la salud global, incluyendo enfermedades de transmisión sexual, enfermedad inflamatoria pélvica, la ceguera, neumonía y posiblemente aterosclerosis ^1.4. La capacidad de Chlamydia para interactuar con la célula huésped, desde dentro de una vacuola (denominada la inclusión), es un determinante crítico para su éxito de la infección de las células y el anfitrión. La inclusión es una novela compartimento patógeno que permite el crecimiento por clamidias y se modifica dinámicamente durante todo el ciclo de desarrollo de 2-3 días de Chlamydia ^5. La naturaleza intracelular obligado de clamidias presenta numerosos retos para la comunidad de investigación, en particular para estudiar directamente de la biología única de la inclusión. Un obstáculo importante ha sido la incapacidad de visualizar de manera eficiente ya sea Chlamydia intracelular o su inclusión por el enfoque fluorescenteES en células vivas. Un descubrimiento reciente ha revelado por fin los medios para generar GFP expresando C. trachomatis ^6; Sin embargo, este hallazgo aún no ha dado lugar a un etiquetado específico de la inclusión. Algunas técnicas se han descrito para el etiquetado de las bacterias y las inclusiones ^7,8, pero adolecen de deficiencias tales como la no especificidad, la transitoriedad y la susceptibilidad a photobleaching. Un descubrimiento clave de nuestro grupo estableció una nueva estrategia para la iluminación de la inclusión mediante las buenas prácticas agrarias que expresan las células anfitrionas ^9. Esta estrategia explota racionalmente la impermeabilidad intrínseca de la inclusión de membrana a las moléculas de mayor que 520 Da ^10. Cuando las células están diseñados para expresar de forma estable una proteína fluorescente citosólica particular (por ejemplo, las buenas prácticas agrarias o mCherry), inclusiones de Chlamydia son visibles con notable claridad por su exclusión completa de fluorescencia. Esta estrategia de inversión de imágenes permite la visualización inmediata de inclusiones para todos Chlespecies amydia y que se pueden adaptar fácilmente para la mayoría de las células huésped de interés. Como demostración de su utilidad, este método fue utilizado anteriormente para revelar y definir las vías de salida celulares para Chlamydia spp ^9.

Aquí, una vez más demostrar cómo se realiza este procedimiento, y puede ser explotado para obtener datos cuantitativos clave acerca de la dinámica de crecimiento de inclusión. Además, se puede sustituir con eficacia de costosos métodos de enumeración basadas en anticuerpos y se puede utilizar en conjunto con otras etiquetas fluorescentes, tales como mKate2-expresión de Chlamydia ^11. Esta poderosa combinación de herramientas permite la exploración de las propiedades físicas de la membrana inclusión clamidia dentro de las células anfitrionas de estar.

