Использование флуоресцентных белков для визуализации и количественной<em&gt; Хламидиоз</em&gt; Вакуоли Динамика роста в живых клетках

Резюме

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Аннотация

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C. trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Введение

Инфекционные заболевания, вызванные видов внутриклеточной бактерией Chlamydia вызвать значительное бремя на здоровье населения, в том числе передающихся половым заболевания, воспалительные заболевания тазовых органов, слепота, пневмония и, возможно, атеросклероза ^1-4. Способность Chlamydia, чтобы взаимодействовать с клеткой-хозяином, в пределах вакуоли (называется включение), является критическим фактором для их успешного инфицирования клеток и хостом. Включение роман патогенные отсек, который позволяет рост хламидийной и динамически изменять на протяжении всего 2-3 дней цикла развития хламидий ^5. Облигатных внутриклеточный характер хламидий представляет многочисленные проблемы для научного сообщества, в частности для изучения непосредственно уникальную биологию включения. Основным препятствием является неспособность эффективно визуализировать либо внутриклеточный Chlamydia или их включение люминесцентной подходаES в живых клетках. Недавнее открытие, наконец, показал средства для генерации GFP, выражающую С трахоматис ^6; Однако, этот вывод еще не привело к конкретному маркировки включения. Некоторые методы были описаны для маркировки бактерий и включений ^7,8, но они страдают от недостатков, таких как не-специфичности, мимолетности и восприимчивости к фотообесцвечиванию. Ключевым открытием в нашей группе создана новая стратегия для освещения включение с помощью GFP выражения клеток-хозяев ^9. Эта стратегия рационально использует внутреннюю герметичность включения мембраны молекул больше, чем 520 Da ^10. Когда клетки инженерии стабильно выразить особую цитозольную флуоресцентный белок (например, GFP или mCherry), Chlamydia включений видны с замечательной ясностью их полного исключения флуоресценции. Эта обратная стратегия изображений позволяет немедленно визуализации включений для всех Хлamydia видов и она может быть легко адаптирована для большинства клеток-хозяев, представляющих интерес. В качестве демонстрации своей полезности, этот метод был использован ранее, чтобы выявить и определить пути выхода клеточные для Chlamydia SPP ^9.

Здесь мы также продемонстрировать, как этот метод выполняется, и может быть использовано для получения ключевых количественных данных о динамике роста включение. Кроме того, она может эффективно заменить дорогие на основе антител методами подсчета и может быть использован в сочетании с другими флуоресцентными метками, такими как mKate2 экспрессирующих Chlamydia ^11. Это мощное сочетание средств позволяет исследование физических свойств мембраны хламидийной включения внутри живых клетках-хозяевах.

