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Resumen

El protocolo descrito en el presente documento tiene como objetivo explicar y limite los numerosos obstáculos en el camino de la ruta intrincada que conduce a trifosfatos de nucleósidos modificados. En consecuencia, este protocolo facilita tanto la síntesis de estos bloques de construcción activados y su disponibilidad para las aplicaciones prácticas.

Resumen

La estrategia tradicional para la introducción de funcionalidades químicas es el uso de la síntesis en fase sólida añadiendo precursores de fosforamidita adecuadamente modificados a la cadena naciente. Sin embargo, las condiciones utilizadas durante la síntesis y la restricción de las secuencias más cortas dificultan la aplicación de esta metodología. Por otro lado, trifosfatos de nucleósidos modificados son bloques de construcción que se han empleado para la introducción suave de numerosos grupos funcionales en los ácidos nucleicos, una estrategia que allana el camino para el uso de ácidos nucleicos modificados en una gama de colores amplia de aplicaciones prácticas activan tales como etiquetado funcional y generación de ribozimas y ADNzimas. Uno de los principales desafíos reside en la complejidad de la metodología que conduce al aislamiento y caracterización de estos análogos de nucleósidos.

En este artículo de vídeo, se presenta un protocolo detallado para la síntesis de these análogos modificados utilizando fósforo reactivos (III) con sede en. Además, el procedimiento para su caracterización bioquímica es divulgada, con un énfasis especial en las reacciones de extensión de cebador y polimerización del tizón TdT. Este protocolo detallado será de utilidad para la elaboración de dNTPs modificados y su uso posterior en la biología química.

Introducción

Trifosfatos de nucleósidos 5'-((d) PNT) representan una clase de biomoléculas vitales que están implicadas en incontables procesos y funciones que van desde ser la moneda universal de energía a los reguladores del metabolismo celular. Además de su papel en estas transformaciones biológicas fundamentales, sus homólogos modificados han avanzado como una plataforma versátil y suave para la introducción de grupos funcionales en oligonucleótidos, una metodología que complementa muy bien la síntesis en fase sólida automatizada que por lo general se aplica 1,2. De hecho, siempre que las (d) los PNT pueden actuar como sustratos para ARN y ADN polimerasas 3, una gran cantidad de grupos funcionales que incluyen aminoácidos 4-13, ácidos bórico 14,15, nornbornene 16, residuos diamondoid-17, como parte de las cadenas de organocatálisis 18, los ácidos biliares 19, e incluso oligonucleótidos 20 se puede introducir en oligonucleótidos.

_content "> Más allá de lo que representa un vector conveniente para la funcionalización de los ácidos nucleicos, dNTPs modificados pueden acoplarse en SELEX y otros métodos combinatorios relacionados de selección in vitro para la generación de ácidos nucleicos catalíticos modificados 21-30 y aptámeros para diversas aplicaciones prácticas 10, 31-36. Las cadenas laterales adicionales que se introducen por la polimerización de los dNTPs modificados se cree que aumentar el espacio químico que puede ser explorado durante un experimento de selección y complementar el bien pobre arsenal funcional de ácidos nucleicos 37. Sin embargo, a pesar de estos rasgos atractivos y los recientes progresos realizados en el desarrollo de tanto sintéticos como los métodos de análisis, universalmente aplicable y el procedimiento de alto rendimiento existe para la elaboración de nucleósidos trifosfato modificados 2,38.

El objetivo del presente protocolo es arrojar luz en la (a veces) los procedimientos intrincados líder to la síntesis y caracterización bioquímica de estos bloques de construcción activados (Figura 1B). Se hará especial hincapié en todos los detalles sintéticos que a menudo son difíciles de encontrar o están ausentes en tramos experimentales, pero que son, pero crucial para el buen fin de la ruta sintética que conduce al aislamiento de (d) los PNT puros (Figura 1).

Protocolo

1. Síntesis de los trifosfatos de nucleósido modificado

El enfoque sintético elegido sigue el procedimiento desarrollado por Ludwig y Eckstein ya que este método es generalmente fiable y conduce a muy pocos subproductos secundarios (Figura 1A) 39.

