Nucléosidiques Triphosphates - de la synthèse à caractérisation biochimique

Résumé

Le protocole décrit ici vise à expliquer et abréger les nombreux obstacles sur le chemin de la route complexe menant à nucléosides triphosphates modifiés. Par conséquent, ce protocole facilite à la fois la synthèse de ces éléments constitutifs activés et leur disponibilité pour les applications pratiques.

Résumé

La stratégie traditionnelle pour l'introduction de fonctionnalités chimiques est l'utilisation de la synthèse en phase solide par l'ajout de précurseurs des phosphoramidites modifiés de façon appropriée à la chaîne naissante. Cependant, les conditions utilisées lors de la synthèse et de la restriction de séquences assez courtes entravent l'application de cette méthodologie. D'autre part, des triphosphates de nucléosides modifiés sont activés blocs de construction qui ont été utilisées pour l'introduction douce de nombreux groupes fonctionnels dans des acides nucléiques, une stratégie qui ouvre la voie à l'utilisation d'acides nucléiques modifiés dans une palette large d'applications pratiques tels que l'étiquetage fonctionnel et génération de ribozymes et DNAzymes. L'une des principales difficultés réside dans la complexité de la méthode qui conduit à l'isolement et la caractérisation de ces analogues nucléosidiques.

Dans cet article, vidéo, nous présentons un protocole détaillé pour la synthèse des these analogues modifiés en utilisant des réactifs à base de phosphore-(III). En outre, la procédure pour leur caractérisation biochimique est divulguée, avec un accent particulier sur les réactions d'extension d'amorce et TdT polymérisation de résidus. Ce protocole détaillé sera utile pour l'artisanat de dNTP modifiés et leur utilisation ultérieure en biologie chimique.

Introduction

Triphosphates de nucléosides 5'-((d) PNT) représentent une classe de biomolécules vitaux qui sont impliqués dans d'innombrables processus et les fonctions allant d'être la monnaie universelle de l'énergie aux régulateurs du métabolisme cellulaire. En plus de leur rôle dans ces transformations biologiques fondamentaux, leurs homologues modifiés ont avancé comme une plate-forme souple et doux pour l'introduction de groupes fonctionnels dans des oligonucleotides, une méthodologie qui complète bien la synthèse en phase solide automatisée qui est habituellement appliqué ^1,2. En effet, à condition que les (d) PNT peuvent agir en tant que substrats pour ADN et ARN polymérases ^3, une multitude de groupes fonctionnels, y compris les acides aminés ^4-13, acides boroniques ^{14,15, 16,} nornbornene résidus ^{diamondoïde-17,} comme des chaînes latérales pour organocatalyse ^18, les acides biliaires, et même des ¹⁹ oligonucleotides ²⁰ peut être introduit dans des oligonucleotides.

_content "> Au-delà de ce qui représente un vecteur convenable pour la fonctionnalisation d'acides nucléiques, de dNTP modifiés peuvent être engagés dans SELEX et d'autres méthodes combinatoires connexes de sélection in vitro pour la production d'acides nucléiques catalytiques modifiées ^21-30 et les aptamères pour diverses ¹⁰ applications ^{pratiques, 31-36.} Les chaînes latérales supplémentaires qui sont introduites par la polymérisation des dNTP modifiés sont pensés pour augmenter l'espace chimique qui peut être explorée lors d'une expérience de sélection et de compléter l'arsenal fonctionnel plutôt pauvres d'acides nucléiques ^37. Cependant, malgré ces traits attrayants et les progrès récemment accomplis dans le développement de deux méthodes d'analyse et de synthèse, universellement applicable et la procédure à haut rendement existe pour l'artisanat de nucléosides triphosphates modifiés ^2,38.

L'objectif de ce protocole actuel est de faire la lumière dans la (parfois) des procédures complexes menant to la synthèse et la caractérisation biochimique de ces blocs de construction activées (figure 1B). Une attention particulière sera accordée sur tous les détails synthétiques qui sont souvent difficiles à trouver ou sont absents dans les sections expérimentales mais sont encore crucial pour la réussite de la voie de synthèse conduisant à l'isolement de (d) PNT purs (figure 1).

