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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il protocollo qui descritto ha lo scopo di spiegare e abbreviare i numerosi ostacoli nel cammino del percorso intricato portando a nucleosidi trifosfati modificati. Di conseguenza, questo protocollo facilita sia la sintesi di questi blocchi di costruzione attivati ​​e la loro disponibilità per applicazioni pratiche.

Abstract

La strategia tradizionale per l'introduzione di funzionalità chimiche è l'uso di sintesi in fase solida aggiungendo precursori Phosphoramidite opportunamente modificati alla catena nascente. Tuttavia, le condizioni utilizzate durante la sintesi e la restrizione di sequenze piuttosto brevi ostacolano l'applicabilità di questa metodologia. D'altra parte, nucleosidi trifosfati modificati vengono attivati ​​blocchi che sono stati impiegati per l'introduzione mite di numerosi gruppi funzionali in acidi nucleici, una strategia che apre la strada per l'uso di acidi nucleici modificati in una tavolozza ampia di applicazioni pratiche come codifica funzionale e generazione di ribozimi e DNAzymes. Una delle maggiori difficoltà risiede nella complessità della metodologia che porta all'isolamento e caratterizzazione di questi analoghi nucleosidici.

In questo articolo video, presentiamo un protocollo dettagliato per la sintesi di these analoghi modificati utilizzando reagenti a base di fosforo-(III). Inoltre, la procedura per la loro caratterizzazione biochimica di divulgazione, con particolare attenzione alle reazioni del primer e TdT tailing polimerizzazione. Questo protocollo dettagliato sarà di uso per la lavorazione di dNTP modificati e il loro ulteriore utilizzo in biologia chimica.

Introduzione

5'-trifosfato (nucleosidi (d) PTR) rappresentano una classe di biomolecole vitali che sono coinvolti in innumerevoli processi e funzioni che vanno dall'essere la valuta universale di energia regolatori del metabolismo cellulare. Oltre al loro ruolo in queste trasformazioni biologiche fondamentali, loro omologhi modificati hanno avanzato come piattaforma versatile e delicato per l'introduzione di gruppi funzionali in oligonucleotidi, una metodologia che integra piacevolmente la sintesi in fase solida automatizzata che viene solitamente applicato 1,2. Infatti, a condizione che i (d) PTR possono agire come substrati per RNA e DNA polimerasi 3, una ricchezza di gruppi funzionali, tra cui aminoacidi, acidi 4-13 boronici 14,15, nornbornene 16, residui diamondoide-17, come catene laterali per organocatalisi 18, acidi biliari 19, e anche oligonucleotidi 20 può essere introdotto in oligonucleotidi.

_content "> Oltre che rappresenta una comoda vettoriale per la funzionalizzazione di acidi nucleici, dNTPs modificati possono essere impegnati in SELEX e altri metodi combinatori correlate di selezione in vitro per la generazione di modificati acidi nucleici catalitici 21-30 e aptameri per varie applicazioni pratiche 10, 31-36. Le ulteriori catene laterali che vengono introdotti dalla polimerizzazione dei dNTP modificati sono pensati per aumentare lo spazio chimico che può essere esplorato durante un esperimento di selezione e integrare l'arsenale funzionale piuttosto povera di acidi nucleici 37. Tuttavia, nonostante questi tratti interessanti e recenti progressi nello sviluppo sia di sintesi e di analisi, universalmente applicabile e alla procedura ad alto rendimento esiste per la lavorazione di modificati trifosfati nucleosidici 2,38.

L'obiettivo del presente protocollo è quello di far luce nel (a volte) le procedure intricate leader to la sintesi e caratterizzazione biochimica di questi blocchi attivati ​​(Figura 1B). Sarà data particolare enfasi su tutti i dettagli sintetici che spesso sono difficili da trovare o sono assenti nelle sezioni sperimentali, ma sono ancora cruciali per il buon esito del percorso di sintesi che porta all'isolamento di puri (d) PTR (Figura 1).

Protocollo

1. Sintesi dei nucleosidi trifosfati modificati

L'approccio sintetico prescelto segue la procedura sviluppata da Ludwig e Eckstein poiché questo metodo è generalmente affidabile e porta a pochissimi collaterali prodotti (Figura 1A) 39.