  1. Coevaporate el nucleósido protegido adecuadamente-3'-OAc (típicamente 0,1 mmol) dos veces con piridina anhidra (2 ml) y después se seca a vacío durante la noche. Al mismo tiempo, pirofosfato de tributilamonio seca (0,13 mmol) bajo vacío durante la noche.
  2. Se disuelve el nucleósido en un mínimo de piridina seca (0,2 ml) y añadir dioxano seco (0,4 ml) como codisolvente. Por último, añadir 2-cloro-1, 3,2-benzodioxaphosphorin-4-ona (0,11 mmoles) y dejar reaccionar a temperatura ambiente durante 45 min.
    Nota: Es de destacar que en particular se debe tener cuidado con la 2-cloro-1, 3,2-benzodioxaphosphorin-4-ona reactivo. De hecho, incluso el almacenamiento de este reactivo en virtud de un ambi gas inerteaquí no es suficiente para evitar su descomposición. Por lo tanto, el sólido blanco que se forma en esta descomposición puede y debe ser levantada antes de su uso.
  3. Preparar una solución de pirofosfato de tributilamonio en DMF seca (0,17 ml) y tributilamina recién destilado (58 l; nunca añadir tamices moleculares). Añadir la solución resultante a la mezcla de reacción (un precipitado blanco aparece pero desaparece rápidamente) y dejar reaccionar a temperatura ambiente durante 45 min.
  4. Preparar una solución de yodo (0,16 mmol) en piridina (0,98 ml) y H2O (20 l) y añadir a la mezcla de reacción con el fin de oxidar el Pα (III) central. Deje que la solución oscura resultante en agitación a temperatura ambiente durante 30 min.
  5. Utilice una solución acuosa al 10% de NaS 2 O 3 para inactivar el exceso de I 2. Eliminar el disolvente en vacío (la temperatura del baño de agua del evaporador rotatorio debe mantenerse por debajo de 30 ° C). Añadir H 2 O (5 ml) y permitir que el millasxture en reposo a temperatura ambiente durante 30 min para hidrolizar el resto trifosfato cíclico.
  6. En esta etapa, los grupos protectores se eliminan normalmente (es decir, el 3'-OAc y los grupos en las cadenas laterales de la nucleobase). En consecuencia, añadir NH4OH (30% en H2O, 10 ml) a la crudo y se agita durante 1,5 horas a temperatura ambiente, y eliminar el disolvente bajo vacío.
  7. Añadir 2 ml de H 2 O y se dividió en 2 tubos. Añadir 12 ml de una solución 2% de NaClO 4 en acetona y se centrifuga (1.000 xg) durante 30 min. Este procedimiento se repitió una vez más. Esta precipitación permite la separación de los disolventes y reactivos utilizados en la síntesis de la trifosfato (que precipitará), simplificando de este modo la subsiguiente purificación por RP-HPLC sustancialmente.
  8. Después de aire de secado del residuo aceitoso, grabar un espectro de RMN P-31 de la crudo (siguiendo procedimientos estándar, ver también Lista de Materiales y Figura 3) ydisolver en 4 ml de H2O
    Nota: Este procedimiento de síntesis se centra principalmente en la generación de trifosfatos de desoxinucleósidos modificados, pero un procedimiento muy similar se puede aplicar para sus contrapartes de ARN (por el simple uso de 2 ', 3'-bis-O-acetilado precursores).

