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Erratum Notice

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요약

이 프로토콜은 단일 세포 현탁액 분해없이 구형 신경 줄기 및 전구 세포 응집체의 확장을 허용 신규 기계적 자르고 방법을 설명한다. 세포 / 세포의 접촉을 유지하는 것은 40 구절에 대한 신속하고 안정적​​인 성장을 할 수 있습니다.

초록

실험 연구와 임상 시험을위한 단일 시료로부터 세포의 큰 숫자를 축적하는 셀 확장 기술은 크게 줄기 세포 사회를 유익 것이다. 현재의 많은 확장 방법은 힘들고 비용이 많이 드는, 완전한 분리를 포함하는 여러 줄기 및 전구 세포 유형의 분화 또는 초기 노화를 받아야하는 원인이 될 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 우리는 간단하고 저렴하다 "마"라 자동화 기계류 계대 방법을 개발했다. 이 기술은 단일 세포로 화학 물질 또는 효소 분해를 방지하고 대신 상수 세포 / 세포 접촉을 유지 정지, 회전 타원체 문화의 대규모 확장 할 수 있습니다. 초핑 방법은 주로 태아 뇌 유래 신경 전구 세포 또는 neurosphere를 위해 사용되었으며, 최근 배아 및 유도 된 다 능성 줄기 세포 유래의 신경 줄기 세포를 사용하기 위해 발행되었다. 프로 시저 involv에스 조직 문화 배양 접시에 neurosphere를 파종 이후에 효과적으로 수동으로 기계적으로 각 영역을 해리의 지루한 과정을 자동화 세포를 통해 날카로운, 멸균 블레이드를 전달합니다. 문화의 세포를 일시 중단하면 유리한 표면적 - 부피 비율을 제공한다; 500,000 이상의 세포는 직경이 0.5 mm 미만의 단일 neurosphere 내 성장시킬 수있는. 한 T175 플라스크에서 50 백만 셀은 1500 만 자기편 문화에 비해 서스펜션 문화에서 성장할 수 있습니다. 중요한 것은, 마 절차는 임상 수준의 세포 제품의 대량 수량의 생산을 허용, 현재 좋은 제조 연습 (cGMP의)에서 사용되어왔다.

서문

단층 1-3 또는 집계 neurosphere를 4-7 중 하나로 문화에 쥐 신경 줄기 세포 확장의 긴 역사가있다. 또, 현상 중추 신경계 8-17의 다양한 영역들로부터 격리 된 인간 신경 전구 세포 (hNPCs)는 시험 관내에서 확장되었다. 이 세포는 이중 강력한, 성상 세포 및 신경 세포 모두로 분화 할 수 있으며 신경 발달 (18, 19)과 질병 메커니즘 (20, 21)를 연구에 매우 유용한 도구가되고있다. hNPCs도 통합, 생존 및 기능 효과 22-24 다양한 수준의 중추 신경계 질환의 다양한 동물 모델에 이식되었다.

종종 표피 성장 인자 (EGF) 및 / 또는 섬유 아세포 성장 인자 -2 (FGF-2) 25 ~ 28 - - 및 접착 29 세 모두 전통적 설치류 또는 인간 태아 유래의 NPC가 성장 인자에 노출되어차원 타원체 시스템은 일반적으로 단일 세포 현탁액 30-34로 효소 적 분해를 사용하여 계대된다. 연구 또는 임상 사용을위한 세포를 확장하는 표준 방법은 쉬운 조작에 의한 부착 단층과 같다. 그러나, 우리는 효소 또는 화학 솔루션 계대 단층과 neurosphere hNPCs 초기 노화 35의 결과 것으로 나타났습니다. 또한, 효소 분해는 배아 줄기 세포 36-38 시연 데이터를 기반으로 차별화와 핵형 이상 수준 증가의 원인이 될 수 있습니다. 계대의 hNPCs의 표준 방법은 현재 우수 제조 단계로 1 임상 시험 (세포에게 주식, Neuralstem 주식 줄기) 갈 (의 cGMP) 수준의 제품을 생산하고 있지만,이 방법은 제한, 세포의 증폭 만 몇 라운드를 허용하는 잠재력을 은행.

분명, 많은 연구 실험 및 향후 임상 시험 할 수있는 기능 혜택을 누릴 수대규모 성장 및 세포 은행을 허락 대량 지​​연된 노화와 세포를 전파. 이러한 요구를 해결하기 위해, 우리는 세포 간 접촉을 유지하기 위해 작은 클러스터로 그들을 "마"의 소설 기계적으로 계대 손상을 neurospheres의 자동화 된 방법을 개발했다. 이 방법은 크게 다른 3D 생물 반응기 배양 방법 (40)으로 된 것과 같이 그들의 수명 (39) 및 현탁 배양은, 단층 배양에 비해 인큐베이터 공간을보다 효율적으로 사용할 수있게 증가 하였다. 제공된 마 프로토콜은 통로 (10), 표준 계대 방법을 사용하여 가능성 위업보다 한 태아의 샘플에서 대형 은행의 생산을 할 수 있습니다. 계대의 hNPCs이 방법은 틀에 얽매이지 않는 동안, 인기가 증가하고 있으며, 최근에는 이러한 인간의 배아와 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 신경 줄기 세포 등 다른 세포 유형, V IN 등 다양한 애플리케이션을위한 대규모 확장을 가능으로 출판되었다나이트로 질환 모델링 41-46. 중요한 것은,의 cGMP 급 hNPC 세포 은행은 이미 기술이 미래의 임상 응용으로 적용 할 수 있다는 것을 보여 마 방법으로 생산되고 있습니다.