Protocolo

1. Generación de host fluorescente Líneas Celulares

1. Día 1. Las células 293T Plate (u otra línea de envasado retroviral) en placas de 6 pocillos a 2 x 10 ⁶ células / Bueno, para ser ~ 75% confluentes al día siguiente. Si se desea, la placa de pocillos duplicados para cada uno de retrovirus a utilizar.
2. Día 2. células Aspirar y añadir 2 ml de medio de cultivo fresco (DMEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamina). Transfectar células con 5-8 g cada uno de vector retroviral (que contiene GFP) y envasado vector (por ejemplo., PVSVg) usando Lipofectamine 2000 o reactivo similar y siguiendo las instrucciones del fabricante.
3. Se incuban las células con el ADN durante 4-6 horas en un _incubador de CO2 C 37 °, y posteriormente sustituir medio con medio de crecimiento 1 ml.
4. Se incuban las células durante 48 horas en 37 ° C _incubadora de CO 2.
5. Día de las células 3. Placa de destino (por ejemplo., HeLa) en placas de 6 pocillos a una densidad aproximada de 10 ⁵ células / pocillo, para ser ~ 50% de confluencia deldía siguiente. Verificar la transfección positiva en células 293T mediante el control de la fluorescencia de GFP en un microscopio invertido.
6. Día 4. Recoger sobrenadantes fuera de las células 293T con una pipeta y filtrar el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de acetato de 0,45 micras de celulosa que contienen retrovirus.
7. Retire medio a partir de células HeLa y añadir medio de crecimiento de 0,5 ml contiene 16 mg / ml de polibreno. Añadir ~ 0,5 ml de retrovirus filtrada a las células gota a gota e incubar las células en una _incubadora de CO 2 C 37 ° durante 24 horas. Almacenar cualquier retrovirus restantes (es decir, desde el duplicar pocillo) a 4 ° C.
8. Día 5. Si se hicieron pocillos duplicados para generar retrovirus adicional, repita el paso 1.7 para infectar serie con las partículas retrovirales restantes.
9. Día 6. Passage células HeLa transfectadas 1: 1 en una placa de 10 cm que contiene la selección de antibióticos (por ejemplo, 500 mg / ml de neomicina).
10. Espere el tiempo suficiente para que las células transducidas a crecer de nuevo en presencia de la selección antibiotic, después de lo cual las células se pueden propagar mediante técnicas estándar con una concentración más baja de antibiótico de selección (por ejemplo., 200 mg / ml de neomicina).
    Nota: Las células también se pueden seleccionar clonalmente para el brillo ideales en este momento, si es necesario.

2. Generación de GFP-expresión de Chlamydia trachomatis

1. Preparar 2x CaCl ₂ tampón (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM CaCl ₂₎ y tampón 4SP (0,4 M sacarosa, 16 mM Na ₂ HPO _4).
2. Día 1. Descongele congelada C. trachomatis disponible el hielo e inmediatamente diluir 10 l bacterias en 50 l 2x CaCl _tampón 2. Añadir 3 ADN plásmido mg (por ejemplo., PASK-GFP-mKate2-L2), mezclar bien e incubar durante 30 minutos a 25 ° C.
3. Durante este paso, preparar células huésped mediante tripsinización un matraz T-75 de células McCoy en un tubo de centrífuga. Centrifugar la suspensión celular a 50 xg durante 5 min y descartar el sobrenadante. Resuspend celular pellet en volumen apropiado de tampón 1x CaCl ₂ para dar una concentración final de 4 x 10 ⁷ células / ml.
4. Después de la incubación de 30 min (de la etapa 2.2), añadir 100 l preparados células McCoy para tubo de mezcla de transformación (volumen total 200 l) y se incuba un 20 min adicionales a 25 ° C. Añadir 100 l de esta mezcla de células transformadas a un solo pocillo de una placa de 6 pocillos y superposición con medio 2 ml crecimiento. Incubar a 37 ° C en una incubadora de CO ₂ durante 2 días.
5. Día 3. células Lyse McCoy infectadas con C. trachomatis mediante la sustitución de medio con 1 ml de dH ₂ O y raspado de células con una punta de pipeta de 1.000 l doblada. Añadir 1 ml de tampón 4SP y pasar la suspensión a través de una aguja de 27,5 G ~ 5 veces para la lisis celular eficiente y liberación de C. trachomatis.
6. Transferencia de 2 ml del lisado celular que contiene C. trachomatis a un matraz T-75 que contiene una monocapa confluente de recién chapado McCcélulas oy; añadir 8 ml de DMEM (sin FBS) y se incuba durante 2 horas a 25 ° C para permitir C. trachomatis a que se adhieran a las células.
7. Células Aspirar y añadir medio de crecimiento fresco suplementado con 10 U / ml de penicilina G y 1 mg / ml de cicloheximida. Incubar matraz durante 48 h en una incubadora de 37 ° C CO _2.
8. Día 4. Verifique por microscopía de luz que las células están infectadas y inclusiones contienen Chlamydia aberrante. Identificar inclusiones como vacuolas brillantes en un microscopio óptico estándar, y los organismos de Chlamydia aberrantes como objetos de anillo dentro de inclusiones que son mayores de 2 m de diámetro.
9. Día 5. cultura Lyse reemplazando medio con 2 ml _dH2O y raspar las células en una suspensión. Añadir 2 ml de tampón 4SP y pasar la suspensión a través de una aguja de 27,5 G ~ 5 veces.
10. Utilice 2 ml de lisado de células para infectar una monocapa fresca de células McCoy en un solo pocillo en una placa de 6 pocillos. Se incuban las células con lisado durante 2 horas a 25 ° C, y añadir aspirado de crecimiento frescomedio que contiene penicilina G y cicloheximida.
11. Se incuban las células en una incubadora a 37 ° C CO ₂ durante 3-5 días, dependiendo de la salud general de las células.
12. Repita los pasos 2.9-2.10 una o más veces, según sea necesario, culturas pases en pozos frescas en una placa de 6 pocillos hasta inclusiones buscan normales (desprovistos de cuerpos aberrantes) han surgido. En este momento utilizar un microscopio de fluorescencia invertida para comprobar que C. trachomatis expresar mKate2 (rojo).
13. Ampliar los cultivos infectados para la generación de las poblaciones de clamidias alto título, por ejemplo, mediante la recolección de transformantes Chlamydia de células McCoy o HeLa infectadas cultivadas en matraces T-150.

