Un método de expansión de GMPc aplicable para agregados de Neural humano madre y células progenitoras derivadas de células madre pluripotentes o tejido cerebral fetal

Resumen

Este protocolo describe un nuevo método de cortar mecánico que permite la expansión de la madre y de células progenitoras neurales agregados esféricos sin disociación a una única suspensión de células. Mantener el contacto célula / célula permite un crecimiento rápido y estable durante más de 40 pasajes.

Resumen

Una técnica de expansión de células para acumular grandes cantidades de células a partir de una sola muestra para experimentos de investigación y ensayos clínicos se beneficiaría en gran medida a la comunidad de células madre. Muchos métodos actuales de expansión son laboriosos y costosos, y los que implican la disociación completa pueden causar varios tipos madre y células progenitoras a someterse a la diferenciación o la senescencia temprana. Para superar estos problemas, hemos desarrollado un método de pases mecánica automática que se refiere como "cortar" que es simple y de bajo costo. Esta técnica evita la disociación química o enzimática en células individuales y en su lugar permite la expansión a gran escala de suspensión, cultivos de esferoides que mantienen el contacto célula / célula constante. El método de cortar se ha usado principalmente para células derivadas de cerebro fetal neurales progenitoras o neuroesferas, y recientemente ha sido publicado para su uso con células madre neurales derivadas de células madre pluripotentes embrionarias e inducidos. El procedimiento involvES siembra neuroesferas en un cultivo de tejidos plato de Petri y posteriormente pasa a una, la cuchilla afilada estéril a través de las células de la automatización de manera efectiva el tedioso proceso de manualmente disociar mecánicamente cada esfera. La suspensión de células en cultivo proporciona una relación superficie-área-volumen favorable; como más de 500.000 células pueden ser cultivadas en una sola neuroesfera de menos de 0,5 mm de diámetro. En un matraz T175, más de 50 millones de células pueden crecer en cultivos en suspensión en comparación con sólo 15 millones en cultivos adherentes. Es importante señalar que el procedimiento de cortar ha sido utilizada bajo buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP), que permite la producción de cantidades masivas de productos celulares de grado clínico.

Introducción

Hay una larga historia de la expansión de las células madre neurales de roedores en la cultura, ya sea como una monocapa ^1-3 o ^4-7 neuroesferas agregados. Además, las células progenitoras neurales humanas (hNPCs) aisladas a partir de diversas regiones del sistema nervioso central en desarrollo ^8-17 han sido expandidas in vitro. Estas células son bi-potentes, capaces de diferenciarse en astrocitos y neuronas y han sido una herramienta muy útil en el estudio del desarrollo neural ^18,19 y las enfermedades mecanismo de ^20,21. hNPCs también se han trasplantado en muchos modelos animales diferentes de enfermedad del sistema nervioso central con diferentes niveles de integración, la supervivencia y efectos funcionales ^22-24.

Tradicionalmente, roedor o NPC derivadas de fetos humanos están expuestos a factores de crecimiento - factor de frecuencia de crecimiento epidérmico (EGF) y / o factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF-2) ^25-28 - y tanto adherente ²⁹ y tresSistemas de esferoide-dimensionales se pasan típicamente usando disociación enzimática en una suspensión de una sola célula ^30-34. El método estándar para expandir las células para la investigación o el uso clínico es como una monocapa adherente debido a la fácil manipulación. Sin embargo, hemos demostrado que los pases en monocapa y de neuroesferas con hNPCs enzimática o soluciones químicas resultaron en la senescencia temprana ^35. Además, la disociación enzimática puede dar lugar a mayores niveles de diferenciación y anomalías del cariotipo basados ​​en datos demostrados con células madre embrionarias ^36-38. Aunque el método estándar de hNPCs pases ha producido buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP) productos de calidad que han pasado a la fase 1 de pruebas clínicas (Stem Cells Inc., Neuralstem Inc.), el método permite únicamente un par de rondas de amplificación de células, lo que limita la banca potencial.

Está claro que los grandes experimentos de investigación y ensayos clínicos futuros podrían beneficiarse de la capacidad depropagar células en grandes cantidades y con el retraso en la senescencia para permitir el crecimiento a gran escala y de bancos de células. Para satisfacer esta necesidad, hemos desarrollado una forma novedosa y automatizado de neuroesferas intactos mecánicamente pases por "picar" en pequeños grupos para mantener el contacto de célula a célula. Este método aumenta en gran medida su vida útil ³⁹ y suspensión de cultivo permite un uso más eficiente del espacio de la incubadora en comparación con cultivos en monocapa, como se ve con un método de cultivo del biorreactor 3D alternativa ^40. El protocolo de cortar proporcionado permite la producción de bancos a gran escala a partir de una muestra fetal mayor que el paso 10, una hazaña poco probable utilizando métodos estándar pases. Si bien este método para hNPCs pases es poco convencional, que está creciendo en popularidad y fue recientemente publicado con otros tipos de células, como las células madre neurales derivadas de células madre pluripotentes inducidas de embriones humanos y, lo que permite la expansión a gran escala para diversas aplicaciones incluyendo en vitro modelado enfermedad ^41-46. Es importante destacar que un cGMP grado banco de células hNPC ya se ha producido con el método de cortar, lo que demuestra que la técnica se puede aplicar a futuras aplicaciones clínicas.