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프로토콜

1. 윤리 정책 및 안전

  1. 이 절차는 인간 또는 동물 유래의 세포 배양 제품의 사용을 포함한다. 모든 파생 된 조직은 해당 기관 검토위원회 (들) 및 / 또는 기관 동물 케어 및 사용위원회 (들)에 의해 사용하기 전에 승인을 받아야합니다.
  2. 모든 생물의 유해 폐기물은 각각의 기관에서 결정한 안전 규정에 따라 처리해야합니다. 알이 절차를 통해 apposite 안전 및 폐기의 모든 지침을 따르십시오.

장비 2. 준비, 소모품, 시약 및 관찰

  1. 준비하기
    1. 유리 페트리 접시, 8.5 cm의 여과지 원과 더블 에지 준비 블레이드를 얻습니다.
    2. 페트리 접시에 필터 종이를 놓고 페트리 접시에서 필터 용지에 여러 뽑았으니 블레이드를 전송합니다.
    3. 페트리 접시까지 반복 층 필터 종이와 블레이드가 약 75 % 할인, 가득, 커버 재치시간 페트리 접시의 뚜껑과 오토 클레이브. 불임을 유지하기 위해 멸균 또는 밀폐 된 환경에서 보관하십시오.
    4. 압력솥 18cm 집게 및 살균 주머니에서 고압 멸균 너트 드라이버. 의 cGMP 생산을 위해, 살균 주머니에 여러 스테인리스 심 디스크를 압력솥. 심 디스크에 대한 자세한 내용은 단계 5를 참조하십시오.
    5. 70 % 이소 프로필 알코올 (IPA)와 바이오 안전 캐비넷 (BSC)를 소독합니다.
    6. 모든 과정은 무균 상태를 유지하기 위해 BSC에서 수행되어야한다. 무균 BSC로 다음 전송 :
      1. 맥일 웨인 조직 헬기 (헬기). 70 % IPA, 특히 헬기 암 (그림 1B)로 모든 표면을 닦아주십시오. 전체 쵸퍼 필요한 경우 산화 에틸렌을 사용하여 소독 될 수있다.
      2. 한 멸균 너트 드라이버 또는 너트 렌치 (헬기, 그림 1I 포함), 하나 18cm 포셉, 표준 크기 micropipettors (20 μL-1, 000 μL), 하나 pipetaid 및 튜브 랙의 한 세트.
      3. 메마른 처분 할 수있는 혈청 피펫, 장벽 피펫 팁, 15 ML 원뿔 튜브, 60mm 페트리 접시, 더블 에지 준비 블레이드 및 적절한 크기의 T 플라스크. 주의 : 집게로 날카로운 칼날을 처리합니다.
  2. 시약
    1. 100 10 겨 / ㎖에서 NG / ML 및 백혈병 억제 인자 (LIF)에서 셀 확장 매체, EGF 줄기 신경으로 구성된 유지 보수 미디어 (MM)에 hNPCs를 확장합니다. BSC에 용지를 준비하는 데 필요한 시약 및 여과 장치를 전송합니다.
    2. 신경이 셀 확장 중간 줄기와 최대 1 년 -80 ° C에서 저장하는 100 ㎍ / ml로 분주을 준비하여 동결 건조 EGF를 다시하면 일시 중지합니다. 최대 6 개월 제조 업체에 의해 주어진 유효 기간에 대해 4 ° C에서 구입으로 LIF가 저장됩니다.
    3. BSC에 MM 시약을 전송합니다. 진공 장치를 사용하여 적절한 크기의 여과 장치 및 필터에 모든 시약을 배합. 최대 3 주 동안 4 ° C에 보관하십시오.
  3. hNPC 관찰
    1. 마 전에 해결해야 할 가장 중요한 두 요소는 구 직경 미디어 조절이나 색상입니다. 에어컨 미디어 (CM)는 인큐베이터 조건 (37 ° C, 5 % CO 2, 95 % 습도)에서 문화 hNPCs에 의해 대사 된 매체로 정의된다. 세포가 미디어를 대사으로 페놀 적색 성분은보다 산성 환경 (그림 5D)을 상징하는 노란색에 분홍색에서 이동합니다.
    2. (자세한 내용은 설명을 참조) 미디어 색상을 해결하기 위해 빛까지 hNPCs의 플라스크 (들)을 누릅니다.
    3. 세포를 관찰 할 수있는 현미경으로 플라스크를 통해 스캔합니다. 영역의 크기를 검사 레티클을 사용합니다. 많은 분야가 300 μm의 이상의 직경을 갖는 경우도 마 과정을 진행합니다. 7 ~ 10 일마다 세포를 잘라.
    4. 절단이 보장되지 않을 경우, 신선한 미디어마다 3 ~ 4 일 세포가 미디어를 대사하는 방법을 빠르게 따라와 CM의 교환​​ 25~75%. 콘분야는 통로에 충분히 큰 때까지 미디어를 교환하는 tinue.
    5. hNPCs는 일반적으로 작은 플라스크에서 큰 플라스크에 1:2의 비율로 다진됩니다. 플라스크의 크기와 볼륨의 권고 사항 참조 가이드 표 1을 사용합니다.
플라스크 전체 미디어 볼륨 사전 절단 → 포스트 절단
1 T12.5 5 ㎖ 1 T12.5 → 1 T25
1 T25 10 ㎖ 1 T25 → 1 T75
1 T75 20 ㎖ 1 T75 → 1 T175
1 T175 40 ㎖ 1 T175 → 2 T175s
2 T175s 80 ML 2 T175s * → 4 T175s
* 2 T175s는 한 번에 다진 수 있습니다 플라스크의 최대 수입니다. 2 T175s 세트로 잘라 7 단계를 참조하십시오.