Protocole

Une. Synthèse des nucléosides triphosphates modifiés

L'approche de synthèse choisie suit la procédure mise au point par Ludwig et Eckstein puisque cette méthode est généralement fiable et conduit à très peu de produits secondaires (figure 1A) ^39.

1. Coevaporate le nucléoside 3'-OAc convenablement protégé (typiquement 0,1 mmol) deux fois avec de la pyridine anhydre (2 ml), puis séché sous vide pendant une nuit. Dans le même temps, le pyrophosphate de tributylammonium sec (0,13 mmol) sous vide pendant une nuit.
2. Dissoudre le nucléoside dans un minimum de pyridine anhydre (0,2 ml) et ajouter du dioxane anhydre (0,4 ml) comme co-solvant. Enfin, ajouter le 2-chloro-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one (0,11 mmol) et laisser réagir à température ambiante pendant 45 min.
   Remarque: Il est à noter qu'une attention particulière doit être prise avec le 2-chloro-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-un réactif. En effet, même le stockage de ce réactif dans un Atmosp de gaz inerteici n'est pas suffisante pour empêcher sa décomposition. Ainsi, le solide blanc qui se forme dans cette décomposition peut et doit être gratté avant de l'utiliser.
3. Préparer une solution de pyrophosphate de tributylammonium dans du DMF anhydre (0,17 ml) et de la tributylamine fraîchement distillé (58 pi; jamais ajouter des tamis moléculaires). Ajouter la solution résultante au mélange de réaction (un précipité blanc apparaît mais disparaît rapidement) et laisser réagir à température ambiante pendant 45 min.
4. Préparer une solution d'iode (0,16 mmol) dans de la pyridine (0,98 ml) et H ₂ O (20 pl) et ajouter au mélange réactionnel afin d'oxyder le Pα (III) centre. Laisser la solution foncée résultante sous agitation à température ambiante pendant 30 min.
5. Utilisez une solution aqueuse à 10% des SAR ₂ O ₃ pour étancher l'excès I _2. Eliminer le solvant sous vide (la température du bain de l'évaporateur rotatif, de l'eau doit être maintenue en dessous de 30 ° C). Ajouter _H2O (5 ml) et de permettre à la mixture au repos à température ambiante pendant 30 min pour hydrolyser le groupement triphosphate cyclique.
6. A ce stade, les groupes protecteurs sont habituellement retirés (par exemple la 3'-OAc et les groupes sur les chaînes latérales de la base nucléique). Par conséquent, ajouter NH ₄ OH (30% dans H ₂ O, 10 ml) au brut et on agite pendant 1,5 h à température ambiante, et éliminer le solvant sous vide.
7. Ajouter 2 ml d'H ₂ O et divisée en deux tubes. Ajouter 12 ml d'une solution à 2% de NaClO ₄ dans l'acétone et centrifugation (1000 x g) pendant 30 min. Cette procédure est répétée une fois de plus. Cette précipitation permet la séparation des solvants et des réactifs utilisés dans la synthèse du triphosphate (qui précipitera), ce qui simplifie la purification par RP-HPLC qui suit sensiblement.
8. Après séchage à l'air du résidu huileux, enregistrer un ³¹ spectre du brut P-RMN (suivant les procédures standard, vous pouvez aussi consulter la liste des matériaux et la figure 3) etdissoudre dans 4 ml _de H ₂ O.
   Remarque: Cette procédure synthétique se concentre principalement sur ​​la génération de désoxynucléoside-triphosphates modifiés, mais une procédure très similaire peut être appliquée pour leurs homologues d'ARN (en utilisant simplement 2 ', 3'-bis-O-acétylé précurseurs).