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Protocolo

1. Declaración de Seguridad y ética

1. Este procedimiento implica el uso de productos de cultivo de células derivadas de seres humanos o animales. Todos los tejidos derivados deben ser aprobados antes de su uso por la Junta de Revisión Institucional apropiada (s) y / o el Cuidado de Animales y el empleo Comisión (s) Institucional.
2. Todo biológicos peligrosos los residuos deben eliminarse de acuerdo con las normas de seguridad adoptada por la institución respectiva. Conocer y seguir todas las pautas de seguridad y eliminación apposite durante todo este procedimiento.

2. Preparación de Equipos, Suministros, reactivos y Observaciones

1. Preparación
   1. Obtenga una caja de Petri de vidrio, 8,5 cm de filtro círculos de papel y hojas de preparación de doble filo.
   2. Coloque un pedazo de papel de filtro en la placa de Petri y transferir varias cuchillas sin funda sobre el papel de filtro en la placa de Petri.
   3. En repetidas ocasiones el papel de filtro de capas y hojas hasta que la placa de Petri es más o menos 75% de su capacidad, ingenio cubiertah Petri tapa de la placa y de autoclave. Almacene en un ambiente estéril o cerrada para conservar la esterilidad.
   4. Autoclave 18 cm fórceps y una tuerca-driver autoclavable en una bolsa de esterilización. Para la producción de cGMP, autoclave varios discos cuñas de acero inoxidable en bolsas de esterilización. Para obtener más información sobre el disco calza, consulte el paso 3.5.
   5. Desinfectar el gabinete de bioseguridad (BSC) con 70% de alcohol isopropílico (IPA).
   6. Todos los procedimientos se deben realizar en un BSC para mantener la esterilidad. Transferir asépticamente lo siguiente en el BSC:
      1. McIlwain tejido Chopper (chopper). Limpie todas las superficies con un 70% de IPA, especialmente el brazo de la picadora (fig. 1B). Todo el helicóptero puede ser descontaminado usando óxido de etileno si es necesario.
      2. Una tuerca-driver en autoclave o la tuerca-llave (incluida con el helicóptero, la Figura 1I), uno de 18 cm de fórceps, un conjunto de micropipetas de tamaño estándar (20 l-1, 000 l), uno pipetaid y bastidores de tubo.
      3. Pipetas estériles desechables serológicos, puntas de pipeta de barrera, 15 ml tubos cónicos, 60 mm placas de Petri, hojas de preparación de doble punta y frascos T de tamaño apropiado. PRECAUCIÓN: Sólo manejar las afiladas cuchillas con un fórceps.
2. Reactivos
   1. Expandir hNPCs en el mantenimiento de los medios de comunicación (MM) que consisten de madre neurales medio de expansión de la célula, el EGF a 100 ng / ml y Factor Inhibidor de Leucemia (LIF) a 10 ng / ml. Transfiera los reactivos y el dispositivo (s) de filtración necesarios para preparar los medios de comunicación en el BSC.
   2. Vuelva a suspender el EGF liofilizado utilizando Neural expansión de células madre mediano y preparar alícuotas a 100 mg / ml para almacenar a -80 ° C durante un máximo de 1 año. LIF se almacena como comprar a 4 ° C durante un máximo de 6 meses o la fecha de caducidad indicada por el fabricante.
   3. Transfiera los reactivos MM en el BSC. Combine todos los reactivos en un dispositivo de filtración de tamaño adecuado y el filtro usando un aparato de vacío. Almacenar a 4 ° C durante un máximo de 3 semanas.
3. hNPC Observaciones
   1. Los dos factores más importantes que tratar antes de cortar es diámetro de la esfera y los medios de comunicación acondicionado o color. El medio condicionado (CM) se define como medio que se ha metabolizado por los hNPCs en cultivo bajo condiciones de incubadora (37 ° C, 5% CO _2, 95% de humedad). A medida que las células metabolizan los medios de comunicación del componente rojo fenol se desplazará de un color de rosa a amarillo significa un ambiente más ácido (Figura 5D).
   2. Sostenga el frasco (s) de hNPCs a la luz para hacer frente al color del material (véase la discusión para más detalles).
   3. Escanear a través del frasco con un microscopio para observar las células. Utilice una retícula para examinar el tamaño de la esfera. Si muchas esferas tienen un diámetro de 300 micras o más, continuar con el proceso de cortar. Picar las células cada 7-10 días.
   4. Si una chuleta no está garantizado, cambio de 25 a 75% de la CM con medio fresco cada 3-4 días, dependiendo de la rapidez con que las células están metabolizando los medios de comunicación. Estafacontinuar el intercambio de medios de comunicación hasta que las esferas son lo suficientemente grandes como para pasaje.
   5. hNPCs son típicamente picado en una proporción de 1:02, de los matraces pequeños a matraces más grandes. Utilice la Tabla 1 como guía de referencia para las recomendaciones de tamaño de frasco y volumen.

