시각화 및 정량하기 위해 형광 단백질을 사용하여<em&gt; 클라미디아</em&gt; 액포 성장 역학 살아있는 세포에서

요약

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

초록

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C. trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

서문

세포 내 세균의 클라미디아의 종에 의해 발생하는 감염성 질환은 성병, 골반 염증성 질환, 실명, 폐렴 가능성이 동맥 경화 ^1-4을 포함하여 세계 보건에 큰 부담을 유도. 액포 내에서, 숙주 세포와 상호 작용하는 클라미디아의 능력 (포함 되나), 숙주 세포의 성공적인 감염 중요한 결정 요인이다. 포함은 클라미디아 성장을 가능하게하고 동적으로 클라미디아 ^5의 전체 2~3일 발달주기에 걸쳐 수정 된 새로운 병원성 구획입니다. chlamydiae의 의무적 세포 내 성격은 직접 포함의 독특한 생물학을 연구, 특히 연구 커뮤니티에 많은 과제를 제시한다. 주요 장애는 효율적으로 세포 내 클라미디아 또는 형광 접근하여 그들의 포함를 시각화하는 무능력하고있다살아있는 세포에서 말이지. 최근의 발견은 마지막으로 GFP C를 표현을 생성하는 방법을 공개했다 트라코마 티스 ^(6); 그러나,이 연구 결과는 아직 포함 특정 라벨을 주도하지 않았습니다. 일부 기술은 박테리아 나 개재물 ^7,8의 표시에 대해 기재되었지만, 이러한 photobleaching에 비 - 특이 조로 감수성과 같은 단점을 겪는다. 우리 그룹에 의해 중요한 발견은 숙주 세포 ^(9)을 표현 GFP를 사용하여 포함을 조명하기위한 새로운 전략을 수립. 이 전략은 합리적 이상 520 다 ¹⁰ 분자 포접 막의 극한 투과성을 이용한다. 세포가 안정적으로 특정 세포질 형광 단백질 (예를 들면, GFP 또는 mCherry)를 발현하도록 유전자 조작 된 경우, 클라미디아 흠 형광 자신의 완전한 배제로 놀라운 선명도와 함께 볼 수 있습니다. 이 역 이미징 전략은 모든 엽록소에 대한 흠 즉시 시각화 할 수 있습니다amydia 종과 용이 관심 대부분의 숙주 세포에 대해 적응 될 수있다. 그 유틸리티의 시연으로,이 방법은 클라미디아 종 ⁹ 휴대 출구 경로를 공개하고 정의하기 위해 이전에 사용되었다.

여기서, 우리는 또한이 방법을 수행하고, 개재물의 성장 역학에 관한 정량적 데이터 키를 유도하기 위하여 이용 될 수 있는지 보여준다. 또한, 비용 효율적 항체 기반 열거 방법을 대체 할 수 있으며 클라미디아 ¹¹ mKate2 발현과 같은 다른 형광 라벨과 협력하여 사용될 수있다. 공구의 이러한 강력한 결합은 살아있는 숙주 세포 내부 클라미디아 포함 막의 물성을 탐사 할 수있다.

