Utilisation de protéines fluorescentes de visualiser et de quantifier<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuole la dynamique de croissance dans les cellules vivantes

Résumé

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Résumé

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C. trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Introduction

Les maladies infectieuses causées par des espèces de la bactérie Chlamydia intracellulaire suscitent un fardeau important sur ​​la santé mondiale, y compris les maladies sexuellement transmissibles, la maladie inflammatoire pelvienne, la cécité, la pneumonie et, éventuellement, l'athérosclérose ^1-4. La capacité de Chlamydia d'interagir avec la cellule hôte, à partir de l'intérieur d'une vacuole (appelée inclusion), est un facteur déterminant de leur infection réussie de cellules et de l'hôte. L'inclusion est un compartiment pathogène roman qui permet la croissance de la chlamydia et est modifié dynamiquement tout au long du cycle de développement 2-3 jours de Chlamydia ^5. La nature intracellulaire obligatoire de Chlamydia présente de nombreux défis à la communauté de la recherche, en particulier pour étudier directement la biologie unique de l'inclusion. Un handicap majeur a été l'incapacité de visualiser efficacement soit Chlamydia intracellulaire ou leur inclusion par l'approche fluorescentees dans les cellules vivantes. Une découverte récente a finalement révélé les moyens de générer exprimant la GFP C. ⁶ trachomatis; Toutefois, cette constatation n'a pas encore abouti à un étiquetage spécifique de l'inclusion. Certaines techniques ont été décrites pour l'étiquetage des bactéries et des inclusions ^7,8, mais ils souffrent de lacunes tels que la non-spécificité, l'éphémère et la susceptibilité à photoblanchiment. Une découverte clé de notre groupe a établi une nouvelle stratégie pour éclairer l'inclusion en utilisant exprimant la GFP cellules hôtes ^9. Cette stratégie exploite rationnellement l'imperméabilité intrinsèque de la membrane de l'inclusion de molécules supérieur à ¹⁰ 520 Da. Lorsque les cellules sont manipulées pour exprimer de façon stable une protéine fluorescente cytosolique particulier (par exemple, la GFP ou mCherry), inclusions à Chlamydia sont visibles avec une clarté remarquable par leur exclusion complète de la fluorescence. Cette stratégie d'imagerie inverse permet la visualisation immédiate des inclusions pour tous Chlespèces amydia et il peut être facilement adaptés pour la plupart des cellules hôtes d'intérêt. Comme une démonstration de son utilité, cette méthode a été utilisée précédemment pour révéler et de définir les voies de sortie cellulaires pour Chlamydia spp ^9.

Ici, nous démontrons encore comment cette méthode est effectuée, et peut être exploitée pour obtenir des données quantitatives clés sur la dynamique de croissance de l'inclusion. En outre, il peut effectivement se substituer aux méthodes de dénombrement à base d'anticorps coûteux et peut être utilisé en tandem avec d'autres marqueurs fluorescents, comme mKate2 exprimant Chlamydia ^11. Cette puissante combinaison d'outils permet l'exploration des propriétés physiques de la membrane de l'inclusion Chlamydia intérieur des cellules hôtes de vie.