Frasco	Volumen de los medios de comunicación en total	Pre-Chop	→	Post-Chop
1 T12.5	5 ml	1 T12.5	→	1 T25
1 T25	10 ml	1 T25	→	1 T75
1 T75	20 ml	1 T75	→	1 T175
1 T175	40 ml	1 T175	→	2 T175s
2 T175s	80 ml	2 T175s *	→	4 T175s
* 2 T175s es el número máximo de frascos que se pueden cortar a la vez. Picar en grupos de 2 T175s y consulte el paso 7.

Tabla 1. Paradigma expansión hNPC. Descripción de un plan de expansión típico para hNPCs. Es norma de ampliar de dos veces volumétricamente cada 7-10 días.

3. Configuración Chopper

Figura 1. Cortador de tejidos McIlwain. A) Picar micrómetro ajuste de grosor, base del brazo B) Chopper y brazo unido, C) Enganche el soporte de la placa para la placa de Petri, D) perilla de liberación tabla y la bandeja, E) Mando de control de la fuerza de la hoja, F) interruptor RESET, G Soporte de matrícula), H) Tornillo de fijación de la hoja, cierre y tuerca, I) Llave Tuerca incluido con picador, J) tuerca de la hoja / broche, broche de la hoja K), L ) Mando automatizado de control de velocidad de picar, M) Mando operativo brazo cortar Manual, N) Interruptor de encendido.

1. Conecte el helicóptero a una toma en el BSC y encienda el interruptor de alimentación (Figura 1 N). Establezca la distancia de picar a 200 micras (Figura 1A). Ajuste la fuerza de la cuchilla a 270 ° o 09:00 si el mando era un reloj (Figura 1E). Confirme que la perilla de velocidades automática se gira en sentido contrario en la medida de lo posible. (Figura 1L).
2. Mueva la liberación mesa todo el camino a la derecha confirmar el soporte de la placa es estable (Figura 1D).
3. Gire el manumanipulador al brazo hacia la derecha para levantar el brazo a su nivel máximo (Figura 1M). El brazo manipulador manual sólo debe ser girado en sentido horario.
4. Transferir asépticamente un, cuchilla de picar de doble filo estéril sobre el perno de brazo helicóptero usando un par de pinzas (Figura 1H).
5. Llene esta sección sólo para cGMP pases, como el plato de Petri por sí sola es suficiente para el procesamiento de grado de investigación. Como se ha indicado en el paso 2.1.4, se requieren discos shim colocados en el interior de la base de placa de Petri para GMPc. El disco cuña impide fragmentos de plástico de la incorporación a las esferas durante el procedimiento de cortar. Para cada chuleta planeado, transferir un disco cuña en la base de cada placa de Petri y la cubierta.
6. Asépticamente colocar el broche (Figura 1K) sobre la hoja utilizando las pinzas. La porción curvada del gancho debe ser sobre el borde superior del brazo. El cierre no se quedará en el brazo hasta que la tuerca se ha formado de manera segura. Utilice las pinzas para sujetar las clasp en el brazo y asegurar la tuerca (Figura 1J) en el perno con la tuerca-driver estéril. Deje la tuerca de ¼ de vuelta floja.

4. Procedimiento Pre-chop

1. Transferir el volumen recomendado de MM en el nuevo frasco (s) de acuerdo con la Tabla 2, columna C.
2. Transferir asépticamente las células de la incubadora en el BSC. Incline el frasco (s) en un bastidor de tubo (Figura 2A) y dejando que las esferas se asienten en el matraz (s).
3. Una vez instalados, aspirar hasta 12 ml de sobrenadante con 5 ml o 10 ml de pipeta serológica y enjuague todas las esferas de baja adherencia de la superficie del matraz (s). Repita según sea necesario y resolver las esferas entre enjuagues.
4. Transferir el volumen recomendado de CM en el nuevo frasco (s) de acuerdo con la Tabla 2, columna D. Si pases dos o más matraces T175, consulte el paso 7.1.
5. Transferir todo CM restante y las esferas en un nuevo tubo cónico de 15 ml. Permitir que las esferas en síttle y deseche el frasco utilizado (s).
6. Paso Crítico: transferir lentamente las esferas del tubo cónico de 15 ml en el 60 mm placa de Petri o disco cuña en el volumen más bajo posible; 0,1 a 0,5 ml se recomienda (Figura 2B). Mantenga el volumen restante de CM, ya que se utiliza para aclarar las células de la placa posterior a la chuleta. Trate de minimizar la superficie cubierta por los medios de comunicación y las esferas en el plato (Figura 2C).