표 1. hNPC 확장 패러다임. hNPCs의 일반적인 확장 계획에 대한 설명. 그것은 7 ~ 10 일마다 부피 적으로 두 가지를 확장하는 표준입니다.

3. 단속기 설치

figure-protocol-3365
그림 1. 맥일 웨인 조직 헬기. A)) 페트리 접시, D에 대한 플레이트 홀더에 훅 두께 조정 마이크로 미터, B) 헬기 암베이스와 연결된 팔, C)를 잘라 테이블 해제 손잡이와 트레이헬기, J) 블레이드 / 걸쇠 너트, K) 잎 걸쇠, L 포함, E) 잎 힘 조절 손잡이, F) 리셋 스위치, G) 격판 덮개 홀더, 블레이드, 걸쇠 및 너트 H) 볼트 첨부 I) 너트 렌치 ) 자동 마 속도 조절 노브, M) 매뉴얼 마 팔 작동 손잡이, N) 전원 스위치.

  1. BSC에있는 콘센트에 헬기를 연결하고 전원 스위치 (그림 1 N)을 켭니다. 200 ㎛ (그림 1A)에 마 거리를 설정합니다. 노브를 시계 (그림 1E) 인 경우 270 ° 또는 9:00 블레이드의 힘을 설정합니다. 자동 속도 노브까지 반 시계 방향으로 최대한 회전되어 있는지 확인합니다. (그림 1L).
  2. 오른쪽으로 길의 모든 테이블에 자료를 이동 플레이트 홀더 (그림 1D) 안정 확인합니다.
  3. 마뉘를 회전알 팔 조작이 최대 레벨 (그림 1M)에 팔을 높이기 위해 시계 방향으로. 수동 팔 조작은 시계 방향으로 회전해야합니다.
  4. 무균 집게의 쌍 (그림 1H)를 사용하여 헬기 암 볼트에 살균, 양날 자르고 잎을 전송합니다.
  5. 혼자 페트리 접시의 연구 수준의 처리를위한 충분한으로 만의 cGMP 통과에 대해이 단계를 완료합니다. 단계 2.1.4에서 언급 한 바와 같이, 페트리 접시베이스의 내부에 배치 심 디스크는 cGMP에 필요합니다. 심 디스크는 마 절차를 수행하는 동안 분야로 통합에서 플라스틱 파편을 방지 할 수 있습니다. 각 계획 잘라, 각 페트리 접시와 뚜껑의 기초로 한 심 디스크를 전송할 수 있습니다.
  6. 무균 집게를 사용하여 블레이드에 걸쇠 (그림 1K)를 배치합니다. 버클의 곡선 부분은 팔의 위쪽 가장자리 이상이어야합니다. 너트가 단단히 옛날 될 때까지 걸쇠 팔에 남아되지 않습니다. CLAS를 개최 집게를 사용하여P 팔 위에 및 멸균 너트 드라이버로 볼트에 너트 (그림 1J)를 고정합니다. 느슨한 설정 ¼ 너트를 남겨주세요.

4. 사전 들어온다 절차

  1. 표 2, 열 C에 따라 새로운 플라스크 (들)에 MM의 제안 볼륨을 전송합니다.
  2. 무균 BSC로 인큐베이터에서 세포를 전송합니다. 튜브 랙 (그림 2A)에서 플라스크 (들)을 기대고 분야가 플라스크 (들)에 정착 할 수 있습니다.
  3. 일단 정착, 5 ㎖, 10 ㎖의 혈청 피펫으로 상층 액을 12 mL로 흡인 플라스크 (들)의 표면에서 모든 느슨하​​게 부착 분야를 씻어. 필요를 반복하고 린스의 분야를 정착.
  4. 두 개 이상의 T175 플라스크를 계대 경우. 표 2 열 D에 따라 새로운 플라스크 (들)에 CM의 제안 볼륨을 전송 단계 7.1를 참조하십시오.
  5. 새로운 15 ML 원뿔 관에 남아있는 CM 및 분야를 전송합니다. 분야는 그 자체로 허용ttle 및 사용 플라스크 (들)을 폐기합니다.
  6. 중요한 단계 : 천천히 60mm 페트리 접시 또는 가장 낮은 가능한 볼륨 심 디스크에 15 ML 원뿔 튜브에서 분야를 전송; 0.1 ~ 0.5 ML (그림 2B)를 추천합니다. 그것은 요리 후 절단에서 세포를 씻어하는 데 사용됩니다으로 CM의 나머지 볼륨을 유지하십시오. 접시 (그림 2C)에서 미디어 및 분야에 의해 덮여 표면적을 최소화하려고합니다.