프로토콜

형광 숙주 세포 라인의 1 세대

1. / 잘 2 × 10 ⁶ 세포에서 6 웰 플레이트에 일 1. 플레이트 293T 세포 (또는 다른 레트로 바이러스 포장 라인) ~ 75 % 합류 다음날합니다. 원한다면, 각각의 레트로 바이러스에 대한 중복 웰 플레이트가 사용될 수있다.
2. 주 2. 대기음 세포 및 2를 가하여 신선한 성장 배지 (DMEM + 10 % FBS + 2 mM의 L- 글루타민). 리포 펙 타민 2000 또는 유사한 시약을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 5-8 μg의 레트로 바이러스 벡터 (GFP를 포함) 및 포장 벡터의 각 (예., pVSVg)와 세포를 형질.
3. 1 ml의 성장 매체와 매체를 교체 이후 37 ° C CO ₂ 배양기에서 4-6 시간 동안 DNA와 세포를 품어합니다.
4. 37 ° C CO _{2 배양기에서} 48 시간 동안 세포를 품어.
5. 일 3. 플레이트 표적 세포 (예., 헬라) ¹⁰⁵ 세포의 밀도로 대략 6 웰 플레이트 상 / 웰이 될 ~ 50 % 합류다음날. 거꾸로 현미경에 GFP의 형광을 모니터링하여 293T 세포에 긍정적 인 형질을 확인합니다.
6. 주 4. 수집 레트로 바이러스 함유 0.45 μm의 셀룰로오스 아세테이트 주사기 필터를 통해 뜨는을 피펫을 사용하여 필터링 293T 세포 오프 상층 액을.
7. 헬라 세포에서 매체를 제거하고 16 μg의 / ㎖의 폴리 브렌를 포함하는 0.5 ml의 성장 매체를 추가합니다. 세포에 필터링 된 레트로 바이러스의 ~ 0.5 ML을 추가 현명한 드롭, 24 시간 동안 37 ° C CO ₂ 배양기에서 세포를 배양한다. 4 ℃에서 (잘 복제에서, 즉) 남아있는 레트로 바이러스를 저장합니다.
8. 중복 우물이 순차적으로 나머지 레트로 바이러스 입자와 감염 여분의 레트로 바이러스, 단계를 반복 1.7을 생성하는 사항이있는 경우의 날 (5).
9. (예를 들어, 500 μg의 / ㎖ 네오 마이신) 10cm 접시 포함 된 선택 항생제로 1 일 6 항로는 헬라 세포 1을 형질 전환.
10. 선택 antibio의 존재에 다시 성장 형질 세포에 충분한 시간을 기다립니다셀 선택 항생제의 낮은 농도의 표준 기술에 의해 전달 될 ​​수있는 후 TIC (예., 200 μg의 / ㎖ 네오 마이신).
    주 : 필요한 경우 세포 클론 적 또한,이 때 이상적인 밝기 위해 선택 될 수있다.

GFP 발현 클라미디아 트라코마 티스의 2 세대

1. 배 _CaCl2를 버퍼 (20 mM 트리스 산도 7.4, 100 mM의 염화칼슘 _2)와 4SP 버퍼 (0.4 M 자당, 16 mM의 나 ₂ HPO _4)를 준비합니다.
2. 주 1. 해동 냉동 C. 트라코마 티스 재고 얼음에 즉시 50 μL 배 _CaCl2를 버퍼에 10 μL 박테리아를 희석. 3 μg의 플라스미드 DNA를 추가 (예., PASK-GFP - mKate2-L2)를 잘 혼합하고 25 ℃에서 30 분 동안 품어.
3. 이 단계 동안, 원심 분리 튜브에 맥코이 세포를 T-75 플라스크를 trypsinizing하여 숙주 세포를 준비한다. 5 분 50 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. Resuspen1X _CaCl2를 버퍼의 적절한 체적 D 세포 펠렛을 4 × 10 ⁷ 세포 / ㎖의 최종 농도를 얻었다.
4. (단계 2.2)에서 30 분간 인큐베이션 한 후, 형질 전환 혼합물을 튜브 (200 μl의 총 부피)에 맥코이 세포를 제조 100 μL를 추가하고, 25 ℃에서 추가로 20 분 동안 배양한다. 2 ml의 성장 매체와 6 자 플레이트와 오버레이에서 하나의 잘이 형질 전환 된 세포 혼합물의 100 μl를 추가합니다. 2 일간 CO ₂ 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양한다.
5. 일 3.를 Lyse 맥코이 세포는 C. 감염 구부러진 1,000 μL 피펫 팁으로 세포를 1 ML의 DH ₂ O와 매체를 대체하고 긁어 트라코마 티스. C의 효율적인 세포 용해 및 릴리스 5 회 1 ml의 4SP 버퍼를 추가하고 ~ 27.5 G 바늘을 통해 서스펜션을 통과 트라코마 티스.
6. C.를 함유하는 세포 용 해물의 전사 2 ml를 갓 도금 MCC의 합류 단층을 함유하는 T-75 플라스크에 트라코마오우 세포; (FBS)없이 8 mL의 DMEM을 추가 C. 있도록 25 ℃에서 2 시간 동안 배양 트라코마는 세포에 부착합니다.
7. 기음 세포는 10 U / ml의 페니실린 G와 1 μg의 / ㎖의 사이클로 헥시 미드와 보충 신선한 성장 매체를 추가하고. 37 ° C CO _{2 배양기에서} 48 시간 동안 플라스크를 품어.
8. 일 4. 세포가 감염되고 흠이 비정상적 클라미디아를 포함하는 광학 현미경으로 확인합니다. 2보다 큰 μm의 직경이다 흠 내 링 형상의 객체로 표준 광학 현미경에 밝은 공포, 그리고 비정상적인 클라미디아 기관 등의 흠을 확인합니다.
9. 현탁액으로 세포를 2 ML의 DH ₂ O와 매체를 대체하고 긁어로 날 (5)를 Lyse 문화. 2 ml의 4SP 버퍼를 추가하고 ~ 27.5 G 바늘을 통해 5 번 정지를 전달합니다.
10. 6 웰 플레이트에 하나의 웰에 맥코이 세포의 신선한 단층을 감염 세포 용 해물을 2 ㎖를 사용합니다. 25 ° C, 흡인에서 2 시간 동안 해물과 세포를 품어 신선한 성장을 추가페니실린 G 및 사이클로 헥시 미드를 포함하는 매체.
11. 세포의 건강에 따라 3 ~ 5 일 동안 37 ° C CO _{2 배양기에서} 세포를 품어.
12. 반복 (비정상적인 몸의 결여) 정상 찾고 흠이 등장 할 때까지 6 웰 플레이트에 신선한 우물에 2.9-2.10 한 번 이상, 필요에 따라, 계대 배양 단계를 반복합니다. 이 때 확인하기 위해 거꾸로 형광 현미경을 사용 C. 트라코마는 mKate2 (빨간색)을 표현한다.
13. T-150 플라스크에서 재배 감염 맥코이이나 헬라 세포에서 클라미디아의 형질 전환을 수확하여, 예를 들어 높은 역가 클라미디아 주식의 생성에 감염된 문화, 최대 확장 할 수 있습니다.