Figura 2. Preparación Esfera para picar. A) Incline el frasco (s) en contra de un bastidor de tubo o un elemento similar para resolver las esferas en la esquina del matraz. B) Transferir las esferas tan densamente posible del tubo cónico al Petri plato. C) Reunir las esferas del tubo cónico en tél medio de la placa de Petri. D) Remover tanto sobrenadante como sea posible de la parte superior de las esferas agrupadas. E) Difundir las esferas a cabo utilizando el lado de una punta de la micropipeta de plástico. F) Mueva suavemente las esferas a un lado de la piscina esferas. G) Ejemplo de esferas que se han movido a un lado de la piscina para facilitar la eliminación de medios. H) Condensed extienden sobre la placa de Petri, listo para picar. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

7. A continuación, las esferas deben ser condensado por eliminar el sobrenadante transferido sobre en el paso 4.6. Transferir el sobrenadante de nuevo en el tubo cónico de 15 ml con un aerosol barrera de punta de micropipeta (figura 2D), evitar la eliminación de las esferas. Comienza por eliminar la mayor cantidad de medios de comunicación como sea posible de la parte superior del grupo de medios / célula. Cuando no es posiblepara eliminar los medios de comunicación sin esferas, continúe con el siguiente paso.

Columna A		Columna B	Columna C	Columna D	Columna E	Columna F
Pre-Chop Frasco Tamaño	→	Post-Chop Frasco (s) Tamaño	Volumen sugerido de MM para transferir al nuevo frasco (s) antes de la chuleta	Volumen sugerido de CM para transferir al nuevo frasco (s) antes de la chuleta	Volumen sugerido de esferas / medios para transferir a un nuevo frasco (s) post-chop	Volumen final Sembrado / frasco
T12.5	→	T25	5 ml	0 ml	5 ml	10 ml
T25	→	T75	10 ml	0 ml	10 ml	20 ml
T75	→	T175	20 ml	10 ml	10 ml	40 ml
1 T175	→	2 T175s	20 ml por matraz	15 ml por matraz	5 ml por matraz	40 ml
2 T75s	→	4 T175s	20 ml por matraz	17,5 ml por matraz	2,5 ml por matraz	40 ml

Tabla 2. Guía de transferencia de medios pre / post-chop. Volúmenes sugeridos para utilizar durante el proceso de cortar.

8. Corre la piscina a cabo utilizando el lado de la punta de la pipeta para aumentar el área de superficie (Figura 2E).
9. Paso Crítico: Recomienda a la placa de Petri ligeramente hacia usted y utilizar el lado de la punta de la pipeta para suavemente slide todas las esferas a un lado de la piscina (figura 2F, G).
10. Paso crítico: Cuando todas las células han sido reubicadas, inclinar lentamente la placa de Petri la dirección opuesta. Durante el proceso, los medios de comunicación por sí solos fluirán fuera de las esferas. La transferencia de los medios de comunicación de nuevo en el tubo cónico de 15 ml. Eliminación Minimal esfera es aceptable.
11. Utilice el lado de la punta de la pipeta para deslizar suavemente todas las esferas de vuelta al centro de la placa de Petri así que la piscina tiene un diámetro de 0,5-2,4 cm (Figura 2H). Es importante mantener la profundidad de la esfera poco profunda de la piscina. Si la piscina es muy profunda, las esferas simplemente serán dejados de lado durante el troceado. NOTA: El diámetro de la esfera de la piscina no puede ser mayor que 2,5 cm o la hoja pondrá en contacto con los bordes de la placa de Petri, la falta de las células.

5. Procedimiento Chop

1. Transfiera la cápsula de Petri en el soporte de la placa (Figura 1G) y garantizar el platose fija debajo de los ganchos porta placa (Figura 1C).
2. La perilla de liberación tabla tiene muescas donde caben en el engranaje. Utilice la perilla de liberación tabla de deslizar el soporte de la placa a la izquierda para que la hoja está claro de las esferas y bloqueado en el engranaje (Figura 1D).
3. Paso Crítico: Baje el brazo de helicóptero girando el mando manipulador manual (Figura 1M) en sentido horario hasta que la hoja quede en forma plana sobre la placa de Petri. Utilice una mano para presionar hacia abajo en la montaña brazo (Figura 1B) mientras aprieta la tuerca con la llave para tuercas.
4. Pulse el botón de reinicio una vez (Figura 1F). Estabilizar la placa de Petri con una mano mientras gira el mando brazo manipulador automático (Figura 1 L) en sentido horario hasta la posición de 90 ° ó 12:00 si el mando era un reloj. ATENCIÓN: Mantenga los dedos alejados de la hoja en movimiento en todo momento.
5. Pase la hoja totalmente a través de la piscina de esferas. Gire el soporte de la placa90 °.
6. Afloje el tornillo y repita el paso 5.3 a 5.5.
7. Transferir asépticamente la placa de Petri del soporte de la placa en un espacio de trabajo en el BSC.