2. Purification HPLC des nucléosides triphosphates modifiés

1. Préparation d'une solution mère de M bicarbonate de triéthylammonium (TEAB) 1: ⁴⁰
   1. Préparer une solution de 1 mole de triéthylamine (139 ml) à ≈ 600 ml d'eau distillée et filtrée H ₂ O.
   2. Bubble CO ₂ (par la glace sèche et un barboteur de gaz) dans la solution sous agitation vigoureuse jusqu'à un pH de 7,6 est atteint (cela va prendre au moins 10 heures). Cette solution stock peut être conservé au réfrigérateur jusqu'à un mois.
2. Purification:
   1. Préparer deux solutions tampons de la 1 M Stock: 2 L mM TEAB 50 dans de l'eau ultra-pure (éluant A)e 1 L de 50 mM TEAB à 50% de MeCN (éluant B). Degas deux éluants sous vide et en remuant pendant 20 min (attention est nécessaire afin de ne pas modifier le pH par l'élimination du CO ₂ au cours de dégazage).
   2. Préparer un échantillon analytique en dissolvant 10 ul de la triphosphate brut dans 300 ul de _H2O distillée et l'injecter dans un système HPLC équipé d'une colonne de RP semi-preparative (C18) et en utilisant un gradient allant de 0 à 100% de B en 40 min (Figure 4). Ajuster le programme de HPLC selon le R _t du triphosphate (qui est habituellement le principal pic sur le chromatogramme) et le diphosphate (qui a un R légèrement inférieur à _t). Purifier le mélange brut utilisant ces conditions et en supprimant les premières fractions qui peuvent contenir certains diphosphate.
   3. Combiner toutes les fractions qui contiennent le produit et le gel sec (ce qui est préféré pour l'évaporation à l'évaporateur rotatif, afin de minimiser l'hydrolyse de l'diphosph indésirablemangé). Coevaporate plusieurs fois à l'eau ultra-pure (pour éliminer la triéthylamine reste de l'éluant). Évaluer la pureté du triphosphate par RMN ⁽¹ H et les deux RMN ³¹ P) et MALDI-TOF par application des protocoles standards (voir figure 5). Les rendements typiques obtenus par application de ce protocole se situent typiquement dans la plage de 30 à 70%, en fonction du substrat.

3. Réactions d'extension d'amorce et TdT polymérisation

1. L'étiquetage de l'amorce 5'-end
   1. Mélanger 30 pmol de l'amorce appropriée (par exemple P1, la liste des matériaux) avec 4 pl de 10x Polynucleotide kinase (PNK) tampon, 3 ul de ^γ-[32 P]-ATP, 1 ul de PNK et le trou DDH ₂ O (pour un volume réactionnel total de 40 ul). Faire incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 30 min et ensuite à la chaleur désactiver la kinase (10 min à 70 ° C).
   2. Au cours de la réaction de marquage se préparerune colonne Sephadex G10 en branchant un embout de pipette de 1 ml avec de la laine de verre silanisée et le remplissage de la pointe avec une solution de G10 (10% dans le trou DDH ₂ O, autoclave). Isoler et laver trois fois avec 500 ul ddH ₂ O et un lavage final avec 50 pi ddH ₂ O. Exécutez le mélange réactionnel à travers le G10 (pour supprimer le marqueur radioactif gratuit).
   3. Gel purifier (PAGE à 20%) et l'amorce radiomarquée récupérée par application de la méthode de trempage et l'écrasement (c'est à dire l'élution avec 500 ul d'une solution aqueuse contenant 1% de LiClO ₄ et 1 mM de NEt ₃ (pH 8) à 72 ° C pendant 15 min). L'éthanol et le précipité G10 éluée dessaler l'oligonucléotide.
2. Réaction d'extension d'amorce
   1. Recuit 1 pmol de l'amorce P1 radiomarqué, 10 pmol d'amorce P1, et 10 pmoles de matrice T1 (Liste des matériaux) 10x dans le tampon de réaction (fourni par le fournisseur de la polymerase doit être utilisé) en plaçant le tube à (90-95 ° C) de l'eau chaude et en laissant refroidir graduellement jusqu'à la température ambiante (en 45 min).
   2. Placer le tube sur la glace et ajouter (à son tour) le cocktail de dNTP (contenant à la fois la mise à jour et les triphosphates naturels, 100 uM concentration finale) et 1 U de l'ADN polymérase (ventilation (exo ^-) Klenow, Pwo ou 9 ° N _m) et avec de l'eau (pour un volume réactionnel total de 20 ul). Incuber à la température optimale de fonctionnement de l'enzyme (par exemple, 60 ° C pendant 30 min lorsque Vent (exo ^-) est utilisé).
   3. Ajouter 20 ul de solution d'arrêt (de formamide (70%), l'acide éthylènediamine (EDTA, 50 mM), le bleu de bromophénol (0,1%), le xylène cyanol (0,1%)), chauffer les échantillons (95 ° C, 5 min), frais vers le bas (0 ° C), et à résoudre par électrophorèse dénaturante sur gel de polyacrylamide. Visualisez phosphorimager.
3. Polymérisation TdT
   1. Diluer 7 pmol de simple brin, Non marqué l'amorce P2 (Liste des Matériaux), 1 pmol de l'amorce radiomarquée dans 1 pl TdT tampon 10x.
   2. Placer le tube sur de la glace et ajouter (à son tour) le cocktail de dNTP (à une concentration suffisante comprise entre 10 et 200 pM) et la polymerase TdT (4 U). Incuber à 37 ° C pendant 1 heure. Ajouter 10 ul de la solution d'arrêt, chauffer les échantillons (95 ° C, 5 min), refroidir (0 ° C), et de résoudre par électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide (PAGE 15%). Visualisez phosphorimager.