figure-protocol-5813
그림 2.) 플라스크. B의 모서리에있는 분야를 해결 페트리에 원뿔 튜브의 밀도가 가능한 한 분야를 전송하는 튜브 랙 또는 유사한 항목에 대해 플라스크 (들) 린.)을 다지기위한 구체 준비 요리. C) t의 원뿔 튜브의 분야 해변그는 페트리 접시. D의 중간) 풀링 분야의 정상에서 가능한 한 많이 뜨는을 제거합니다. E)) 플라스틱 micropipettor 팁. F의 측면을 사용하여 구체를 확산 부드럽게 수영장의 한쪽으로 분야를 이동 . 미디어 제거를 용이하게하기 위해 수영장의 한쪽으로 이동 한 분야의 G) 예. H) 농축 분야는 다지기위한 준비 페트리 접시에 확산. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 다음으로, 구체 단계 4.6을 통해 전송 뜨는을 제거하여 농축 할 필요가있다. 에어로졸 장벽 팁 micropipettor (그림 2D)로 다시 15 ML 원뿔 튜브에 뜨는을 전송 분야의 제거를 피하십시오. 미디어 / 셀 풀의 상단에서 가능한 한 많은 미디어를 제거하여 시작합니다. 그것은 할 수없는 경우분야하지 않고 용지를 제거하려면 다음 단계를 진행합니다.
열 열 B 열 C 열 D 열 E 열 F
미리 잘라 플라스크 크기 → 포스트 절단 플라스크 (S) 사이즈 새로운 플라스크 (들)을 미리 절단에 전송하는 MM의 추천 볼륨 새로운 플라스크 (들)을 미리 절단에 전송하는 CM의 추천 볼륨 새로운 플라스크 (들) 후 잘라로 전송 분야 / 미디어 추천 볼륨 최종 볼륨 시드 / 플라스크
T12.5 → T25 5 ㎖ 0 ML 5 ㎖ 10 ㎖
T25 → T75 10 ㎖ 0 ML 10 ㎖ 20 ㎖
T75 → T175 20 ㎖ 10 ㎖ 10 ㎖ 40 ㎖
1 T175 → 2 T175s 플라스크 당 20 ㎖ 플라스크에 15 ㎖의 플라스크 당 5 ㎖ 40 ㎖
2 T75s → 4 T175s 플라스크 당 20 ㎖ 플라스크 당 17.5 ㎖의 플라스크 당 2.5 ml의 40 ㎖

표 2. 미디어 전송 가이드 사전 / 사후 들어온다. 제안 된 볼륨은 마 과정에서 사용할 수 있습니다.

  1. 표면적 (도 2E)을 증가시키기 위해 피펫 팁의 측면을 이용하여 풀을 확산.
  2. 중요한 단계 : 당신을 향해 약간 페트리 접시 팁과 온화 SL 피펫 팁의 측면을 사용센터 (도 2 F, G)의 일측에 구체 모두 IDE.
  3. 중요한 단계 : 전체 세포가 이전되었을 때, 서서히 배양 접시에게 역방향 팁. 이 과정에서 단독으로 미디어 멀리 분야에서 흐름을 것입니다. 다시 15 ML 원뿔 관에 미디어를 전송합니다. 최소 영역 제거가 허용됩니다.
  4. 부드럽게 그래서 수영장이 0.5-2.4 cm (그림 2H)의 직경이 다시 페트리 접시의 중심 분야의 모든 슬라이드에 피펫 팁의 측면을 사용합니다. 그것은 구면 풀의 얕은 깊이를 유지하는 것이 중요하다. 수영장이 너무 깊은 경우, 분야는 단순히 자르고 동안 밀려됩니다. 참고 : 영역 풀​​의 직경보다 큰 2.5 cm 수 없습니다 또는 블레​​이드 세포를 누락, 페트리 접시의 가장자리 연락을 드릴 것입니다.

5. 절단 절차

  1. 판 홀더 (그림 1G)에 페트리 접시를 전송하고 요리를 보장판 홀더 후크 (그림 1C)에서 고정된다.
  2. 테이블 해제 손잡이는 기어에 맞는 홈이 있습니다. 그래서 날이 분야의 명확하고 기어 (그림 1D)에 고정 왼쪽에있는 플레이트 홀더를 슬라이드 테이블 해제 손잡이를 사용합니다.
  3. 중요한 단계 : 블레이드 페트리 접시에 평평하게 내려 질 때까지 시계 방향으로 수동 조작 노브 (그림 1M)를 회전하여 헬기 팔을 낮 춥니 다. NUTDRIVER와 너트를 체결하면서 암 마운트 (그림 1B) 아래로 눌러 한 손을 사용합니다.
  4. (그림 1 층)를 한 번 리셋 버튼을 누릅니다. 노브를 시계 인 경우 90 ° 위치 또는 12:00 자동 팔 조작 노브 (그림 1 L)을 시계 방향으로 돌리면서 한 손으로 페트리 접시를 견고하게. 주의 : 멀리 항상 이동 블레이드에서 손가락을 유지.
  5. 분야의 수영장을 완벽하게 칼날을 전달합니다. 판 홀더를 회전90.
  6. 볼트를 풀고 단계 5.3-5.5를 반복합니다.
  7. 무균 BSC의 작업 공간에 접시 홀더에서 페트리 접시를 전송합니다.