6. Procedimiento post-chop

1. Primer 10 ml de una pipeta serológica con el CM en el tubo cónico desde el paso 4.6 y luego transferir 1 ml sobre las esferas picadas. Suavemente volver a suspender y transferir a un nuevo tubo cónico de 15 ml. Evite las burbujas y repetir tantas veces como sea necesario para recoger las esferas picadas.
   TIP: Minimizar el raspado de la placa en forma de fragmentos de plástico pueden despegar. Esto no es un problema si utiliza los discos de cuñas de acero inoxidable. Tenga cuidado con las células correspondientes a la parte interior de la pipeta serológica de plástico. Si esto ocurre, las burbujas de aspirado de forma intermitente a través de medios de comunicación en la pipeta para separar las células.
2. Mida el volumen de CM y esferas picadas. Añadir el volumen adecuado de MM para alcanzar el volumen que figuran en el Cuadro 2, columna E.
3. Se tritura elesferas 2-3x para romper los ámbitos vagamente fusionados.
4. Paso Crítico: Alícuota de la suspensión esfera en cada nuevo frasco. Sólo transferir la suspensión esfera en un frasco a la vez, y volver a suspender las esferas entre las transferencias. Alícuotas de frascos múltiples a la vez se traduce en un número desproporcionado de esferas en cada frasco. El volumen final de cada frasco debe ser igual a los volúmenes en la Tabla 2, columna F. Ver el punto 7.2, cuando la siembra de más de dos matraces T175.
5. Retire la tuerca con la tuerca-driver y luego el cierre con las pinzas estériles. Descontaminar apropiadamente con 70% de IPA o equivalente. PRECAUCIÓN: Extraiga la cuchilla de picar sólo se utiliza con un fórceps y deseche en un contenedor de objetos punzantes riesgo biológico.
6. Descontaminar todas las superficies del helicóptero con 70% de IPA.

. 7 Variaciones de proceso - Múltiples Frascos

Hay varias diferencias cuando pases más de dos T175s. El pasos siguientes son alteraciones de la etapa de referencia.

1. Las referencias a la etapa 4.4:
   1. Cuando pases dos T175s, combinar todos los medios de comunicación y las esferas en matraces T175. Permita que las esferas se asiente y luego alícuota del volumen adecuado de CM en cada uno de los nuevos frascos como se indica en la Tabla 2, columna D. Proceda al paso 4.5.
   2. Cuando pases más de dos T175s, obtener un nuevo matraz T175 y la etiqueta como el frasco CM. Paso completo 7.1.1 pero transferir el CM en el matraz CM. Almacenar el matraz en el lado del BSC para ser utilizado para recoger el CM de todos los matraces hasta que todos los frascos han sido picado. A continuación, el CM será igualmente dividió en alícuotas en cada uno de los nuevos matraces.
2. Incremento de referencia 6.4 - Cuando cortar la misma línea celular varias veces, transferir la suspensión esfera cortada en un nuevo matraz T75 esferas marcadas posterior a la chuleta y registrar el volumen transferido. Continuar para combinar las células en estematraz después de cada chuleta y almacenar el matraz en la incubadora a 37 ° C, 5% de CO _2, 95% de humedad. Después de todas las chuletas se han completado, alícuotas de la suspensión esfera en volumen en cada nuevo matraz. Continúe en el paso 6.5.

8. Criopreservación

El siguiente protocolo es para preservar criogénicamente hNPCs.

1. Descongele medio de congelación de células en un baño de agua limpia a 37 ° C y luego almacenar en hielo. Celular medio de congelación se puede alícuotas y se almacenó a -80 ˚ C durante un máximo de 6 meses.
2. Fuego de vidrio esmalte de pipetas Pasteur mediante la rotación de la abertura de la pipeta en una llama. Preparar al menos dos grandes y dos pipetas pulido a fuego pequeño calibre (Figura 3). Las esferas se pueden disociar moviendo desde grandes a pequeñas pipetas calibre.
3. Coloque TrypLE Seleccione en el baño de agua a 37 ° C durante 5 min. Retire y mantenga a temperatura ambiente hasta que esté listo para su uso.

