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Resumo

O protocolo aqui descrito visa explicar e resumir os numerosos obstáculos no caminho da rota intrincada levando a trifosfatos de nucleosídeos modificados. Consequentemente, este protocolo facilita tanto a síntese desses blocos de construção ativados e sua disponibilidade para aplicações práticas.

Resumo

A estratégia tradicional para a introdução de funcionalidades químicas é a utilização de síntese em fase sólida, anexando precursores fosforamideto adequadamente modificados para a cadeia nascente. No entanto, nas condições utilizadas durante a sintese e a restrição de sequências curtas em vez dificultar a aplicabilidade desta metodologia. Por outro lado, trifosfatos de nucleósidos modificados são activados os blocos de construção que têm sido empregues para a introdução suave de numerosos grupos funcionais nos ácidos nucleicos, uma estratégia que abre o caminho para a utilização de ácidos nucleicos modificados numa paleta ampla de aplicações práticas como marcação funcional e geração de ribozimas e DNAzymes. Um dos maiores desafios reside na complexidade da metodologia conduz ao isolamento e caracterização destes análogos de nucleósidos.

Neste artigo de vídeo, que apresentam um protocolo detalhado para a síntese de these análogos modificados utilizando reagentes baseados em fósforo (III). Além disso, o procedimento para a sua caracterização bioquímica é divulgada, com uma ênfase especial em reações de extensão de primers e polimerização tailing TdT. Este protocolo detalhado será de uso para a elaboração de dNTPs modificados e seu posterior uso em biologia química.

Introdução

Trifosfato 5'-nucleosídeos ((d) PNT) representam uma classe de biomoléculas vitais que estão envolvidos em inúmeros processos e funções que vão desde a ser a moeda universal de energia para os reguladores do metabolismo celular. Em adição ao seu papel nestas transformações biológicas fundamentais, os seus homólogos modificados têm avançado como uma plataforma versátil e leve para a introdução de grupos funcionais em oligonucleótidos, uma metodologia bem que complementa a síntese em fase sólida automatizada, que é normalmente aplicada 1,2. De fato, desde que os (d) PNT pode atuar como substratos para RNA e DNA polimerases 3, uma grande variedade de grupos funcionais, incluindo aminoácidos 4-13, ácidos borónico 14,15, nornbornene 16, resíduos diamantóides-17, como cadeias laterais de organocatálise 18, ácidos biliares, e até 19 oligonucleótidos 20 pode ser introduzido em oligonucleótidos.

_content "> Além de representar um vetor conveniente para a funcionalização de ácidos nucleicos, dNTPs modificados podem ser envolvidos em SELEX e outros métodos combinatórios relacionados de seleção in vitro para a geração de ácidos nucleicos catalíticos modificados 21-30 e aptâmeros para diversas aplicações práticas 10, 31-36. As cadeias laterais adicionais que são introduzidos através da polimerização dos dNTP modificados são pensados ​​para aumentar o espaço químico que pode ser explorada durante uma experiência de selecção e completar o arsenal funcional bastante pobre de ácidos nucleicos 37. No entanto, apesar destas características atraentes e os recentes progressos realizados no desenvolvimento de ambos sintéticos e métodos analíticos, universalmente aplicável e os procedimentos de alto rendimento existe para a elaboração de trifosfatos de nucleosídeos modificados 2,38.

O objetivo do presente protocolo é o de lançar luz sobre a (às vezes) os procedimentos intrincados líder to a síntese e caracterização bioquímica destes blocos de construção activadas (Figura 1B). Especial ênfase será dada em todos os detalhes sintéticos que muitas vezes são difíceis de encontrar ou estão ausentes nas seções experimentais, mas são ainda fundamentais para a conclusão bem sucedida da via sintética levando ao isolamento de pura (d) PNT (Figura 1).

Protocolo

1. Síntese dos nucleósidos modificados Trisfosfatos

A abordagem sintética escolhido segue o procedimento desenvolvido por Ludwig e Eckstein uma vez que este método é geralmente fiável e conduz a muito poucos sub-produtos secundários (Figura 1A) 39.