2. Purificación por HPLC de los trifosfatos de nucleósido modificado

  1. Preparación de una solución 1 M de stock de bicarbonato de trietilamonio (TEAB): 40
    1. Preparar una solución de 1 mol de trietilamina (139 ml) en ≈ 600 ml de agua destilada y se filtró H 2 O.
    2. Burbuja de CO 2 (a través de hielo seco y un burbujeador de gas) en la solución con agitación vigorosa hasta que se alcanza un pH de 7,6 (esto llevará al menos 10 horas). Esta solución madre se puede almacenar en el refrigerador hasta por un mes.
  2. Purificación:
    1. Prepare dos soluciones tampón de la acción 1 M: 2 L de 50 mM TEAB en agua ultrapura (eluyente A) unND 1 L de 50 mM de TEAB en 50% de MeCN (eluyente B). Degas ambos eluyentes bajo vacío y agitación durante 20 min (se requiere una cuidadosa atención a fin de no alterar el pH mediante la eliminación de CO 2 durante la desgasificación).
    2. Preparar una muestra analítica por disolución de 10 l de la trifosfato de crudo en 300 l de H 2 O destilada y se inyecta en un sistema de HPLC equipado con una columna RP semi-preparativa (C18) y usando un gradiente que varía de 0-100% de B en 40 min (Figura 4). Ajuste el programa de HPLC de acuerdo con el Rt del trifosfato (que normalmente es el pico principal en el cromatograma) y el difosfato (que tiene un R ligeramente inferior t). Se purifica la mezcla bruta mediante estas condiciones y removiendo primeras fracciones que puedan contener algunos difosfato.
    3. Combinar todas las fracciones que contienen el producto y liofilizar (que se prefiere a la evaporación en el evaporador rotatorio con el fin de minimizar la hidrólisis a la diphosph no deseadaate). Coevaporate varias veces con agua ultrapura (para eliminar trietilamina remanente de los eluyentes). Evaluar la pureza del trifosfato por RMN (tanto 1 H y 31 P RMN) y MALDI-TOF por la aplicación de los protocolos estándar (ver Figura 5). Los rendimientos típicos obtenidos mediante la aplicación de este protocolo típicamente se encuentran en el intervalo de 30-70%, dependiendo del sustrato.

3. Primer extensión reacciones y TdT polimerización

  1. Etiquetado extremo 5 'del cebador
    1. Mezclar 30 pmol del cebador apropiado (por ejemplo P1, Lista de Materiales) con 4 l de 10x polinucleótido quinasa tampón (PNK), 3 l de γ-[32 P]-ATP, 1 l de PNK, y ddH2O (por un volumen de reacción total de 40 l). Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante 30 min y después de calor-desactivar la quinasa (10 min a 70 ° C).
    2. Durante la reacción de marcaje prepararuna columna de Sephadex G-10 conectando una punta de pipeta de 1 ml con lana de vidrio silanizada y llenando la punta con una solución de G-10 (10% en ddH2O, en autoclave). Decantar y lavar tres veces con 500 l ddH 2 O y un lavado final con 50 l ddH 2 O. Ejecute la mezcla de reacción a través del G-10 (para eliminar el marcador radioactivo gratis).
    3. Gel de purificar (PAGE 20%) el cebador radiomarcado y recuperarse mediante la aplicación de la aglomeración y remojo método (es decir, la elución con 500 l de una solución acuosa que contiene 1% LiClO 4 y 1 mM de NEt3 (pH 8) a 72 ° C durante 15 min). El etanol y el precipitado G10 desalar el oligonucleótido eluido.
  2. Reacción de extensión del cebador
    1. Recocido 1 pmol de cebador radiomarcado P1, 10 pmol de cebador P1, y 10 pmol de plantilla T1 (Lista de Materiales) en tampón de reacción 10x (suministrado por el proveedor de la polimerasa para ser utilizado) mediante la colocación de la tUbe en (90-95 ° C) de agua caliente y al permitir que se enfríe gradualmente hasta la temperatura ambiente (durante 45 min).
    2. Poner el tubo en hielo y añadir (a su vez) el cóctel de dNTP (que contiene tanto el modificado y los trifosfatos naturales, 100 mM concentración final) y 1 U de la ADN polimerasa (Vent (exo -), de Klenow, de Pwo o 9 ° N m) y completar con agua (para un volumen total de reacción de 20 l). Incubar a la temperatura de trabajo óptima de la enzima (por ejemplo, 60 ° C durante 30 min cuando Vent (exo - se está utilizando)).
    3. Añadir 20 l de solución de parada (formamida (70%), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA; 50 mM), azul de bromofenol (0,1%), cianol xileno (0,1%)), calentar las muestras (95 º C, 5 min), fresco hacia abajo (0 ° C), y resolver por electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida. Visualizar phosphorimager.
  3. Polimerización TdT
    1. Diluir 7 pmol de una sola hebra, Cebador P2 sin marcar (Lista de Materiales), 1 pmol de cebador radiomarcado en 1 l de tampón TdT 10x.
    2. Poner el tubo en hielo y añadir (a su vez) el cóctel de dNTP (a una concentración adecuada comprendida entre 10 y 200 mM) y la TDT de la polimerasa (4 U). Incubar a 37 ° C durante 1 hora. Añadir 10 l de la solución de parada, calentar las muestras (95 ° C, 5 min), enfriamiento (0 º C), y resolver mediante la desnaturalización electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE 15%). Visualizar phosphorimager.