протокол

1. Генерация Люминесцентная линий клеток-хозяев

1. День 1. Тарелка 293T клетки (или другой ретровируса упаковочная линия) на 6-луночных планшетах в 2 х 10 ^{6 клеток} / лунку, чтобы быть ~ 75% сливной следующий день. При желании плиты дублирующие лунки для каждой ретровируса, которые будут использоваться.
2. День 2. Аспирируйте клетки и добавить 2 мл свежей среды роста (DMEM + 10% FBS + 2 мМ L-глутамина). Трансфекции клеток с 5-8 мкг каждого из ретровирусного вектора (содержащий GFP) и упаковки вектора (например., PVSVg) с использованием Lipofectamine 2000 или аналогичный реагент и следующей инструкции производителя.
3. Инкубируйте клетки с ДНК в течение 4-6 часов в 37 ° C _CO 2 инкубаторе, а затем заменить среду с 1 мл ростовой среды.
4. Инкубируйте клетки в течение 48 ч в 37 ° C инкубаторе _СО 2.
5. День 3. Пластинчатые клетки-мишени (например,., HeLa) на 6-луночных планшетах в приближенной плотности ¹⁰ 5 клеток / лунку, чтобы быть ~ 50% сливнойна следующий день. Проверка положительный трансфекции в клетки 293Т путем мониторинга флуоресценции GFP на инвертированный микроскоп.
6. День 4. Сбор ретровируса, содержащего супернатантов выключения 293Т с помощью пипетки и фильтруют супернатанта через 0,45 мкм ацетата целлюлозы шприцевой фильтр.
7. Удалить среды из клеток HeLa и добавить 0,5 мл среды для роста, содержащей 16 мкг / мл полибрена. Добавить ~ 0,5 мл отфильтрованной ретровируса к клеткам каплям и инкубируют клетки в 37 ° C инкубаторе _СО 2 в течение 24 часов. Хранить любые оставшиеся ретровируса (т.е. из колодца дублировать) при 4 ° С.
8. День 5. Если дубликаты скважин были сделаны произвести дополнительный ретровирус, повторите шаг 1,7 серийно заразить остальных ретровирусных частиц.
9. День 6. Прохождение трансфецировали клеток HeLa 1: 1 в 10 см блюдо, содержащее выбора антибиотика (например, 500 мкг / мл неомицина).
10. Подождите достаточно времени для трансдуцированных клеток расти еще в присутствии выбора antibioкрестики, после чего клетки можно размножать с помощью стандартных методик с низкой концентрацией выбора антибиотика (например., 200 мкг / мл неомицина).
    Примечание: Клетки также могут быть клонально выбран для идеального яркости в это время, если это необходимо.

2. Генерация GFP-выразив хламидиоза

1. Подготовка 2x _CaCl 2 буфера (20 мМ Трис рН 7,4, 100 мМ CaCl ₂₎ и 4SP буфер (0,4 М сахарозы, 16 мМ Na ₂ HPO _4).
2. День 1. размораживайте С. трахоматис акций на льду и сразу же разбавить 10 мкл бактерии в 50 мкл 2x _CaCl 2 буфера. Добавить 3 мкг плазмидной ДНК (например., ПАСК-GFP-mKate2-L2), хорошо перемешать и выдержать в течение 30 мин при 25 ° С.
3. На этом этапе, подготовить клеток-хозяев trypsinizing Т-75 колбу McCoy клеток в центрифужную пробирку. Центрифуга клеточной суспензии в 50 мкг в течение 5 мин и отбросить супернатант. Resuspenд осадок клеток в соответствующий объем 1x _CaCl 2 буфера с получением конечной концентрации 4 х 10 ⁷ клеток / мл.
4. После 30 мин инкубации (со стадии 2.2), добавьте 100 мкл приготовленных McCoy клетки преобразования смеси трубки (общий объем 200 мкл) и инкубируют еще 20 мин при 25 ° С. Добавить 100 мкл этой смеси трансформированных клеток в одной скважине из 6-луночного планшета и накладки с среды 2 мл питательной. Инкубируют при 37 ° С в _СО 2 инкубаторе в течение 2 дней.
5. День 3. Lyse Маккой клеток, инфицированных C. трахоматис путем замены среды с 1 мл дН _{2 O} и очищая клетки с изогнутой 1000 мкл пипетки чаевые. Добавить 1 мл буфера 4SP и передать суспензии через иглу 27,5 G ~ 5 раз для эффективного лизиса клеток и освобождения С. трахоматис.
6. Передача 2 мл клеточного лизата, содержащего С трахоматис к Т-75 колбу, содержащую сливающийся монослой недавно покрытием МаккOy клетки; добавить 8 мл DMEM (без FBS) и инкубируют в течение 2 ч при 25 ° С, чтобы позволить C. трахоматис придерживаться клеток.
7. Вытяжку клетки и добавить свежую среду роста с добавлением 10 ед / мл пенициллина G и 1 мкг / мл циклогексимид. Инкубируйте колбы в течение 48 ч в инкубаторе с 37 ° С _СО 2.
8. День 4. Проверьте с помощью световой микроскопии, что клетки инфицированного и включения содержат отклоняющееся Chlamydia. Определить включений в виде ярких вакуолей на стандартную светового микроскопа, и аберрантных органов Chlamydia как кольцевых объектов в включений, которые диаметр больше, чем 2 мкм.
9. День 5. Lyse культура, заменив среду с 2 мл дН _{2 O} и очистить клетки в суспензии. Добавить 2 мл буфера 4SP и передать суспензии через иглу 27,5 G ~ 5 раз.
10. Использование 2 мл лизата клеток заразить свежий монослой клеток McCoy в одной скважине в 6-луночный планшет. Инкубируйте клетки с лизатом в течение 2 ч при 25 ° C, аспирации и добавить свежий ростсреда, содержащая пенициллин G и циклогексимид.
11. Инкубируйте клетки в инкубаторе 37 ° С _СО 2 в течение 3-5 дней, в зависимости от общего состояния здоровья клеток.
12. Повторите шаги 2.9-2.10 один или более раз, при необходимости, пассирования культур в свежих скважин в 6-луночного планшета до обычного вида включений (лишенные аберрантных органов) появились. В это время использовать перевернутую флуоресцентного микроскопа, чтобы проверить, что С. трахоматис выразить mKate2 (красный).
13. Масштаб зараженные культуры для генерации с высоким титром запасов хламидийной, например, путем сбора Chlamydia трансформантов из инфицированных McCoy или HeLa клеток, выращенных в колбах Т-150.