4. PCR avec des nucléosides triphosphates modifiés

1. Mélanger 8 pmol à la fois du amorces sens et antisens avec 0,5 pmol de la matrice à amplifier. Ajouter 10x tampon de réaction et le cocktail de dNTP (pour une concentration finale de 200 uM) et de mettre le tube sur de la glace. Ajouter 1 U de l'ADN polymérase et avec H ₂ O pour atteindre un volume final de 20 ul. Transférer le mélange dans un flacon PCR et effectuer 30 cycles de PCR.
2. Diluer avec 6 pi 6 pi de tampon de charge 2x saccharose et résoudre par l'agarose 2% (coloré avec du bromure d'éthidium) électrophorèse. Visualisez phosphorimager.

Résultats

Nucléosides triphosphates modifiés sont séduisantes cibles synthétiques, car ils permettent la mise en place facile d'un vaste éventail de groupes fonctionnels dans des acides nucléiques ^41. Cependant, l'isolement et la caractérisation de ces blocs de construction activés est souvent révélée être difficile. Par conséquent, les résultats présentés ici sont pensés pour offrir un coup de main pour suivre les différentes étapes dans les procédés de synthèse et biochimiques ci-dessus ...

Discussion

L'inclusion des modifications dans les acides nucléiques de l'intérêt pour de nombreuses applications pratiques, y compris le développement de antisens et antigéniques des agents ^42,43, l'étiquetage et le marquage fonctionnelle d'oligonucléotides ^41, et dans les efforts visant à élargir l'alphabet génétique ^44-46. des altérations chimiques et les groupes fonctionnels sont généralement introduits dans des acides nucléiques par l'application de protoc...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tributylammonium pyrophosphate	Sigma Aldrich	P8533	Hygroscopic solid, keep under Ar
2-Chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one	Sigma Aldrich	324124	Moisture sensitive
Pyridine	Sigma Aldrich	82704	Under molecular sieves
Dioxane	Sigma Aldrich	296309	Under molecular sieves
Dimethylformamide (DMF)	Sigma Aldrich	40248	Under molecular sieves
Acetonitrile	Fisher Scientific		HPLC grade
Triethylamine	Sigma Aldrich	90342
Tributylamine	Sigma Aldrich	90781
ddH2O	Milli-Q		deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC)
Diethylpyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	159220
D2O	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-4-25
γ-[32P]-ATP	Hartmann Analytics	FP-301
Natural dNTPs	Promega	U1420
Vent (exo-) DNA polymerase	NEB	M0257S
DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment	NEB	MO210S
9°Nm DNA polymerase	NEB	MO260S
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT)	Promega	M828A
Pwo DNA polymerase	Peqlab	01 01 5010
T4 PNK	Thermo Scientific	EK0032
Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%)	Serva	10679.01
Agarose	Apollo Scientific	BIA1177
G10 Sephadex	Sigma	G10120
Urea	Apollo Scientific	BIU4110
Jupiter semipreparative RP-HPLC column (5μ C18 300 Å)	Phenomenex
Gene Q Thermal Cycler	Bioconcept	BYQ6042E
PCR vials	Bioconcept	3220-00
HPLC system	Amersham Pharmacia Biotech		Äkta basic 10/100
All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE
5'-CAAGGACAAAATAC CTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGA CATCGCCTCTGGGCTA ATAGGACTACTTCTAAT CTGTAAGAGCAGATCC CTGGACAGGCAAGGAA TACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles: Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330 Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F