3. 클라미디아와 세포를 감염

1. IFU 결정 및 멀티 웰 검사 예를 들어 유리 바닥 요리 또는 챔버 슬라이드 고해상도 이미징을위한, 또는 24 웰 플레이트 원하는 배양 용기에 플레이트 GFP - 헬라 세포.
2. 이리저리 해동C를 포함하는 선 튜브 트라코마 티스, C. muridarum, 또는 C 예를 MOI 1 = 얼음에 폐렴 및 감염의 원하는 다양성 (MOI)에 HBSS에 희석.
3. 사용되는 특정 클라미디아의 변형을 기반으로 정적 또는 원심 분리 주었 중 감염을 수행합니다.
   1. C.와 감염 트라코마 티스 LGV의 혈청 형 (L2) 또는 C muridarum, HBSS로 GFP - 헬라 세포를 세척하고 25 ℃에서 2 시간 동안 희석 세균 배양한다. 기음과는 HBSS로 세포를 씻어, 37 ° C CO ₂ 배양기에서 배양 배지에서 세포를 배양한다.
   2. C. trachomatis에의 혈청 형의 D 또는 C와 감염 폐렴은, HBSS로 GFP - 헬라 세포를 씻어 세포에 희석 박테리아를 추가 할 수 있습니다. 벤치 탑 원심 분리기에서 스윙 버킷 회 전자 첨부의 멀티 웰 플레이트 홀더 멀티 웰 플레이트 (멀티 웰 플레이트 뚜껑을 테이프로 고정) 유리 바닥 접시를 놓습니다.
   3. 1 시간 동안 25 ° C에서 900 XG에 원심 분리기 세포.
   4. 1 시간 동안 37 ° C CO _{2 배양기에서} 원심과 장소에서 문화 혈관을 제거합니다.
   5. 기음 세포는 바이오 안전성 캐비닛에, HBSS로 두 번 세포를 씻어 신선한 성장 매체를 추가합니다. 37 ° C CO _{2 인큐베이터에} 넣어 세포.

클라미디아 흠 4. 라이브 셀 시각화

1. CO ₂ 배양기에서 클라미디아 감염 GFP - 헬라 세포를 제거하고 페놀 5 + 빨간색 %의 FBS없이 RPMI와 매체를 교체하십시오.
2. 20 배 이상 오일 목표를 사용하여 거꾸로 형광 현미경 (니콘 이클립스 티-E 또는 이와 유사한 것)에 마운트 세포.
3. 큰 블랙홀 (클라미디아 흠)를 포함하는 녹색 세포 : 이미징 소프트웨어 (Volocity 6 또는 유사)를 사용하여,에 초점을 식별 클라미디아는 GFP - 헬라 세포를 감염.
4. 마크 이미지 소프트웨어를 이용하여 관심있는 클라미디아 -infected 세포를 포함하는 영역의 XYZ 위치 (용적ocity 6 또는 이와 유사한 것). 수동으로 XY 스테이지보기 모드에서 '포인트 추가'를하여이 작업을 수행합니다. 이러한 방식으로, XYZ 좌표는 각 표시된 위치에 저장됩니다.
5. 취득 설치 대화 상자에서, 녹색 (GFP, 헬라 세포질)과 빨간색 (mKate2, C. trachomatis에) 채널, 채널마다 새로운 프레임마다 5 분의 속도를 얻기 위해 소프트웨어를 구성합니다.
6. 프로토콜이 "캡처 / 녹음"버튼을 클릭하여 상기 입력을 이용하여 획득 된 이미지 시퀀스를 획득.