3. Заражение клеток с Chlamydia

1. Пластинчатые GFP-HeLa клетки на желаемой культуры судна, например со стеклянным дном посуды или камерных горками для визуализации с высоким разрешением, или 24-луночных планшетах для IFU определения и многоямного скрининга.
2. Оттепель сюдадзен трубки, содержащей С трахоматис, С. muridarum или C. пневмонии на льду и разбавляют в HBSS до желаемой множественности инфекции (MOI), например МВД = 1.
3. Выполнение либо статические или центрифугированием автоматизированного инфекций на основе штамма Chlamydia частности, которая будет использоваться.
   1. Для инфекций с C. трахоматис LGV серовар L2 или С. muridarum, мыть GFP-HeLa клетки и инкубируют HBSS разбавленными бактерий в течение 2 ч при 25 ° С. Аспирируйте и промыть клетки с HBSS и инкубировать клеток в среде роста в 37 ° C инкубаторе _СО 2.
   2. Для инфекций с Хламидийной серовара D или C. пневмонии, мыть GFP-HeLa клеток с HBSS и добавить разведенные бактерии к клеткам. Поместите Multiwell тарелку или блюдо со стеклянным дном (крепится лентой в многоямного крышкой плиты) в многоямного держателя пластины крепления ротора в Бакет в настольный центрифуге.
   3. Центрифуга клетки при 900 мкг при 25 ° С в течение 1 часа.
   4. Удалить из культуры сосуды центрифуги и место в инкубаторе 37 ° С _СО 2 в течение 1 часа.
   5. Аспирируйте клетки в области биобезопасности кабинета, мыть клетки дважды HBSS и добавить свежую среду роста. Место клеток в 37 ° С _СО 2 инкубатора.