  1. Coevaporate nucleoside 3'-OAc protetto adeguatamente (tipicamente 0,1 mmol) due volte con piridina anidra (2 ml) e quindi asciugare sotto vuoto durante la notte. Allo stesso tempo, pirofosfato secco tributylammonium (0,13 mmol) sottovuoto durante la notte.
  2. Sciogliere il nucleoside in un minimo di piridina secca (0,2 ml) e aggiungere diossano secco (0,4 ml) come co-solvente. Infine, aggiungere 2-cloro-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one (0,11 mmol) e lasciare reagire a temperatura ambiente per 45 min.
    Nota: È interessante notare che particolare cura deve essere presa con il 2-cloro-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one reagente. Infatti, anche stoccaggio di questo reagente sotto un atmosp gas inertequi non è sufficiente per evitare la decomposizione. Così, il solido bianco che si forma in questa decomposizione può e deve essere raschiata prima dell'uso.
  3. Preparare una soluzione di tributylammonium pirofosfato a secco DMF (0,17 ml) e tributilammina distillata (58 ml; mai aggiungere setacci molecolari). Aggiungere la soluzione risultante alla miscela di reazione (un precipitato bianco ma scompare rapidamente) e lasciare reagire a temperatura ambiente per 45 min.
  4. Preparare una soluzione di iodio (0,16 mmol) in piridina (0,98 ml) e H 2 O (20 mL) e aggiungere alla miscela di reazione per ossidare il Pα (III) centro. Lasciare la soluzione scura risultante agitazione a temperatura ambiente per 30 min.
  5. Utilizzare una soluzione acquosa al 10% NAS 2 O 3 per placare l'eccesso I 2. Rimuovere il solvente sotto vuoto (temperatura del bagno d'acqua dell'evaporatore rotante deve essere mantenuta al di sotto di 30 ° C). Aggiungere H 2 O (5 ml) e consentire l'kmxture riposare a temperatura ambiente per 30 min per idrolizzare il trifosfato parte ciclica.
  6. In questa fase, i gruppi di protezione vengono solitamente rimossi (cioè il 3'-OAc ei gruppi delle catene laterali del nucleobase). Conseguentemente, aggiungere NH 4 OH (30% in H 2 O, 10 ml) al grezzo e mescolare per 1,5 ore a temperatura ambiente, e rimuovere il solvente sotto vuoto.
  7. Aggiungere 2 ml di H 2 O e suddivisa in 2 tubi. Aggiungere 12 ml di una soluzione al 2% di NaClO 4 in acetone e centrifuga (1000 xg) per 30 min. Questa procedura viene ripetuta ancora una volta. Questa precipitazione consente la separazione dei solventi e reagenti utilizzati nella sintesi del trifosfato (che precipitare), semplificando così la conseguente purificazione con RP-HPLC sostanzialmente.
  8. Dopo l'essiccazione all'aria del residuo oleoso, registrare un 31 P-NMR spettro del grezzo (seguendo le procedure standard, vedere anche elenco dei materiali e figura 3) esciogliere in 4 ml di H 2 O.
    Nota: Questa procedura sintetica concentra principalmente sulla generazione di deossinucleoside trifosfati modificati, ma una procedura molto simile può essere applicato per i loro omologhi RNA (semplicemente utilizzando 2 ', 3'-bis-O-acetilato precursori).