6. 후 절단 절차

  1. 수상 후 10 ㎖의 혈청 학적 단계 4.6에서 원뿔 튜브의 CM과 피펫과 다진 분야에 1 ㎖를 전송합니다. 부드럽게 다시 중단하고 새로운 15 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. 거품을 피하고 다진 분야를 수집하는 데 필요한만큼 여러 번 반복합니다.
    TIP : 플라스틱 조각이 들어 올릴 수로 접시를 긁는 최소화합니다. 이것은 스테인레스 스틸 심 디스크를 사용하는 경우 문제가되지 않습니다. 플라스틱 혈청 피펫의 내부에 부착 세포의 조심하십시오. 이 경우 대기음 거품이 간헐적으로 피펫 미디어를 통해 세포를 분리.
  2. CM의 볼륨과 다진 분야를 측정한다. 표 2에 기재된 양, 열 E를 달성 MM의 적절한 양을 추가.
  3. 씹다어떤 느슨하게 융합 분야를 깨고 2 - 3 배를 분야.
  4. 중요한 단계 : 각각의 새로운 플라스크에 구 서스펜션 나누어지는. 한 번에 하나의 플라스크에 구 현탁액을 전송하며, 전송 사이 구체 다시 중단. 한 번에 여러 개의 플라스크를 분취 각 플라스크에있는 분야의 불균형을 초래. 각 플라스크의 최종 부피는 표 2, F 열에서 볼륨을 동일해야합니다. 두 개 이상의 T175 플라스크를 파종 할 때 단계 7.2를 참조하십시오.
  5. 너트 드라이버 및 멸균 집게로 다음 걸쇠와 너트를 제거합니다. 70 % IPA 또는 동등 적절하게 오염을 제거하다. 주의 : 집게로 사용 자르고 잎을 제거하고 바이오 위험 날카로운 물건 용기에 버린다.
  6. 70 %의 IPA와 헬기의 모든 표면의 오염을 제거.

. 7 프로세스의 변화 - 여러 플라스크

두 개 이상의 T175s를 계대 몇 가지 차이점이 있습니다. 단계아래의 참조 된 단계의 변경입니다.

  1. 4.4 단계에 대한 참조 :
    1. 두 T175s를 계대하는 경우, 하나의 T175 플라스크에 미디어 분야를 모두 결합합니다. 표 2에 명시된 분야는 새로운 플라스크에 각각 CM의 적절한 볼륨을 해결하고 나누어지는하려면, 열 D는. 4.5 단계로 넘어갑니다.
    2. 두 개 이상의 T175s를 계대 할 때, CM 플라스크로 새로운 T175 플라스크와 레이블을 얻을 수 있습니다. 단계를 완료 7.1.1하지만 CM 플라스크에 CM을 전송합니다. 모든 플라스크 다진 될 때까지 모든 플라스크로부터 CM을 수집하는 데 사용되는 BSC의 측면에 플라스크를 저장한다. 그 후 CM은 동일하게 새로운 플라스크에 각각 분주합니다.
  2. 참조 단계 6.4 - 같은 세포 라인을 여러 번 자르고 때, 새로운 T75 플라스크 레이블이 분야 후 절단에 다진 구 현탁액을 전송하고 전송 된 양을 기록한다. 이있는 셀을 결합 계속모든 절단 후 플라스크, 37 ° C에서 5 % CO 2, 95 % 습도 배양기에서 플라스크를 저장합니다. 모든 절단이 완료 한 후, 각각의 새로운 플라스크에 볼륨에서 구 현탁액을 나누어지는. 6.5 단계로 진행합니다.

8. 냉동 보존

다음 프로토콜은 저온 hNPCs 보존을위한 것입니다.

  1. 37 ° C에서 깨끗한 물을 욕조에 세포 동결 매체를 해동 한 다음 얼음에 저장합니다. 세포 동결 매체는 최대 6 개월 동안 분주 -80 ˚ C에서 저장할 수 있습니다.
  2. 불꽃의 피펫의 개통을 회전 폴란드어 유리 파스퇴르 피펫을 화재. 준비 크고 두 개의 작은 구멍 화재 광택 피펫 (그림 3) 적어도 두. 분야는 대규모의 작은 구멍 피펫으로 이동하여 분해됩니다.
  3. 5 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 TrypLE 선택을 놓습니다. 제거하고 사용할 준비가 될 때까지 실온에서 보관.

figure-protocol-11633
그림 3. 화재 연마 유리 파스퇴르 피펫.) 순서 큰 구멍 화재 광택 유리 피펫에 균등하게 유리 피펫의 가장자리에 둥근. B)의 예에서 불꽃과 스핀의 상단 부분에 피펫을 잡고. 작은 구멍 화재 광택 유리 피펫 C) 예.