Figura 3. Vidrio fuego pulido Pasteur pipetas. A) Sostenga la pipeta en la parte superior de la llama y el giro con el fin de manera uniforme alrededor de los bordes de la pipeta de vidrio. B) Ejemplo de una pipeta de vidrio pulido al fuego de gran calibre. C) Ejemplo de una pipeta de vidrio pulido al fuego de pequeño calibre.

4. Transferir asépticamente las neuroesferas en el BSC. Permita que las esferas se asienten inclinando el frasco (s) en contra de un bastidor de tubo y enjuagar el fondo del frasco para eliminar las esferas de baja adherencia. Permitir que las esferas se reasentarse.
5. Transfiera todos menos 5-10 ml de CM en un frasco estéril y medir el volumen total. Coloque las esferas restantes y medios de comunicación en un tubo cónico.
6. Después de que todas las células se han asentado, transferir todos menos una pequeña menisco del CM en la botella y sumar los volume.
7. Transfiera asépticamente 5-10 ml de calentado TrypLE Seleccione en el tubo cónico y volver a suspender el sedimento celular. Transferir el tubo cónico en el 37 ° C baño de agua durante 15 a 20 min. Después de 7,5 a 10 min, agitar suavemente el tubo cónico para mezclar.
8. Utilice el volumen cm medida desde el paso 8.5 y preparar un volumen igual de MM. Combine y filtre la CM el 50% y solución MM 50% (solución CM / MM).
9. Transferir asépticamente un colador de 40 micras en un tubo cónico de 50 ml.
10. Cuando la incubación se completa, girar los tubos de 15 ml cónicos para 15 seg a 100 x g.
11. Aspirar con cuidado y deseche el TrypLE Seleccionar y cualquier sustrato fibroso. Deja un pequeño menisco. Añadir suavemente 2-4 ml de CM / MM para diluir el restante TrypLE Select mientras no perturbar el sedimento. Que la presencia de células desprendidas volver a instalarse antes de desechar el lavado.
12. Añadir 2-5 ml CM / MM solución a las esferas de tubo. Disociar las esferas con una pipeta de 5 ml por trituración un máximo de 10 veces. Deje que la ONUesferas disociadas se conforman con 1-2 min. Transferir la suspensión celular disociada en el colador de 40 micras para eliminar racimos totalmente disociadas.
13. Repita el paso 8.12 con un calibre grande pipeta de vidrio pulido al fuego y luego una pipeta de vidrio de pequeño calibre.
14. Enjuague el filtro con 2-5 ml de solución CM / MM.
15. Mezclar la suspensión celular y retirar muestras para el análisis de la viabilidad.
16. Diluir las muestras con azul de tripano en un factor de dilución apropiado y contar. Usar la ecuación estándar a continuación para calcular la concentración media de células viables y calcular las células viables totales.
    
17. Calcular el volumen total de los medios de comunicación celular de congelación necesario para volver a suspender las células en 5,0 x 10 ⁶ células / ml. 1 ml de las células se sembraron en cada criovial. Transfiera los crioviales en el BSC.
18. Centrifugar la suspensión de células a 200 xg durante 5 min a 4 ° C en 15 mtubos l cónicos para mejor rendimiento. Si 50 ml tubos cónicos se utilizan para una congelación a gran escala hacia abajo, aumentar la velocidad y el tiempo a 400 g durante 10 min.
19. Vuelva a suspender el sedimento celular utilizando el medio de congelación de células en 5,0 x 10 ⁶ células / ml. Alícuota 1 ml de suspensión celular en cada criovial. Por Una distribución uniforme, aspirado 6 ml de suspensión y alícuotas 5 crioviales x 1 ml. La transferencia de los restantes 1 ml de suspensión en la agrupación de las células. Repita hasta que todas las ampollas se han llenado.
20. Asépticamente sellar todas crioviales sin semillas y transferirlos en hielo durante 5-10 min.
21. Utilice una de las siguientes estrategias de crioconservación para conservar los hNPCs: Alcohol isopropílico Cámara
    1. Llenar el número requerido de cámara (s) con 100% de IPA a temperatura ambiente.
    2. Transferir los crioviales cabezas de serie de hielo en la cámara (s) y transferir la cámara (s) en un -80 ° C congelador durante la noche. Las células son estables durante hasta una semana a -80 ° C, sin embargo,se sugiere transferir los viales para almacenamiento de nitrógeno líquido a largo plazo al día siguiente.

    Controlado Congelador Cambio

    3. Subir un programa de congelación apropiado para el software del congelador de velocidad controlada. Un programa de ejemplo se muestra en la Tabla 3. Figura 4 muestra una curva de congelación típica para hNPCs. Sin embargo, el programa exacto variará para cada modelo de congelador. La tarifa de la muestra global estándar debe estar cerca de -1 ° C / min hasta alcanzar -40 ° C, donde la velocidad de congelación puede ser aumentado sustancialmente a lo menos -80 º C.