2. HPLC purificazione dei nucleosidi trifosfati modificati

  1. Preparazione di una M soluzione stock di trietilammonio bicarbonato (Teab) 1: 40
    1. Preparare una soluzione di 1 mole di trietilammina (139 ml) in ≈ 600 ml di acqua distillata e filtrata H 2 O.
    2. Bubble CO 2 (tramite ghiaccio secco e un gorgogliatore gas) nella soluzione sotto agitazione vigorosa fino a raggiungere un pH di 7,6 (questo richiederà almeno 10 ore). Questa soluzione madre può essere conservato in frigorifero per fino a un mese.
  2. Purificazione:
    1. Preparare due soluzioni tampone dal magazzino 1 M: 2 L di 50 Teab mM in acqua ultrapura (eluente A)nd 1 L di 50 mM in Teab 50% MeCN (eluente B). Degas due eluenti sottovuoto e agitazione per 20 min (attenzione è richiesta al fine di non alterare il pH rimuovendo CO 2 durante degasaggio).
    2. Preparare un campione da analizzare sciogliendo 10 ml di trifosfato grezzo in 300 ml di H 2 O distillata e iniettare in un sistema HPLC con una colonna RP semi-preparativa (C18) e con pendenza che varia da 0-100% B in 40 min (Figura 4). Regolare il programma HPLC con R t del trifosfato (che di solito è il picco principale sul cromatogramma) e il difosfato (che ha una leggermente inferiore R t). Purificare la miscela grezza utilizzando tali condizioni e rimuovendo prime frazioni che potrebbero contenere qualche difosfato.
    3. Combinare tutte le frazioni che contengono il prodotto e la liofilizzazione (che viene preferito evaporazione nell'evaporatore rotante al fine di minimizzare l'idrolisi alla diphosph indesideratoate). Coevaporate più volte con acqua ultrapura (per rimuovere trietilammina residuo dalle eluenti). Valutare la purezza del trifosfato mediante NMR (sia 1 H e 31 P NMR) e MALDI-TOF applicando protocolli standard (vedere la Figura 5). Le rese ottenute mediante l'applicazione di questo protocollo tipicamente si trovano nell'intervallo 30-70%, a seconda del substrato.

3. Reazioni primer extension e TdT polimerizzazione

  1. Etichettatura 5'-end del primer
    1. Mescolare 30 pmol di primer appropriato (ad esempio P1, elenco dei materiali) con 4 ml di 10x Polinucleotide chinasi (PNK) tampone, 3 ml di γ-[32 P]-ATP, 1 ml di PNK, e DDH 2 O (per un volume di reazione totale di 40 microlitri). Incubare la miscela di reazione a 37 ° C per 30 min e poi termicamente disattivare la chinasi (10 min a 70 ° C).
    2. Durante la reazione di marcatura preparareuna colonna Sephadex G10 inserendo una punta della pipetta da 1 ml con lana di vetro silanizzata e riempiendo la punta con la soluzione G10 (10% in DDH 2 O, autoclave). Spin down e lavare tre volte con 500 microlitri DDH 2 O e un lavaggio finale con 50 microlitri DDH 2 O. Eseguire la miscela di reazione attraverso il G10 (per rimuovere l'etichetta radioattivo gratuito).
    3. Gel purificare (PAGE 20%) il primer radiomarcato e recuperare mediante l'applicazione del metodo di compressione e ammollo (cioè eluizione con 500 ml di una soluzione acquosa contenente 1% LiClO 4 e 1 mM rete 3 (pH 8) a 72 ° C per 15 min). Etanolo precipitato e G10 desalt l'oligonucleotide eluito.
  2. Reazione di primer extension
    1. Anneal 1 pmol di innesco radiomarcato P1, 10 pmol di primer P1, e 10 pmol di modello T1 (elenco dei materiali) in tampone di reazione 10x (fornito dal fornitore della polimerasi da utilizzare) posizionando il tUbe a (90-95 ° C) acqua calda e consentendo di raffreddare gradualmente fino a temperatura ambiente (oltre 45 min).
    2. Mettere la provetta in ghiaccio e aggiungere (a sua volta) cocktail dNTP (contenenti sia modificato e trifosfati naturali, 100 pM concentrazione finale) e 1 U di DNA polimerasi (Vent (exo -), Klenow, Pwo o 9 ° N m) e terminare con acqua (per un volume totale di reazione di 20 microlitri). Incubare alla temperatura ottimale di lavoro dell'enzima (ad esempio 60 ° C per 30 min quando Vent (Exo - viene utilizzato)).
    3. Aggiungere 20 ml di soluzione di arresto (formammide (70%), etilendiamminotetraacetico (EDTA, 50 mm), blu di bromofenolo (0,1%), xilene cyanol (0,1%)), riscaldare i campioni (95 ° C, 5 min), fresco verso il basso (0 ° C), e risolvere da denaturazione elettroforesi su gel di poliacrilammide. Visualizza da phosphorimager.
  3. TdT polimerizzazione
    1. Diluire 7 pmol di singolo filamento, Senza etichetta Primer P2 (Elenco dei materiali), 1 pmol di primer radioattivo in 1 microlitri di buffer TdT 10x.
    2. Mettere la provetta in ghiaccio e aggiungere (a sua volta) il cocktail dNTP (ad un'adeguata concentrazione compresa tra 10 e 200 mM) e la polimerasi TdT (4 U). Incubare a 37 ° C per 1 ora. Aggiungere 10 ml di soluzione di stop, riscaldare i campioni (95 ° C, 5 min), raffreddare (0 ° C), e risolvere da denaturazione elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE 15%). Visualizza da phosphorimager.