4. живых клеток Визуализация Chlamydia включений

1. Удалить зараженные Chlamydia GFP-HeLa клетки от _СО 2 инкубатора и замените среду с RPMI без фенола красного + 5% FBS.
2. Mount клетки на перевернутой флуоресцентного микроскопа (Nikon Eclipse Ti-E или аналогичного), используя 20X или выше масла цель в.
3. Использование ПО изображений (Volocity 6 или подобное), сосредоточиться и определить хламидиоз инфицированных GFP-клетки HeLa: зеленые клетки, содержащие большие черные дыры (Chlamydia включений).
4. Отметьте XYZ расположение областей, содержащих Chlamydia -infected клетки интерес, используя программное обеспечение обработки изображений (Томocity 6 или аналогичный). Выполните это вручную 'Добавление Points ", а в режиме просмотра XY Stage. Таким образом, координаты XYZ сохраняется для каждого отмеченного местоположения.
5. В диалоговом окне Настройка Acquisition, настроить программное обеспечение, чтобы получить зеленый (GFP, HeLa цитозоля) и красный (mKate2, хламидийной) каналов, а в размере новых кадров на канал каждые 5 мин.
6. Приобретать последовательность изображения, используя приобретение введенный выше протокол, нажав кнопку "Capture / запись".

5. Количественный параметров роста включение в живых клетках

1. В нужное время после заражения (например,., 24, 48 HPI) удалить Хламидиоз инфицированных GFP-клетки HeLa из инкубатора и смонтировать на перевернутом флуоресцентного микроскопа. Примечание: Цель 20X 40X или воздуха с высокой NA лучше подходит для 24-луночных планшетах и ​​масла цель 40X рекомендуется для камеры слайдов. Рост клеток на подложке или на этой задницеай.
2. Сосредоточьтесь на midplanes клеток, где включений в их максимального диаметра и дают четкие края.
3. Получение изображений для многих областях в каждую лунку (минимум на 10 скважины); скважины, как правило, представляют собой экспериментальные повторов или переменные.
4. Перечислять количество включений вручную, на глаз (включения черные отсеки в GFP-HeLa клеток) или использовать программные алгоритмы визуализации для автоматического определения и подсчета включений.
   1. Найти GFP-клетки HeLa от интенсивности флуоресценции ('Найти объекты »команду) и отрегулируйте порог интенсивности флуоресценции на основе относительных интенсивностей клеток.
   2. Фильтр Выбранные объекты, использующие принципы размера сохранить эти только больше, чем 5 мкм ^2. Это и есть "население 1.
   3. Применить "залатать дыры в объектах" команду, используя "население 1 'в качестве входа. Этот шаг создает "население 2 '.
   4. Вычтите "население 1" с "рopulation 2 ', чтобы получить положительно отмечены Chlamydia включений, обозначенные как "населения 3.
   5. Применение размер фильтр 'населения 3' ('фильтр' командной населения), например, сохраняя объектов больше, чем 25 мкм ² для включений в клетках, инфицированных в течение 24 ч или дольше. Для ранних времен инфекции, такие как до 18 часов, установите размер фильтра, чтобы сохранить объекты, превышающие 4 ^мкм 2, так как эти включения являются намного меньше. Результаты фильтрации Размер в популяции объектов, обозначенных как "включений".
   6. Рассчитать количественные данные из изображений, например, номер включения, размер включений и окружность включение, с помощью программного обеспечения визуализации.

Результаты

Клетки млекопитающих, выражающие цитозольные флуоресцентные белки (например, GFP) могут быть сконструированы для того, чтобы освещение Chlamydia включений в живых, инфицированных клеточных культурах. После инфицирования Chlamydia включений хорошо видны как черные пятна в клетках...

Обсуждение

Здесь мы опишем экспериментальный стратегии для генерации флуоресцентных клеток-хозяев для реального визуализации и анализа Chlamydia включений времени. Этот подход вакуоль визуализация дает мощные возможности для освещения, отслеживать и количественно измерить динамические свой?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
Opti-Mem	Invitrogen	31985
Polybrene	Sigma	H9268
0.45 µm filters	Fisher	09-719D
G418	Invitrogen	10131
HBSS	Invitrogen	14025
DMEM	Invitrogen	11995
RPMI 1640	Invitrogen	11875
RPMI 1640 w/o phenol red	Cellgro	17-105-CV
Penicillin G	Sigma	13752
Cycloheximide	Sigma	C7698
Glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Chamber slides, Lab-Tek II	Nunc	154526, 154534