Paso	Tarifa (° C)	Fin de temperatura (° C)	Retención (min seg)	Gatillo
1	-	-	5 min 0 seg	Cámara
2	- 1.3	- 5	-	Muestra
3	-	-	1 min 0 seg	Cámara
4	- 45	- 58	-	Cámara
5	+ 10	- 26	-	Cámara
6	+ 3	- 23	-	Cámara
7	- 0,8	- 40	-	Muestra
8	- 10	- 100	-	Cámara
9	- 35	- 160	-	Cámara

Tabla 3. Pasos para la congelación hNPCs en un r controladacomió congelador. Programa sugerido para hNPC criopreservación en un congelador de velocidad controlada.

Figura 4. Curva de congelación de la muestra. Curva de congelación típica para hNPCs en un congelador de velocidad controlada.

21. 4. Transfiera los crioviales de hielo en los cestos asociados con el congelador de velocidad controlada. Asegúrese de cargar un criovial sólo con medio de congelación de células a utilizar para la sonda de temperatura de la muestra. Transfiera las cestas en la cámara de congelación y colocar la sonda de muestreo en el vial de la sonda. Inicie el programa.
    5. Cuando el protocolo ha completado, la transferencia de los viales en nitrógeno líquido de almacenamiento a largo plazo.

9. Procedimiento de descongelación

El siguiente protocolo es para criogénicamente descongelación phNPCs reservados.

1. Transfiera los crioviales del almacenamiento en nitrógeno líquido inmediatamente en hielo seco. PRECAUCIÓN: Los viales pueden tener grietas o tapas sueltas que permiten nitrógeno líquido para entrar en el vial. Cuando se retira de las condiciones de ultracongelación, el líquido puede hervir, de inmediato la explosión del vial. Use EPP apropiado al retirar los viales.
2. Preparar todos los reactivos y materiales de construcción por debajo antes de tiempo. Una vez que el proceso de descongelación ha comenzado, es crítico para seguir a través de manera eficiente.
   1. Transferencia Neural expansión de células madre Medium, MM, un tubo cónico de 15 ml, 2 ml de uno y uno 10 ml de pipeta serológica para cada criovial en el BSC.
   2. Un mínimo de 9 ml de expansión de células madre neuronales medio y se requiere 5 ml de MM para cada vial. Preparar más de cada medio de comunicación si es necesario.
3. Sólo descongelar un vial de hNPCs a la vez. Transferir las células congeladas de hielo seco en un lugar limpio 37 ° C baño de agua y agitar el vial en el baño de agua continuamente. Monitorear el volumen dehielo que se ha derretido. Cuando hay un pedazo de hielo de aproximadamente 0,5 cm a la izquierda en el vial, rocíe y limpie con un 70% de alcohol isopropílico y transferir en el BSC.
4. Transferir el contenido del criovial a un tubo cónico de 15 ml con una pipeta serológica de 2 ml. Añadir 1 ml de Neural expansión de células madre Medio a la criovial vacío y luego transferir 8 ml de Neural expansión de células madre en medio de las células descongeladas en una lenta, gota a gota, mientras agitando suavemente el tubo. Esto se hace para reducir el riesgo de choque osmótico.
5. Transferir el enjuague de la criovial a los 9 ml de suspensión de células. Transferir el tubo cónico sobre hielo y repita los pasos 9.4 a 9.5 para todos los viales restantes.
6. Centrifugar los tubos cónicos a 200 xg durante 5 min a 4 ° C. Durante la centrifugación, preparar el número apropiado de frascos para la siembra basados ​​en la Tabla 4.

N º de viales	Volumen Siembra total (ml)	Frasco
1	5	T12.5
2	10	T25
3	15	T75
4	20	T75
5	25	T75
6	30	T175
7	35	T175
8	40	T175
8 +	-	Combinación de Frascos

Tabla 4. Tamaños Frasco basado en el número de crioviales descongelados. Volumen sugerido y tamaño matraz para sembrar hNPCs después de la descongelación.

7. Vuelva a suspender y combinar todos los tubos en el volumen apropiado de MM basado en la Tabla 4. Mezclar bien y volvermover una muestra para el conteo de viabilidad. Consulte los pasos 8.15 a 8.16 para el recuento de los detalles. El rango de siembra estándar es entre 160,000-320,000 células / cm ^2.
8. Mezclar las células bien y alícuotas de las células en frascos. Transfiera los frascos a un 5% de CO _2/37 ° C/95% de humedad incubadora. Mezcle el frasco agitando suavemente hacia adelante y hacia atrás para distribuir uniformemente las células.
9. Las células se forman esferas dentro de las 24-48 horas. De vez en cuando las células se adhieren a la superficie de plástico y formar una distribución de colonia en forma de panal. Si esto ocurre, deje las células durante 3 días antes de enjuagar las células sueltas, ayudando en la formación de esferas. Enjuague cada 1-3 días hasta que no queden células adherentes. Si la transferencia necesaria de las células a un nuevo matraz.
10. Cambio de 25-75% de los medios con MM cada 3-4 días hasta que las células están listas para cortar, generalmente 7-14 días después de la descongelación.