3. La infección de células con Chlamydia

1. Placa células GFP-HeLa en recipiente de cultivo deseada, por ejemplo, platos de vidrio de fondo o la cámara de diapositivas de imágenes de alta resolución, o placas de 24 pocillos para la determinación IFU y la detección de múltiples pocillos.
2. Descongele frotubo de zen que contiene C. trachomatis, C. muridarum, o C. pneumoniae en hielo y diluido en HBSS a la multiplicidad deseada de infección (MOI), por ejemplo MOI = 1.
3. Realizar infecciones ya sea estáticas o centrifugación asistido basado en la cepa particular Chlamydia que se utilizará.
   1. Para las infecciones con C. trachomatis LGV serovar L2 o C. muridarum, lavar las células GFP-HeLa con HBSS y se incuba con bacterias diluidas durante 2 horas a 25 ° C. Aspirar y lavar las células con HBSS, e incubar las células en medio de crecimiento en 37 ° C _incubadora de CO 2.
   2. Para las infecciones con C. trachomatis serovar D o C. pneumoniae, lavar las células GFP-HeLa con HBSS y añadir bacterias diluidas a las células. Coloque la placa de múltiples pocillos o plato de fondo de cristal (garantizado por la cinta en una tapa de placa de múltiples pocillos) en un soporte de la placa de múltiples pocillos de un accesorio de rotor basculante en una centrífuga de mesa.
   3. Células centrifugar a 900 xg a 25 ° C durante 1 hora.
   4. Retire recipientes de cultivo de centrífuga y el lugar en una incubadora a 37 ° C CO ₂ durante 1 hora.
   5. Aspirar las células en un gabinete de bioseguridad, se lavan las células dos veces con HBSS, y añadir medio de cultivo fresco. Coloque las células en un _incubador de CO2 C 37 °.

4. Visualización de células vivas de Chlamydia Inclusiones

1. Retire Chlamydia infectadas células GFP-HeLa de CO ₂ incubadora y reemplazar medio con RPMI sin rojo fenol + 5% de SFB.
2. Células de montaje en un microscopio de fluorescencia invertido (Nikon Eclipse Ti-E o similar) usando un objetivo 20X o superior petróleo.
3. El uso de software de imagen (Volocity 6 o similar), se centran en identificar y clamidia infecta células GFP-HeLa: células verdes que contienen grandes agujeros negros (inclusiones de Chlamydia).
4. Marque las ubicaciones xyz de las regiones que contienen las células infectadas por clamidia de interés utilizando software de imagen (Volocity 6 o similar). Realizar esto manualmente "Añadir puntos ', mientras que en el modo de vista XY escenario. De esta manera, las coordenadas xyz se guardan para cada ubicación marcada.
5. En el cuadro de diálogo Configuración de Adquisición, configurar el software para adquirir verde (GFP, HeLa citosol) y rojo (mKate2, C. trachomatis) canales, ya una tasa de nuevos cuadros por canal cada 5 min.
6. Adquirir la secuencia de imágenes mediante la adquisición de protocolo entró anterior haciendo clic en el botón "Capture / Record".