  1. 무균 BSC에 neurosphere를 전송합니다. 분야는 튜브 랙에 플라스크 (들)을 기울고하여 해결하고 느슨하게 부착 구를 제거하려면 플라스크의 바닥을 씻어 수 있습니다. 분야는 재 정착 할 수 있습니다.
  2. 멸균 병에 CM의 모든 만 5 ~ 10 ㎖를 전송하고 전체 부피를 측정한다. 원뿔 튜브에 남아있는 분야와 미디어를 넣습니다.
  3. 모든 세포가 정착 한 후, 병으로 CM의 작은 메 니스 커스 그러나 모든 전송 및 부피를 summate매실.
  4. 무균 전송 원뿔 튜브에 따뜻하게 TrypLE 선택의 5 ~ 10 ㎖를 다시 중단 세포 펠렛. 15 ~ 20 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 원뿔 튜브를 전송합니다. 7.5-10 분 후, 부드럽게 원뿔 튜브가 혼합 흔들어.
  5. 단계 8.5에서 측정 된 CM의 볼륨을 사용하는 MM의 동일한 볼륨을 준비합니다. 50 % CM 50 % MM 솔루션 (CM / MM 솔루션)를 결합하고 필터링 할 수 있습니다.
  6. 무균 50 ML 원뿔 관에 40 ㎛의 여과기를 전송할 수 있습니다.
  7. 배양이 완료되면, 100 X g에서 15 초 동안 15 ml의 원추형 튜브 스핀.
  8. 조심스럽게 대기음 TrypLE 선택하고 실 같은 기판을 폐기합니다. 작은 메 니스 커스 (meniscus)을 남겨주세요. 펠렛을 방해하지 않으면 서 나머지 TrypLE 선택을 희석 CM / MM 4 ㎖ - 부드럽게 2를 추가합니다. 어떤 빠질 세포가 세척을 폐기하기 전에 다시 정착하자.
  9. 2-5 ML의 CM / 튜브 분야에 MM 솔루션을 추가합니다. 10 배의 최대 triturating하여 5 ㎖ 피펫 분야를 떼어 놓다. 유엔에게하자해리 분야는 1 ~ 2 분 동안 정착. 완전히 해리되지 않은 클러스터를 제거하기 위해 40 ㎛의 여과기에 해리 세포 현탁액을 전송합니다.
  10. 화재 광택 큰 구멍 유리 피펫하고 작은 구멍 유리 피펫으로 8.12 단계를 반복합니다.
  11. CM / MM 솔루션의 2 ~ 5 ㎖를 사용하여 여과기를 씻어.
  12. 세포 현탁액을 혼합과 생존 분석을 위해 샘플을 제거합니다.
  13. 적절한 희석 배수에 트리 판 블루로 샘플을 희석하고 계산합니다. 평균 생존 세포의 농도를 계산하고 총 가능한 세포를 계산하기 위해 아래의 표준 방정식을 사용합니다.
    figure-protocol-13154
  14. 5.0 × 10 6 세포 / ML에서 다시 정지 세포에 필요한 세포 동결 매체의 전체 볼륨을 계산합니다. 세포를 1 ml의 각 cryovial으로 시드됩니다. BSC에 cryovials을 전송합니다.
  15. 15m에서 4 ° C에서 5 분 200 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기최고의 수율 L 원뿔 튜브. 50 ㎖ 원뿔형 튜브 아래로 대규모 동결을 위해 사용하는 경우, 10 분 동안 400 XG에 속도 및 시간을 증가시킨다.
  16. 5.0 × 106 세포 / ml로 세포 동결 매체를 이용하여 세포 펠렛을 중단 재. 각 cryovial에 세포 현탁액의 나누어지는 1 ML. 서스펜션과 나누어지는 5 cryovials X 1 ㎖의 균일 한 분포, 대기음 6 ML하십시오. 다시 세포의 풀에 서스펜션의 나머지 1 ㎖를 전송합니다. 모든 병이 가득 될 때까지 반복합니다.
  17. 무균 모든 시드 cryovials을 봉인하고 5 ~ 10 분 동안 얼음에 전송할 수 있습니다.
  18. 이소 프로필 알코올 상공 회의소 : hNPCs을 유지하기 위해 냉동 보존 전략에 대해 다음 중 하나를 사용
    1. 실온에서 100 % IPA와 챔버의 요구 번호 (들)를 입력합니다.
    2. 챔버 (들)에 얼음에서 시드 cryovials를 전송하고 하룻밤 -80 ° C 냉동고에 챔버 (들)을 전송합니다. 세포는하지만, -80 ° C에서 최대 1 주일 동안 안정그것은 다음 날 장기 액체 질소 저장에 유리 병을 전송하는 것이 좋습니다.

