Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada tarif edilen protokol modifiye nükleosit trifosfat yol açan karmaşık güzergah yolunda çok sayıda engeller açıklamak ve kesintiye uğratmak için amaçlamaktadır. Dolayısıyla, bu protokol bu aktive bina bloklarının sentezini ve pratik uygulamalar için onların durumu hem de kolaylaştırır.

Özet

Bir kimyasal fonksiyonelliğin getirilmesi için geleneksel bir strateji olgunlaşmamış zincirine uygun şekilde modifiye edilmiş fosforamidit öncüleri eklenmesi ile katı-faz sentezi kullanılmasıdır. Ancak, oldukça kısa dizilere sentezi ve sınırlama sırasında kullanılan koşullar, bu yöntemin uygulanabilirliğinin engellemektedir. Öte yandan, modifiye edilmiş nükleosit trifosfatlar nükleik asitler, pratik bir uygulama geniş palette modifiye nükleik asitlerin kullanımı için bir yol açıyor bir strateji içine çok sayıda işlevsel grupların sokulması için hafif kullanılmıştır yapı taşları aktive edilir Böyle ribozimlerin ve DNAzimler fonksiyonel etiketleme ve nesil gibi. En önemli sorunlardan biri, bu nükleosid analoglarının izolasyonu ve karakterizasyonu yol açan metodoloji karışıklık bulunur.

Bu ekran yazıda, thes sentezi için detaylı bir protokol mevcute fosfor (III) bazlı reaktifler kullanılarak değiştirilmiş analoglarıdır. Buna ek olarak, onların biyokimyasal karakterizasyonu için prosedür astar uzatma reaksiyonları ve TdT kuyruklanmasız polimerizasyon özel bir vurgu ile, ifşa edilir. Bu ayrıntılı protokol modifiye dNTP işçiliği ve kimyasal biyolojide bunların daha sonraki kullanım için faydalı olacaktır.

Giriş

5'-nükleosit trifosfatlar ((d) NTP'ler) evrensel enerji birimi olmaktan hücre metabolizması düzenleyicileri kadar sayısız işlem ve fonksiyonların katılan önemli bir biyomoleküllerin bir sınıfını temsil eder. Bu temel biyolojik dönüşümler rollerine ilave olarak, bunların modifiye edilmiş oligonükleotidlerin muadilleri olarak işlevsel grupların sokulması için bir çok yönlü ve hafif bir platform, güzel bir şekilde, genellikle 1,2 uygulandığı bir otomasyonlu katı faz sentezini tamamlar bir yöntem olarak gelişmiş var. Gerçekten de, (d) NTP'ler RNA ve DNA polimerazların 3 alt-tabakalar için, amino asitler 4-13, boronik asitler 14,15, nornbornene 16, diamondoid benzeri kalıntıları 17 için, yan zincirler de dahil olmak üzere işlevsel grupların zenginliği olarak hareket edebilir Resim organik kataliz 18, safra asitleri 19 ve hatta 20 oligonükleotidler oligonükleotid içine sokulabilir.

_content "> nükleik asitlerin işlevsellik için uygun bir vektör temsil ötesinde, modifiye edilmiş dNTP, SELEX ve modifiye katalitik nükleik asit 21-30 ve çeşitli pratik uygulamalar için 10 aptamers oluşturulması için in vitro seçimi diğer ilgili kombinasyon yöntemlerinde meşgul olabilir 31-36. modifiye edilmiş dNTP'ler polimerizasyonu tarafından ortaya olan ilave Yan zincirler, bir seçim deney sırasında incelenmiş ve nükleik asitlerin 37'nin oldukça kötü fonksiyonel cephanelik takviye edilebilir kimyasal alanını artırmak düşünülmektedir. Ancak, bu rağmen çekici özellikleri ve sentetik ve analitik yöntemlerin her ikisi de gelişmesinde yapılan son ilerlemeler, evrensel uygulanabilir ve yüksek verimli bir prosedür modifiye nükleosit trifosfat 2,38 işçiliği ihtiyaç vardır.