  1. Coevaporate do nucleósido apropriadamente protegido-3'-OAc (tipicamente 0,1 mmol) duas vezes com piridina anidra (2 ml) e, em seguida, seco sob vácuo durante a noite. Ao mesmo tempo, o pirofosfato de tributilamónio seca (0,13 mmol) sob vácuo durante a noite.
  2. Dissolve-se o nucleósido, num mínimo de piridina seca (0,2 ml) e adiciona-dioxano seco (0,4 ml) como co-solvente. Finalmente, adicionar 2-cloro-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-ona (0,11 mmol) e deixa-se reagir à temperatura ambiente durante 45 min.
    Nota: É de salientar que um cuidado especial deve ser tomado com o 2-cloro-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-um reagente. Na verdade, mesmo de armazenamento deste reagente sob uma atm de gás inerteaqui não é suficiente para evitar a sua decomposição. Assim, o sólido branco que se formou neste decomposição pode e deve ser raspada antes de ser utilizado.
  3. Prepara-se uma solução de pirofosfato de tributilamónio em DMF seca (0,17 mL) e tributilamina recém-destilada (58 ul; nunca adicionar crivos moleculares). Adicionar a solução resultante da mistura de reacção (um precipitado branco, mas aparece rapidamente desaparece) e deixa-se reagir à temperatura ambiente durante 45 min.
  4. Prepara-se uma solução de iodo (0,16 mmol) em piridina (0,98 ml) e H2O (20 mL) e adiciona-se à mistura de reacção, a fim de oxidar o Pα (III) centro. Permitir que a solução escura resultante a agitar à temperatura ambiente durante 30 min.
  5. Usar uma solução aquosa a 10% de NaS 2 O 3 para extinguir o excesso de I2. Remover o solvente sob vácuo (temperatura do banho de água do evaporador rotativo deve ser mantida abaixo de 30 ° C). Adicionar H 2 O (5 mL) e permitir que o mixture em repouso à temperatura ambiente durante 30 minutos para hidrolisar o agrupamento trifosfato cíclico.
  6. Nesta fase, os grupos protectores são geralmente removidos (por exemplo, o 3'-OAc e os grupos nas cadeias laterais de nucleobase). Consequentemente, adicionar NH 4 OH (30% em H2O, 10 ml) para o produto em bruto e agita-se durante 1,5 horas à temperatura ambiente, e remover o solvente sob vácuo.
  7. Adicionar 2 ml de H 2 O e dividida em dois tubos. Adicionar 12 ml de uma solução a 2% de NaClO 4 em acetona e centrifugar (1000 x g) durante 30 min. Este procedimento é repetido mais uma vez. Esta precipitação permite a separação dos solventes e reagentes utilizados na síntese do trifosfato (que irá precipitar), simplificando assim a subsequente purificação por RP-HPLC substancialmente.
  8. Após secagem ao ar do resíduo oleoso, gravar um espectro de 31 P-RMN do produto bruto (seguindo procedimentos padrão, ver também a Lista de Materiais e Figura 3) edissolvem-se em 4 ml de H 2 O.
    Nota: O procedimento sintético centra-se principalmente na geração de desoxinucleotídeos modificados, mas um procedimento muito semelhante pode ser aplicado para as suas contrapartidas de ARN (por simplesmente usando 2 ', 3'-bis-O-acetilado precursores).