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Resultados

El número de células Figura 5. Los datos representativos. A) proyectados de hNPCs congelados en p19, luego descongelados y se expandieron como una monocapa adherente mediante disociación enzimática en comparación con neuroesferas con pases a través del método de cortar. Día 0 representa cuando las células se descongelaron a p20. B)

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Discusión

Figura 6. Esquema de cortar. Expandiendo las células madre esferoide / progenitoras en la cultura con el método de cortar mecánica.

Pasos críticos

Una visión general del paradigma de la expansión de picar se muestra en la Figura 6. HNPC tamaño de la esfera es uno de los ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beaker, 50 ml	Fisherbrand	FB-100-50	multiple manufacturers/suppliers
Bio-Safety Cabinet, class II	Baker	SG-603A	4 ft. or 6 ft. model.  6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers
Blades, Double-edge Prep	Personna	74-0002	multiple manufacturers/suppliers.  CAUTION: Sharp
Cell Freezing Media	Sigma-Aldrich	C6295-50ML	DMSO, serum-free
Centrifuge, swing-bucket with 15 ml inserts	Eppendorf	5810 R	multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 15 ml	Fisherbrand	S50712	multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 50 ml	BD Falcon	352074	multiple manufacturers/suppliers
Controlled Rate Freezer	Planer	Kryo 750	multiple manufacturers/suppliers
Cryovials, 2 ml	Corning	430488	multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T12.5	BD Falcon	353107	multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T25	BD Falcon	353081	multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T175	BD Falcon	353045	multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T75	BD Falcon	353110	multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 L	Millipore	SCGPU11RE	multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 ml	Millipore	SCGVU01RE	multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 ml	Millipore	SCGPU05RE	multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 ml	Millipore	SCGP00525	multiple manufacturers/suppliers
Filter Paper, 8.5 cm circles	Whatman/GE	1001-085
Forceps, Standard Pattern - Serrated/Curved/18 cm	Fine Science Tools	11001-18
Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol	Nalgene	5100-0001	"Mr. Frosty"
Incubator, 37 °C/5% CO2	Forma	370 series	multiple manufacturers/suppliers
Hemacytometer, Phase	Hausser Scientific	1475	multiple manufacturers/suppliers
McIlwain Tissue Chopper	Lafayette Instruments	TC752-PD	Petri dish modification required.   CAUTION:  Moving, sharp blade.
Micropipettor, 1-10 μl	Gilson	F144562	multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 100-1,000 μl (starter kit)	Gilson	F167700	multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 2-20 μl (starter kit)	Gilson	F167700	multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 20-200 μl (starter kit)	Gilson	F167700	multiple manufacturers/suppliers
Nutdriver, Autoclavable, 5/16"	Steritool	10302
Pasteur Pipets, cotton-plugged	Fisherbrand	13-678-8B	multiple manufacturers/suppliers
Petri Dish, Glass, Autoclavable	Corning	3160-100
Pipet Aid	Drummond	4-000-101	multiple manufacturers/suppliers
Shim disc	McMaster-Carr	VARIABLE	multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 10 μl	AvantGuard	AV10R-H	multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 1,000 μl	AvantGuard	AV1000	multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 20 μl	AvantGuard	AV20-H	multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 200 μl	AvantGuard	AV200-H	multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 ml	Fisherbrand	13-676-10J	multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 ml	Fisherbrand	13-675-3C	multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 ml	Fisherbrand	13-676-10K	multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 ml	Fisherbrand	13-676-10H	multiple manufacturers/suppliers
Sterilization Pouches, 19 x 33 cm	Crosstex	SCL	multiple manufacturers/suppliers
Strainer, 40 µm	BD Falcon	352340
Tissue Culture Dishes, 60 mm	BD Falcon	351007
Tube Racks, Interlocking Four-Way	Fisherbrand	03-448-17
Water Bath	Fisherbrand	S52602Q	multiple manufacturers/suppliers
Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents
Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline)	Sigma-Aldrich	S3194-500ML	Important to use the Stemline brand
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Millipore	GF316	multiple manufacturers/suppliers
Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF)	Millipore	LIF1010	multiple manufacturers/suppliers
Trypan Blue (0.4%)	Sigma-Aldrich	T8154-100ML	multiple manufacturers/suppliers
TrypLE Select (1x)	Life Technologies	12563-011