4. PCR con modificati nucleosidi trifosfati

  1. Mescolare 8 pmol sia del forward e reverse primer con 0,5 pmol del modello da amplificare. Aggiungere 10x tampone di reazione e il cocktail dNTP (per una concentrazione finale di 200 mM) e mettere la provetta in ghiaccio. Aggiungere 1 U di DNA polimerasi e completo di H 2 O a raggiungere un volume finale di 20 microlitri. Trasferire il composto in una provetta per PCR e di effettuare 30 cicli di PCR.
  2. Diluire 6 ml con 6 ml di 2x tampone di caricamento saccarosio e risolvere per via di agarosio 2% (colorati con bromuro di etidio) elettroforesi. Visualizza da phosphorimager.

Risultati

Nucleosidi trifosfati modificati sono seducenti bersagli sintetici in quanto consentono l'introduzione facile di una vasta gamma di gruppi funzionali in acidi nucleici 41. Tuttavia, l'isolamento e la caratterizzazione di questi blocchi attivato viene rivelano spesso ardua. Di conseguenza, i risultati qui indicati sono pensati per fornire una mano per seguire le varie fasi all'interno delle suddette procedure sintetiche e biochimici (Figura 1B).

In part...

Discussione

L'inclusione di modifiche in acidi nucleici è di interesse per numerose applicazioni pratiche, tra cui lo sviluppo di agenti antisenso e antigene 42,43, l'etichettatura e tagging funzionale di oligonucleotidi 41, e negli sforzi per espandere l'alfabeto genetico 44-46. Le alterazioni chimiche e gruppi funzionali sono generalmente introdotti in acidi nucleici mediante l'applicazione di protocolli di sintesi in fase solida standard e automatizzati. Tuttavia, i mattoni Phosp...

Divulgazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero (Grants n ° PZ00P2_126430 / 1 e PZ00P2_144595). Prof. C. Leumann Si ringrazia per la fornitura di spazi e attrezzature di laboratorio, nonché per il suo costante sostegno. La signora Sue Knecht è riconosciuto per le discussioni fruttuose.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
tributylammonium pyrophosphate Sigma AldrichP8533Hygroscopic solid, keep under Ar
2-chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one Sigma Aldrich324124Moisture sensitive
PyridineSigma Aldrich82704Under molecular sieves
DioxaneSigma Aldrich296309Under molecular sieves
dimethylformamide (DMF)Sigma Aldrich40248Under molecular sieves
Acetonitrile Fisher ScientificHPLC grade
TriethylamineSigma Aldrich90342
TributylamineSigma Aldrich90781
ddH2OMilli-Qdeionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC)
Diethylpyrocarbonate (DEPC)Sigma Aldrich159220
D2OCambridge Isotope Laboratories, Inc.DLM-4-25
Biochemical reagents
g-[32P]-ATPHartmann AnalyticsFP-301
Natural dNTPsPromegaU1420
Vent (exo-) DNA polymeraseNEBM0257S
DNA polymerase I, Large (Klenow) FragmentNEBMO210S
9°Nm DNA polymeraseNEBMO260S
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT)PromegaM828A
Pwo DNA polymerasePeqlab01 01 5010
T4 PNKThermo ScientificEK0032
Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%)Serva10679.01
AgaroseApollo ScientificBIA1177
G10 SephadexSigmaG10120
UreaApollo ScientificBIU4110
Equipment
Jupiter semi-preparative RP-HPLC column (5m C18 300Å)Phenomenex
Gene Q Thermal CyclerBioconceptBYQ6042E
PCR vialsBioconcept3220-00
HPLC systemAmersham Pharmacia BiotechÄkta basic 10/100
Oligonucleotides
All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE
5'-CAAGGACAAAATACCTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAAT-AGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGG-ACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles:
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320 – 13330
Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F.

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