2. A purificação por HPLC dos nucleósidos modificados Trisfosfatos

  1. Preparação de uma solução 1 M de bicarbonato de trietilamónio (BTEA): 40
    1. Prepara-se uma solução de 1 mole de trietilamina (139 ml) em ≈ 600 ml de água destilada e filtrada H 2 O.
    2. Borbulhar CO 2 (por meio de gelo seco e um borbulhador de gás) para dentro da solução sob agitação vigorosa, até que um pH de 7,6 foi atingido (isto levará, pelo menos, 10 horas). Esta solução pode ser armazenada na geladeira por até um mês.
  2. Purificação:
    1. Prepare duas soluções tampão do estoque 1 M: 2 l de TEAB 50 mM em água ultrapura (eluente A) umnd 1 L de 50 mM de TEAB em 50% de MeCN (eluente B). Desgaseifica ambos eluentes, sob vácuo e agitação durante 20 min (atenção é necessária de modo a não alterar o pH através da remoção de CO 2 durante a desgaseificação).
    2. Prepara-se uma amostra analítica por dissolução de 10 ul do trifosfato bruto em 300 ml de H2O destilada e injectar no sistema de HPLC equipado com uma coluna RP semi-preparativa (C18) e com um gradiente que varia de 0-100% de B em 40 min (Figura 4). Ajustar o programa de acordo com a HPLC Rt do trifosfato (o que geralmente é o pico principal do cromatograma) e o difosfato (que tem um R ligeiramente inferior t). Purificar a mistura bruta usando essas condições e removendo frações iniciais que possam conter algum difosfato.
    3. Combinar todas as fracções que contêm o produto e liof seco (que é o preferido para a evaporação no evaporador rotativo, a fim de minimizar a hidrólise do diphosph indesejadacomi). Coevaporate várias vezes com água ultrapura (para remover a trietilamina remanescente dos eluentes). Avaliar a pureza do trifosfato por RMN (1 H e ambos 31 P RMN) e MALDI-TOF por aplicação de protocolos padrão (ver Figura 5). Os rendimentos típicos obtidos por aplicação deste protocolo tipicamente estar na gama de 30-70%, dependendo do substrato.

3. As reacções de extensão do primer e TdT Polimerização

  1. Etiquetagem da extremidade 5 'do iniciador
    1. Misturar 30 pmol do iniciador apropriado (por exemplo, P1, Lista de Materiais) com 4 ul de tampão cinase 10x Polinucleótido (PNK), 3 ul de γ-[32 P]-ATP, 1 ul de PNK, e ddH2O (por num volume de reacção total de 40 ul). Incubar a mistura de reacção a 37 ° C durante 30 minutos e depois aquece-desactivar a quinase (10 min a 70 ° C).
    2. Durante a reacção de marcação prepararuma coluna de Sephadex G10, ligando uma ponta de pipeta de 1 ml com a lã de vidro silanizada e enchendo a ponta com uma solução de G10 (a 10% em ddH2O, autoclavado). Girar para baixo e lavar três vezes com 500 ul de ddH2O e uma lavagem final com 50 ul DDH 2 O. Executar a mistura de reacção através do G10 (para remover o marcador radioactivo livre).
    3. Gel de purificar (PAGE 20%) o primer radiomarcado e recuperar por aplicação do método de esmagamento e embeber (isto é, a eluição com 500 mL de uma solução aquosa contendo 1% de LiClO 4 e 1 mM de NEt 3 (pH 8) a 72 ° C durante 15 min). Precipitado em etanol e G10 dessalinizar o oligonucleótido eluída.
  2. Reacção de extensão de iniciador
    1. Hibridar 1 pmol de iniciador marcado radioactivamente P1, 10 pmol de iniciadores P1, e 10 pmol de molde T1 (Lista de Materiais) em tampão de reacção de 10x (fornecido pelo fornecedor da polimerase para ser usado), colocando o tube em (90-95 ° C) de água quente e por se deixar arrefecer gradualmente até à temperatura ambiente (durante 45 minutos).
    2. Colocar o tubo em gelo e adicionar (por sua vez) o cocktail de dNTP (que contém tanto o modificadas e os trifosfatos naturais, 100 uM de concentração final) e 1 U de polimerase de ADN (Ventilação (exo -), de Klenow, ou Pwo N ° 9 m) e completar com água (para um volume de reacção total de 20 ul). Incubar à temperatura óptima de trabalho do enzima (por exemplo, 60 ° C durante 30 min, quando respiradouro (exo -) está a ser usado).
    3. Adicionar 20 ul de solução de paragem (formamida (70%), ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, 50 mM), azul de bromofenol (0,1%), xileno cianol (0,1%)), aquecer as amostras (95 ° C, 5 min), fresco para baixo (0 ° C), e resolver por electroforese em gel desnaturante de poliacrilamida. Visualize por phosphorimager.
  3. Polimerização TdT
    1. Diluir 7 pmol de de cadeia única, Sem rótulo cartilha P2 (Lista de Materiais), 1 pmol de primer radiomarcado em 1 ml de tampão TdT 10x.
    2. Colocar o tubo em gelo e adicionar (por sua vez) o cocktail de dNTP (a uma concentração adequada compreendida entre 10 e 200 mM) e a polimerase de TdT (4 L). Incubar a 37 ° C durante 1 hora. Adicionar 10 ml da solução de paragem, aquecer as amostras (95 ° C, 5 min), arrefecer (0 ° C), e resolver por electroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (PAGE 15%). Visualize por phosphorimager.