라이브 세포에 포함 성장 매개 변수 5. 정량

1. 원하는 시간에 후 감염 (예., 24, 48 HPI) 클라미디아는 인큐베이터에서 GFP - 헬라 세포를 감염 제거하고 거꾸로 형광 현미경에 장착합니다. 참고 : 높은 NA와 20 배 또는 40 배 공기의 목표는 24 웰 플레이트에 가장 적합하고, 40X 오일 목적은 챔버 슬라이드를 사용하는 것이 좋습니다. 이 엉덩이에 대한 중 하나를 기판에 세포를 성장AY.
2. 흠이 자신의 최대 직경에있는 세포의 미드 플레인에 초점 선명한 가장자리를 얻을 수 있습니다.
3. 각 웰 (물론 당 적어도 10)에 많은 분야에 대한 이미지를 수집; 우물은 일반적으로 복제 또는 실험 변수를 나타냅니다.
4. 눈으로 (개재물 GFP-HeLa 세포 검정 구획이다), 수동 개재물의 개수를 열거 나 자동으로 개재물을 식별하고 카운트하기 위해 이미지 소프트웨어 알고리즘을 사용한다.
   1. 형광 강도에 의해 GFP - 헬라 세포를 찾아 (명령 '개체 찾기')를 세포의 상대 강도를 기반으로 형광 임계 강도를 조절합니다.
   2. 그 단지보다 5 μm의 ^2를 유지의 크기 지침을 사용하여 필터 선택한 객체. 이는 '인구 1'이다.
   3. 입력으로 '인구 1'을 사용하여 명령 '개체에 구멍 채우기'를 적용합니다. 이 단계는 "인구 2 '를 생성한다.
   4. '페이지에서 빼기'인구 1 'opulation 2 '인구 3'는 긍정적으로 지정 클라미디아 흠을 표시 얻었다 '.
   5. 예를 유지하는 객체에 대해, '인구 3'( '필터 인구'명령)에 크기 필터를 적용 24 시간 이상 감염된 세포에서 흠보다 큰 25 μm의 ^2. 이 흠이 훨씬 작 등의 이전에 18 시간 일찍 감염 시간, 내용, 집합 크기 필터는 4 μm의 ² 이상의 개체를 유지합니다. '흠​​'로 지정된 객체의 인구 크기 필터링 결과.
   6. 이미징 소프트웨어를 사용하여 정량 예컨대 이미지 데이터, 포접 번호, 개재물 크기 및 포접 둘레를 계산한다.

결과

세포질 형광 단백질 (예를 들면, GFP)를 발현하는 포유 동물 세포는 살아있는, 감염된 세포 배양에서 클라미디아 흠의 조명을 사용하도록 설계 될 수있다. 클라미디아 감염시, 포함은 숙주 세포 (그림 1)에 검은 반점으로 쉽게 볼 수 있습니다. 형광 부족 개재물의 선명도는보기 및 / 또는 치료 (그림 1)의 여러 분야에 걸쳐 개재물의 자동 식별을 위해 이용...

토론

여기에서 우리는 실시간으로 시각화 및 클라미디아 흠의 분석을위한 형광 숙주 세포를 생성하는 실험적인 전략을 설명합니다. 이 공포의 시각화 방법은 시간이 지남에 따라 단일 세포 세포의 인구를 통해 또는에서 클라미디아 개재물의 동적 특성을 조명 추적하고 정량적으로 측정 할 수있는 강력한 능력을 부여한다. 클라미디아 흠을 형광 단백질 표지 세포에서 눈에 띄게 잘 그들?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
Opti-Mem	Invitrogen	31985
Polybrene	Sigma	H9268
0.45 µm filters	Fisher	09-719D
G418	Invitrogen	10131
HBSS	Invitrogen	14025
DMEM	Invitrogen	11995
RPMI 1640	Invitrogen	11875
RPMI 1640 w/o phenol red	Cellgro	17-105-CV
Penicillin G	Sigma	13752
Cycloheximide	Sigma	C7698
Glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Chamber slides, Lab-Tek II	Nunc	154526, 154534