    제어 속도 냉장고

    1. 제어 속도 냉장고의 소프트웨어에 적절한 동결 프로그램을 업로드 할 수 있습니다. 예를 들어 프로그램이 표 3에 나와 있습니다. 그림 4는 hNPCs의 일반적인 냉동 곡선을 보여줍니다. 그러나, 정확한 프로그램은 각 냉장고 모델에 따라 다를 것입니다. 동결의 비율이 될 수 -40 ° C를 도달 할 때까지 실질적으로 적어도 -80 ° 증가 표준 전체 샘플 속도는 -1 ° C / 분 가까이 있어야 C.
단계 속도 (° C) 최종 온도 (° C) 유지 (분 초) 트리거
1 - - 5 분 0 초 방
2 - 1.3 - 5 - 견본
3 - - 1 분 0 초 방
4 - 45 - 58 - 방
5 + 10 - 26 - 방
6 + 3 - 23 - 방
7 - 0.8 - (40) - 견본
8 - 10 - 100 - 방
9 - 35 - 160 - 방

표 3. 제어 연구에 hNPCs을 동결하기위한 단계냉장고를 먹었다. 제어 속도 냉동고에 hNPC 냉동 보존을위한 추천 프로그램.

figure-protocol-15553
그림 4. 샘플 냉동 곡선. 제어 속도 냉동고에 hNPCs에 대한 일반적인 냉동 곡선.

    1. 제어 속도 냉동고와 관련된 바구니에 얼음에서 cryovials을 전송합니다. 만 셀 미디어 샘플 온도 프로브에 사용하는 동결 한 cryovial을로드해야합니다. 냉동실에 바구니를 전송하고 프로브 유리 병에 샘플 프로브를 배치합니다. 프로그램을 시작합니다.
    2. 프로토콜이 완료되면, 장기 액체 질소에 저장 바이알을 전송.

9. 해동 절차

다음 프로토콜은 해동 저온 피입니다예약 hNPCs.

  1. 즉시 드라이 아이스에 액체 질소 저장에서 cryovials을 전송합니다. 주의 : 작은 유리 병이 균열 또는 액체 질소가 유리 병을 입력 할 수 있도록 느슨하게 뚜껑을 가질 수 있습니다. 깊은 동결 상태에서 제거 될 때, 액체는 즉시 바이알 폭발, 비등 수있다. 튜브를 제거 할 때 적절한 PPE를 사용합니다.
  2. 시간 앞서 아래의 시약 및 소모품을 모두 준비합니다. 해동 과정이 시작되면, 효율적 통해 수행하는 것이 중요합니다.
    1. 신경이 셀 확장 매체, MM, 15 ML 원뿔 관 한 2 ㎖ 한 10 ㎖ BSC에 각 cryovial에 대한 혈청 피펫 줄기 전송합니다.
    2. 신경의 9 ML의 최소 셀 확장 중간 줄기와 MM의 5 ㎖를 각각의 병에 필요합니다. 필요한 경우 각 미디어의 더 많은 준비합니다.
  3. 한 번에 hNPCs의 한 유리 병을 해동. 깨끗하고 37 ° C의 물을 욕조에 드라이 아이스에서 냉동 세포를 전송하고 지속적으로 물을 욕조에 유리 병을 저어. 의 양을 모니터링녹은 얼음. 바이알에 남은 얼음 약 0.5 cm의 조각이있는 경우는 스프레이, 70 % 이소 프로필 알코올로 닦아 BSC로 옮긴다.
  4. 2 ㎖ 혈청 피펫 15 ML 원뿔 관에 cryovial의 내용을 전송합니다. 빈 cryovial에 셀 확장 매체 줄기 신경의 1 ML을 추가하고 속도가 느린에 해동 세포에 세포 확장 중간 줄기 신경 8 ㎖를 전송, 부드럽게 튜브를 흔들어 동안 현명한 방법을 놓습니다. 이 삼투 충격의 위험을 줄이기 위해 수행됩니다.
  5. 세포 현탁액의 10 ml로 cryovial에서 린스를 전송합니다. 얼음에 원뿔 튜브를 전송하고 반복 남아있는 유리 병에 9.4-9.5 단계를 반복합니다.
  6. 4 ℃에서 5 분 200 XG에서 원뿔 튜브를 원심 분리기 원심 분리하는 동안, 표 4에 따라 시드 플라스크의 적절한 수를 준비합니다.
유리 병 중 총 시드의 양 (㎖) 플라스크
1 5 T12.5
2 10 T25
3 15 T75
4 (20) T75
5 25 T75
6 (30) T175
7 35 T175
8 (40) T175
8 + - 플라스크의 조합

표 4. 해동 cryovials 수에 기반 플라스크 사이즈. hNPCs 후 해동을 시드하는 제안 부피 플라스크의 크기.

  1. 다시 일시 중단하고 표 4에 따라 MM의 해당 볼륨에있는 모든 튜브를 결합한다. 잘 혼합하고 다시생존의 계산을위한 샘플을 이동합니다. 세부 사항을 계산하는 단계 8.15-8.16를 참조하십시오. 표준 시딩 범위 / cm 2 160,000-320,000 셀 사이이다.
  2. 잘 세포를 혼합 플라스크에 세포를 나누어지는. 5 % CO 37분의 2 ° C/95 % 습도 배양기에 플라스크를 전송합니다. 온화 균등 세포를 분산 앞뒤로 흔들어 플라스크 섞는다.
  3. 세포는 24-48 시간 이내에 분야를 형성 할 것이다. 때때로 세포는 플라스틱 표면에 부착하고 벌집 형상 콜로니 분포를 형성 할 것이다. 이 경우, 영역의 형성을 돕는 느슨한 세포를 세척하기 전에 3 일 동안 세포를 둡니다. 더 자기편 세포가 없을 때까지 모든 1~3일 씻어. 새로운 플라스크에 필요한 전송 세포의 경우.
  4. 환율은 MM과 미디어의 모든 3-4일의 25~75%는 세포는 보통 7-14 일이 후 해동을 잘라 준비가 될 때까지.