4. PCR com nucleosídeos modificados Trisfosfatos

  1. Misturar 8 pmol de ambos os iniciadores directos e inversos com 0,5 pmol do modelo a ser amplificado. Adicionar 10x tampão de reacção e o cocktail de dNTP (para uma concentração final de 200 uM) e colocar o tubo em gelo. Adicionar 1 U de polimerase do ADN e completa com H 2 O para atingir um volume final de 20 ul. Transferir a mistura para um tubo de PCR e realizar 30 ciclos de PCR.
  2. Diluir 6 mL com 6 mL de tampão de carregamento de sacarose 2x e resolver, através de agarose 2% (corados com brometo de etídio) eletroforese. Visualize por phosphorimager.

Resultados

Trifosfatos de nucleosídeos modificados são atraentes alvos sintéticos, uma vez que permitem a introdução fácil de um vasto leque de grupos funcionais em ácidos nucléicos 41. No entanto, o isolamento e caracterização desses blocos de construção é frequentemente activadas revelaram ser difícil. Consequentemente, os resultados aqui apresentados são pensados ​​para oferecer uma mão amiga para acompanhar as diversas etapas dentro dos procedimentos sintéticos e bioquímicos acima mencionados <...

Discussão

A inclusão de modificações nos ácidos nucléicos é de interesse para inúmeras aplicações práticas, incluindo o desenvolvimento de agentes anti-senso e antigène 42,43, rotulagem e etiquetagem funcional de oligonucleotídeos 41, e em esforços para expandir o alfabeto genético 44-46. Alterações químicas e grupos funcionais são geralmente introduzidas em ácidos nucleicos por aplicação de protocolos de síntese em fase sólida padrão e automatizadas. No entanto, os blocos ...

Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela Fundação Swiss National Science (Grants n ° PZ00P2_126430 / 1 e PZ00P2_144595). Prof C. Leumann é reconhecido agradecimento por fornecer o espaço e equipamentos de laboratório, bem como pelo seu apoio constante. Ms. Sue Knecht é reconhecido por discussões frutíferas.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
tributylammonium pyrophosphate Sigma AldrichP8533Hygroscopic solid, keep under Ar
2-chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one Sigma Aldrich324124Moisture sensitive
PyridineSigma Aldrich82704Under molecular sieves
DioxaneSigma Aldrich296309Under molecular sieves
dimethylformamide (DMF)Sigma Aldrich40248Under molecular sieves
Acetonitrile Fisher ScientificHPLC grade
TriethylamineSigma Aldrich90342
TributylamineSigma Aldrich90781
ddH2OMilli-Qdeionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC)
Diethylpyrocarbonate (DEPC)Sigma Aldrich159220
D2OCambridge Isotope Laboratories, Inc.DLM-4-25
Biochemical reagents
g-[32P]-ATPHartmann AnalyticsFP-301
Natural dNTPsPromegaU1420
Vent (exo-) DNA polymeraseNEBM0257S
DNA polymerase I, Large (Klenow) FragmentNEBMO210S
9°Nm DNA polymeraseNEBMO260S
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT)PromegaM828A
Pwo DNA polymerasePeqlab01 01 5010
T4 PNKThermo ScientificEK0032
Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%)Serva10679.01
AgaroseApollo ScientificBIA1177
G10 SephadexSigmaG10120
UreaApollo ScientificBIU4110
Equipment
Jupiter semi-preparative RP-HPLC column (5m C18 300Å)Phenomenex
Gene Q Thermal CyclerBioconceptBYQ6042E
PCR vialsBioconcept3220-00
HPLC systemAmersham Pharmacia BiotechÄkta basic 10/100
Oligonucleotides
All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE
5'-CAAGGACAAAATACCTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAAT-AGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGG-ACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles:
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320 – 13330
Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F.

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