Protocole

1. Génération de lignées cellulaires hôtes Fluorescent

1. Jour 1. Plate cellules 293T (ou autre ligne d'emballage retroviral) sur des plaques à 6 puits à 2 x 10 ⁶ cellules / puits, à ~ 75% de confluence le lendemain. Si on le souhaite, la plaque de puits en double pour chaque rétrovirus à être utilisés.
2. Jour 2. Aspirer cellules et ajouter 2 ml de milieu de croissance frais (DMEM + 10% de FBS + 2 mM de L-glutamine). Transfecter des cellules avec 5-8 ug de chaque vecteur retroviral (contenant la GFP) et le vecteur de l'emballage (par ex., PVSVg) en utilisant de la Lipofectamine 2000 ou similaire réactif et en suivant les instructions du fabricant.
3. Incuber les cellules avec de l'ADN de 4-6 heures dans un _incubateur à CO 2 C 37 ° C, et ensuite remplacer milieu avec 1 ml de milieu de croissance.
4. Incuber les cellules pendant 48 heures à 37 ° C CO ₂ incubateur.
5. Jour 3. cellules de plaques cibles (par ex., HeLa) sur des plaques à 6 puits à une densité approximative ^de 10 5 cellules / puits, à ~ 50% de confluence lele prochain jour. Vérifier positif transfection dans des cellules 293T en surveillant fluorescence de la GFP sur un microscope inversé.
6. Jour 4. Recueillir surnageants hors des cellules 293T aide d'une pipette et filtrer le surnageant à travers un filtre d'acétate de la seringue de 0,45 um de cellulose contenant un rétrovirus.
7. Retirer moyen de cellules HeLa et ajouter du milieu 0,5 ml de croissance contenant 16 pg / ml de polybrène. Ajouter ~ 0,5 ml de rétrovirus filtrée aux cellules goutte à goutte et incuber les cellules dans un C CO ₂ incubateur à 37 ° pendant 24 heures. Rangez les éventuels rétrovirus restants (à savoir, à partir du puits en double) à 4 ° C.
8. Jour 5. Si les puits en double ont été effectués afin de générer rétrovirus supplémentaire, répétez l'étape 1.7 pour infecter en série avec les particules rétrovirales restants.
9. Jour 6. Passage transfectées cellules HeLa 1: 1 dans une boîte de 10 cm contenant le choix des antibiotiques (par exemple, 500 ug / ml de néomycine).
10. Attendez suffisamment de temps pour les cellules transduites à repousser en présence de sélection antibiotic, après quoi les cellules peuvent être propagées par des techniques standard avec une concentration plus faible de sélection antibiotique (par ex., 200 pg / ml de néomycine).
    Note: Les cellules peuvent également être choisis par clonage pour la luminosité idéale à ce moment, si nécessaire.

2. Génération de la GFP exprimant Chlamydia trachomatis

1. Préparer 2x _CaCl2 tampon (20 mM Tris pH 7,4, 100 _mM de CaCl2) et le tampon 4SP (0,4 M de saccharose, 16 mM de Na _{2 HPO 4).}
2. Jour 1. Décongelez C. trachomatis de stock sur la glace et diluer immédiatement 10 bactéries ul dans 50 pl 2x tampon CaCl _2. Ajouter 3 ADN plasmidique pg (par ex., PASK-GFP-mKate2-L2), bien mélanger et incuber pendant 30 min à 25 ° C.
3. Au cours de cette étape, la préparation des cellules hôtes par trypsinisation un flacon T-75 de cellules de McCoy dans un tube de centrifugeuse. Centrifuger la suspension cellulaire à 50 g pendant 5 min et jeter le surnageant. Resuspend culot cellulaire en volume approprié de tampon _de CaCl2 1x pour donner une concentration finale de 4 x 10 ⁷ cellules / ml.
4. Après l'incubation de 30 minutes (de l'étape 2.2), ajouter 100 ul de cellules de McCoy préparés tube de mélange de transformation (volume total 200 ul) et incuber 20 minutes supplémentaires à 25 ° C. Ajouter 100 ul de ce mélange de cellules transformées à un seul puits d'une plaque à 6 puits avec du milieu de recouvrement et 2 ml de la croissance. Incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO ₂ pendant 2 jours.
5. Jour 3. Lyse cellules McCoy infectées par le C. trachomatis en remplaçant moyenne avec 1 ml dH _{2 O} et le grattage des cellules avec une pipette de 1000 pi plié. Ajouter 1 ml de tampon 4SP et passer la suspension à travers une aiguille de 27,5 G ~ 5 fois pour la lyse cellulaire efficace et la libération de C. trachomatis.
6. Transfer 2 ml de lysat cellulaire contenant C. trachomatis dans un flacon T-75 contenant une monocouche confluente de fraîchement plaqué McCcellules Oy; ajouter 8 ml de DMEM (sans FBS) et incuber pendant 2 heures à 25 ° C pour permettre C. trachomatis à adhérer aux cellules.
7. Aspirer les cellules et ajouter milieu de croissance frais supplémenté avec 10 U / ml de pénicilline G et 1 ug / ml de cycloheximide. Incuber pendant 48 h ballon dans un incubateur à 37 ° C _de CO 2.
8. Jour 4. Vérifiez par microscopie optique que les cellules sont infectées et les inclusions contiennent Chlamydia aberrante. Identifier les inclusions que vacuoles lumineuses sur un microscope optique standard, et les organismes de Chlamydia aberrantes comme des objets en forme d'anneau dans inclusions qui sont supérieures à 2 pm de diamètre.
9. Jour 5. Lyse culture en remplaçant moyenne avec 2 ml _dH2Û et gratter les cellules en suspension. Ajouter 2 ml de tampon 4SP et passer la suspension à travers une aiguille de 27,5 G ~ 5 fois.
10. Utiliser 2 ml de lysat cellulaire à infecter une monocouche fraîche de cellules de McCoy dans un seul puits dans une plaque à 6 puits. Incuber les cellules avec lysat pendant 2 heures à 25 ° C, aspirer et ajouter croissance fraismilieu contenant de la pénicilline G et cycloheximide.
11. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C _de CO 2 pendant 3-5 jours, en fonction de la santé générale des cellules.
12. Répétez les étapes 2.9-2.10 une ou plusieurs fois, selon les besoins, les cultures des passages dans des puits frais dans une plaque à 6 puits jusqu'à ce que les inclusions d'apparence normale (dépourvus de corps aberrantes) ont vu le jour. A ce moment utiliser un microscope inversé à fluorescence pour vérifier que C. trachomatis exprimer mKate2 (rouge).
13. Intensifier les cultures infectées pour la production des stocks de Chlamydia de titre élevé, par exemple en récoltant transformants Chlamydia à partir de cellules McCoy ou HeLa infectées cultivées en flacons T-150.