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결과

figure-results-63
P19 냉동 hNPCs의 그림 5. 대표 데이터.) 예상 세포 수는 다음 해동 마 방법을 통해 계대 neurosphere를 비교하여 효소 분해를 사용하여 부착 단일 층으로 확장. 세포가 P20에 해동했을 때 일 0 나타냅니다. B) 분야의 대표 이미지를 미리 잘라, 구 후 절단, 10X. D)<...

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토론

figure-discussion-63
그림 6. 마 회로도. 기계적 마 방법을 사용하여 문화 구형 줄기 / 전구 세포를 확장.

중요한 단계

마 팽창 패러다임의 개요. hNPC 구면 사이즈을 neurospheres 계대 전에 관찰하는 중요한 기준 중 하나가도 6에 도시된다. ?...

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공개

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 말

우리는 중요한 검토 및 본 보고서의 편집을 위해 박사 Soshana Svendsen은 감사합니다. 이 작품은 NIH / NINDS 1U24NS078370-01 및 CIRM DR2A-05320에 의해 기여했다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Beaker, 50 mlFisherbrandFB-100-50multiple manufacturers/suppliers
Bio-Safety Cabinet, class IIBakerSG-603A4 ft. or 6 ft. model.  6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers
Blades, Double-edge PrepPersonna74-0002multiple manufacturers/suppliers.  CAUTION: Sharp
Cell Freezing MediaSigma-AldrichC6295-50MLDMSO, serum-free
Centrifuge, swing-bucket with 15 ml insertsEppendorf5810 Rmultiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 15 mlFisherbrandS50712multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 50 mlBD Falcon352074multiple manufacturers/suppliers
Controlled Rate FreezerPlanerKryo 750multiple manufacturers/suppliers
Cryovials, 2 mlCorning430488multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T12.5BD Falcon353107multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T25BD Falcon353081multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T175BD Falcon353045multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T75 BD Falcon353110multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 LMilliporeSCGPU11REmultiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 mlMilliporeSCGVU01REmultiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 mlMilliporeSCGPU05REmultiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 mlMilliporeSCGP00525multiple manufacturers/suppliers
Filter Paper, 8.5 cm circlesWhatman/GE1001-085
Forceps, Standard Pattern - Serrated/Curved/18 cmFine Science Tools11001-18
Freezing Chamber, Isopropyl AlcoholNalgene5100-0001"Mr. Frosty"
Incubator, 37 °C/5% CO2Forma370 seriesmultiple manufacturers/suppliers
Hemacytometer, PhaseHausser Scientific1475multiple manufacturers/suppliers
McIlwain Tissue ChopperLafayette InstrumentsTC752-PD Petri dish modification required.   CAUTION:  Moving, sharp blade.
Micropipettor, 1-10 μlGilsonF144562multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 100-1,000 μl (starter kit)GilsonF167700multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 2-20 μl (starter kit)GilsonF167700multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 20-200 μl (starter kit)GilsonF167700multiple manufacturers/suppliers
Nutdriver, Autoclavable, 5/16"Steritool10302
Pasteur Pipets, cotton-pluggedFisherbrand13-678-8Bmultiple manufacturers/suppliers
Petri Dish, Glass, AutoclavableCorning3160-100
Pipet AidDrummond4-000-101multiple manufacturers/suppliers
Shim discMcMaster-CarrVARIABLEmultiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 10 μlAvantGuardAV10R-Hmultiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 1,000 μlAvantGuardAV1000multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 20 μlAvantGuardAV20-Hmultiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 200 μlAvantGuardAV200-Hmultiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 mlFisherbrand13-676-10Jmultiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 mlFisherbrand13-675-3Cmultiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 mlFisherbrand13-676-10Kmultiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 mlFisherbrand13-676-10Hmultiple manufacturers/suppliers
Sterilization Pouches, 19 x 33 cmCrosstexSCLmultiple manufacturers/suppliers
Strainer, 40 µmBD Falcon352340
Tissue Culture Dishes, 60 mmBD Falcon351007
Tube Racks, Interlocking Four-WayFisherbrand03-448-17
Water BathFisherbrandS52602Qmultiple manufacturers/suppliers
Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents
Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline)Sigma-AldrichS3194-500MLImportant to use the Stemline brand
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)MilliporeGF316multiple manufacturers/suppliers
Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF)MilliporeLIF1010multiple manufacturers/suppliers
Trypan Blue (0.4%)Sigma-AldrichT8154-100MLmultiple manufacturers/suppliers
TrypLE Select (1x)Life Technologies12563-011

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Erratum


Formal Correction: Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue
Posted by JoVE Editors on 9/01/2014. Citeable Link.

A correction was made to A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. The corresponding author was changed from:

Brandon C. Shelley

to:

Clive Svendsen

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