5. La cuantificación de los parámetros de crecimiento de inclusión en células vivas

1. En tiempos deseados después de la infección (por ejemplo., 24, 48 hpi) eliminar clamidia infecta células GFP-HeLa de la incubadora y montar en un microscopio de fluorescencia invertida. Nota: Un objetivo 20X o 40X aire con un alto NA es más adecuado para las placas de 24 pocillos, y se recomienda un objetivo de aceite de 40X para la cámara de diapositivas. Crecer células a cada sustrato para este culoay.
2. Concéntrese en planos medios de las células, donde las inclusiones están en su diámetro máximo y producir bordes nítidos.
3. Adquirir imágenes de muchos campos en cada pocillo (por lo menos 10 por pocillo); pozos normalmente representan réplicas o variables experimentales.
4. Enumerar el número de inclusiones de forma manual, por el ojo (inclusiones son compartimentos negros en células GFP-HeLa) o utilizar algoritmos de software de formación de imágenes para identificar y contar automáticamente las inclusiones.
   1. Encuentra células GFP-HeLa por la intensidad de fluorescencia ('Encuentra Objetos' comando) y ajustar la intensidad umbral de fluorescencia basada en intensidades relativas de las células.
   2. Filtrar objetos seleccionados utilizando directrices de tamaño de mantener sólo aquellos mayores de 5 micras ^2. Se trata de 'población 1'.
   3. Aplicar 'Rellenar agujeros en objetos' comando utilizando 'población 1' como entrada. Este paso genera 'población 2'.
   4. Reste 'población 1' de 'población 2 'para dar marcó positivamente inclusiones de Chlamydia, designados como "población 3'.
   5. Aplicar filtro de tamaño de "población 3 '(comando' Filtro Población '), por ejemplo, los objetos de mantenimiento mayor que 25 m ^{2 para} inclusiones en células infectadas durante 24 horas o más. Para tiempos de infección temprana, como antes de la 18 horas, filtro de tamaño ajustado para mantener los objetos de más de 4 m ^2, ya que estas inclusiones son mucho más pequeños. Resultados de filtrado Tamaño de una población de objetos designados como "inclusiones".
   6. Calcular datos cuantitativos a partir de imágenes, por ejemplo, número de la inclusión, el tamaño de la inclusión, y la circunferencia de la inclusión, utilizando software de imágenes.

Resultados

Las células de mamífero que expresan proteínas fluorescentes citosólicas (por ejemplo, GFP) pueden ser diseñados para permitir la iluminación de inclusiones de Chlamydia en cultivos de células en vivo, infectados. Tras la infección con Chlamydia, las inclusiones son fácilmente visibles como puntos negros en las células huésped (Figura 1). La claridad de las inclusiones de fluorescencia de carecer puede ser explotado para la identificación automática de las inclusi...

Discusión

Aquí se describe la estrategia experimental para la generación de células huésped fluorescentes para visualización en tiempo real y análisis de inclusiones de Chlamydia. Este enfoque visualización vacuola confiere la poderosa capacidad de iluminar, rastrear y cuantitativamente medir las propiedades dinámicas de inclusiones clamidias través de las poblaciones de células o en células individuales en el tiempo. Inclusiones de Chlamydia en las células de proteínas etiquetados fluorescentes est...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
Opti-Mem	Invitrogen	31985
Polybrene	Sigma	H9268
0.45 µm filters	Fisher	09-719D
G418	Invitrogen	10131
HBSS	Invitrogen	14025
DMEM	Invitrogen	11995
RPMI 1640	Invitrogen	11875
RPMI 1640 w/o phenol red	Cellgro	17-105-CV
Penicillin G	Sigma	13752
Cycloheximide	Sigma	C7698
Glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Chamber slides, Lab-Tek II	Nunc	154526, 154534