3. infection de cellules avec Chlamydia

1. Plate cellules HeLa GFP-sur récipient de culture souhaitée, par exemple des plats de fond de verre ou des diapositives de la chambre pour l'imagerie haute résolution, ou des plaques à 24 puits pour la détermination IFU et le dépistage à puits multiples.
2. Décongeler froTube zen contenant C. trachomatis, C. muridarum, ou C. pneumoniae sur de la glace et diluées dans du HBSS à la multiplicité désirée de l'infection (MOI), par exemple MOI = 1.
3. Effectuer infections statiques ou assistée par centrifugation en fonction de la souche de Chlamydia particulier qui sera utilisé.
   1. Pour les infections à C. trachomatis LGV sérotype L2 ou C. muridarum, laver les cellules GFP-HeLa avec HBSS et incuber des bactéries dilué pendant 2 heures à 25 ° C. Aspirer et laver les cellules avec HBSS, et incuber les cellules dans un milieu de croissance de 37 ° C CO ₂ incubateur.
   2. Pour les infections à C. trachomatis serotype D ou C. pneumoniae, laver les cellules GFP-HeLa avec HBSS et ajouter des bactéries aux cellules dilué. Placez plaque multi-puits ou un plat à fond de verre (fixé par un ruban dans un couvercle de plaque multi-puits) dans un support de plaque à puits multiples d'un rotor attachement à godet oscillant dans une centrifugeuse de paillasse.
   3. Centrifuger les cellules à 900 g à 25 ° C pendant 1 h.
   4. Retirer les contenants de la culture d'une centrifugeuse et placer dans un incubateur à 37 ° C CO ₂ pendant 1 heure.
   5. Aspirer cellules dans une enceinte de sécurité biologique, laver les cellules deux fois avec HBSS, et ajouter du milieu de croissance frais. La place des cellules dans un C CO ₂ incubateur à 37 °.

4. cellules vivantes Visualisation de Chlamydia Inclusions

1. Retirer Chlamydia infectés cellules GFP-HeLa de CO ₂ incubateur et remplacer moyenne avec RPMI sans rouge de phénol + 5% de FBS.
2. Cellules de montage sur un microscope à fluorescence inversé (Nikon Eclipse Ti-E ou similaire) en utilisant un objectif 20X ou plus d'huile.
3. En utilisant un logiciel d'imagerie (Volocity 6 ou similaire), se concentrer sur et identifier les cellules infectées par Chlamydia GFP-HeLa: cellules vertes contenant de grandes trous noirs (inclusions de Chlamydia).
4. Marquer les endroits xyz de régions contenant des cellules infectées par Chlamydia d'intérêt en utilisant un logiciel d'imagerie (Volocity 6 ou similaire). Effectuez cette manuellement par «Ajout de points de la tandis que dans le mode d'affichage XY scène. De cette manière, coordonnées XYZ sont enregistrées pour chaque emplacement marqué.
5. Dans la boîte de dialogue de configuration d'acquisition, configurer le logiciel pour acquérir verte (GFP, HeLa cytosol) et rouge (mKate2, C. trachomatis) chaînes, et à un taux de nouvelles images par canal toutes les 5 min.
6. Acquérir la séquence d'images en utilisant l'acquisition protocole est entré ci-dessus en cliquant sur le "Capture / Enregistrement" bouton.