4. PCR con trifosfatos de nucleósidos modificados

  1. Mezclar 8 pmol de tanto la cebadores directo e inverso con 0,5 pmol de la plantilla a amplificar. Añadir 10x tampón de reacción y el cóctel de dNTP (para una concentración final 200 mM) y poner el tubo en hielo. Añadir 1 U de la ADN polimerasa y completa con H 2 O para llegar a un volumen final de 20 l. Transferir la mezcla a un vial de PCR y llevar a cabo 30 ciclos de PCR.
  2. Diluir 6 l con 6 l de tampón de carga 2x sacarosa y resolver por agarosa al 2% (teñido con bromuro de etidio) electroforesis. Visualizar phosphorimager.

Resultados

Trifosfatos de nucleósidos modificados son atractivos objetivos sintéticos ya que permiten la introducción fácil de una gran variedad de grupos funcionales en los ácidos nucleicos 41. Sin embargo, el aislamiento y la caracterización de estos bloques de construcción activados es frecuentemente revelado a ser ardua. En consecuencia, se cree que los resultados que se muestran en este documento para ofrecer una mano de ayuda para seguir los diferentes pasos dentro de los procedimientos sintéticos y bioqu?...

Discusión

La inclusión de las modificaciones en los ácidos nucleicos es de interés para numerosas aplicaciones prácticas, incluyendo el desarrollo de agentes antisentido y antigenes 42,43, el etiquetado y el marcado funcional de oligonucleótidos 41, y en los esfuerzos para ampliar el alfabeto genético 44-46. Las alteraciones químicas y grupos funcionales son por lo general introducidos en ácidos nucleicos mediante la aplicación de protocolos de síntesis en fase sólida estándar y automa...

Divulgaciones

No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (Becas n ° PZ00P2_126430 / 1 y PZ00P2_144595). Prof. C. Leumann se agradece para proporcionar el espacio y equipo de laboratorio, así como por su constante apoyo. La Sra. Sue Knecht se reconoce para un debate fructífero.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
tributylammonium pyrophosphate Sigma AldrichP8533Hygroscopic solid, keep under Ar
2-chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one Sigma Aldrich324124Moisture sensitive
PyridineSigma Aldrich82704Under molecular sieves
DioxaneSigma Aldrich296309Under molecular sieves
dimethylformamide (DMF)Sigma Aldrich40248Under molecular sieves
Acetonitrile Fisher ScientificHPLC grade
TriethylamineSigma Aldrich90342
TributylamineSigma Aldrich90781
ddH2OMilli-Qdeionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC)
Diethylpyrocarbonate (DEPC)Sigma Aldrich159220
D2OCambridge Isotope Laboratories, Inc.DLM-4-25
Biochemical reagents
g-[32P]-ATPHartmann AnalyticsFP-301
Natural dNTPsPromegaU1420
Vent (exo-) DNA polymeraseNEBM0257S
DNA polymerase I, Large (Klenow) FragmentNEBMO210S
9°Nm DNA polymeraseNEBMO260S
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT)PromegaM828A
Pwo DNA polymerasePeqlab01 01 5010
T4 PNKThermo ScientificEK0032
Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%)Serva10679.01
AgaroseApollo ScientificBIA1177
G10 SephadexSigmaG10120
UreaApollo ScientificBIU4110
Equipment
Jupiter semi-preparative RP-HPLC column (5m C18 300Å)Phenomenex
Gene Q Thermal CyclerBioconceptBYQ6042E
PCR vialsBioconcept3220-00
HPLC systemAmersham Pharmacia BiotechÄkta basic 10/100
Oligonucleotides
All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE
5'-CAAGGACAAAATACCTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAAT-AGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGG-ACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles:
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320 – 13330
Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F.

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