5. La quantification des paramètres de croissance d'inclusion dans les cellules vivantes

1. À certains moments souhaités post-infection (par ex., 24, 48 HPI) éliminer les cellules infectées par Chlamydia GFP-HeLa de l'incubateur et monter sur un microscope à fluorescence inversé. Note: Un objectif 20X ou 40X air avec une haute NA est le mieux adapté pour les plaques à 24 puits, et un objectif de l'huile 40X est recommandé pour les diapositives de la chambre. Cultiver les cellules de chaque substrat pour cet âneAy.
2. Focus sur plan médian de cellules, où les inclusions sont à leur diamètre maximum et obtenir des bords nets.
3. Acquérir les images pour les nombreux domaines dans chaque puits (au moins 10 par puits); puits représentent généralement les répliques ou les variables expérimentales.
4. Énumérer le nombre d'inclusions manuellement, par l'oeil (les inclusions sont compartiments noirs dans les cellules HeLa-GFP) ou utiliser des algorithmes de logiciels d'imagerie pour identifier automatiquement et compter inclusions.
   1. Trouver cellules GFP-HeLa par l'intensité de fluorescence («Trouvez les objets de la commande) et d'ajuster l'intensité de seuil de fluorescence en fonction des intensités relatives des cellules.
   2. Filtrer les objets sélectionnés à l'aide des lignes directrices de la taille de garder ceux-là seulement supérieure à 5 pm ^2. Ceci est «population 1 '.
   3. Appliquer "remplir les trous dans les objets de la commande à l'aide de« population 1 'comme entrée. Cette étape génère «population 2 '.
   4. «Population 1 'Soustraire de' population 2 'pour donner positivement marqué inclusions de Chlamydia, désignés comme «population 3'.
   5. Appliquer un filtre de taille pour 'population 3' ('Filtrez population' commande), par exemple des objets de maintien supérieure à 25 um ² pour les inclusions dans les cellules infectées pendant 24 heures ou plus. Pour des temps de début de l'infection, comme avant 18 heures, réglez filtre de taille pour garder les objets de plus de 4 pm ^2, que ces inclusions sont beaucoup plus petits. Les résultats de filtrage de taille dans une population d'objets désignés comme des «inclusions».
   6. Calculer des données à partir d'images quantitative, par exemple, le numéro de l'inclusion, la taille de l'inclusion, et l'inclusion circonférence, en utilisant un logiciel d'imagerie.

Résultats

Les cellules de mammifères exprimant des protéines cytosoliques fluorescents (par exemple, GFP) peuvent être conçus pour permettre un éclairage d'inclusions à Chlamydia, dans des cultures de cellules infectées vivantes. Lors de l'infection à Chlamydia, les inclusions sont facilement visibles sous forme de taches noires dans les cellules hôtes (figure 1). La clarté des inclusions de fluorescence manque peut être exploitée pour l'identification automatiqu...

Discussion

Nous décrivons ici la stratégie expérimentale pour générer des cellules hôtes fluorescents pour de vrai visualisation et l'analyse des inclusions de Chlamydia temps. Cette approche vacuole de visualisation confère la capacité puissante pour éclairer, de suivre et de mesurer quantitativement les propriétés dynamiques des inclusions à Chlamydia dans les populations de cellules ou dans des cellules individuelles au fil du temps. Inclusions de Chlamydia dans les cellules de protéine marqu?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
Opti-Mem	Invitrogen	31985
Polybrene	Sigma	H9268
0.45 µm filters	Fisher	09-719D
G418	Invitrogen	10131
HBSS	Invitrogen	14025
DMEM	Invitrogen	11995
RPMI 1640	Invitrogen	11875
RPMI 1640 w/o phenol red	Cellgro	17-105-CV
Penicillin G	Sigma	13752
Cycloheximide	Sigma	C7698
Glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Chamber slides, Lab-Tek II	Nunc	154526, 154534