Bu mevcut protokolün amacı, (bazen) karmaşık prosedürleri önde gelen t içine ışık tutmaktıro sentezi ve bu aktive edilmiş yapı blokları (Şekil 1 B) biyokimyasal karakterizasyonu. Özel vurgu genellikle bulmak zor ya da deneysel bölümlerde bulunmadığına ancak saf (d) NTP'ler izolasyonu (Şekil 1) yol açan sentetik yolunun başarılı bir şekilde tamamlanması için henüz çok önemli olan tüm sentetik ayrıntılar verilecektir.

Protokol

1.. Modifiye nükleosit trifosfatın sentezi

Seçilen sentetik yaklaşım bu yöntem genellikle güvenilir ve çok az yan ürünlerin (Şekil 1A) 39 yol açar beri Ludwig ve Eckstein tarafından geliştirilen prosedürü takip eder.

  1. Iki defa, susuz piridin (2 mi) ile ve daha sonra gece boyunca vakum altında kuru olarak uygun 3'-OAc-korumalı nükleositi (genellikle 0.1 mmol) Coevaporate. Aynı zamanda, bir gece boyunca vakum altında kuru tributilamonyum pirofosfat (0.13 mmol).
  2. Kuru piridin (0.2 mi) bir minimum nükleositi eritin ve bir birlikte-çözücü olarak, kuru dioksan (0.4 ml) ekleyin. Son olarak, 2-kloro-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on (0.11 mmol) ekleyin ve 45 dakika için oda sıcaklığında reaksiyona izin verir.
    Not: Bu, özellikle bakım 2-kloro-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on bir reaktif ile alınması gerektiği dikkat çekicidir. Gerçekten de, bir atıl gaz altında bu hava ortam maddesi içinde bir kullanıcının depolamaBurada da ayrışmasını önlemek için yeterli değildir. Bu nedenle, bu ayrışma oluşturulur bu, beyaz bir katı ve kullanım öncesinde kazınıp gerektiğini açıklar.
  3. Kuru DMF (0.17 mi) içinde tributilamonyum pirofosfat çözeltisi ve taze damıtılmış tributilamin hazırlayın (58 ul; moleküler elekler eklemek hiç). Reaksiyon karışımına (beyaz bir çökelti oluştu fakat hızla kaybolur), elde edilen çözelti ilave edin ve 45 dakika boyunca oda sıcaklığında reaksiyona girmesine izin verir.
  4. Bir iyot çözeltisi piridin (0.16 mmol) (0.98 mi) ve H2O (20 ul) hazırlayın ve (III) 'ün merkezi Pα okside etmek için reaksiyon karışımına ekleyin. Elde edilen koyu renkli çözelti, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karışmaya bırakın.
  5. I 2 fazlalığını gidermek için NAS 2 O 3,% 10 sulu solüsyonu kullanın. Çözücüyü vakum altında çıkarın (döner buharlaştırıcı içinde su banyosunun sıcaklığı, 30 ° C'nin altında tutulmalıdır). H2O (5 mi) ilave edin ve bir mil izinsiklik trifosfat kısmı hidrolize 30 dakika boyunca oda sıcaklığında beklemeye Karışımı soğutun.
  6. Bu aşamada, koruyucu gruplar, genellikle (3'-OAc ve nükleobaz yan zincirler üzerindeki grupların, yani) çıkarılır. Sonuç olarak, ham için NH4 OH (2 H, O, 10 ml içinde% 30) ekleyin ve oda sıcaklığında 1.5 saat karışması ve çözücüyü vakum altında çıkarın.
  7. 2 tüp içine H 2 O ve bölünmüş 2 ml ekleyin. 30 dakika boyunca aseton ve santrifüj (1,000 x g) içinde NaClO 4 arasında bir% 2 çözeltisi 12 ml ilave edilir. Bu prosedür bir kez daha tekrar edilir. Bu çökelme böylece esas olarak takip eden RP-HPLC arıtma basitleştirilmesi, (çökelecektir) trifosfattan sentezinde kullanılan çözücüler ve reaktifler ayrılmaktadır.
  8. Yağlı tortu, hava ile kurutmadan sonra, (standart prosedürler izlenerek Malzemeler ve Şekil 3'ün de listesi bakınız), ham bir 31 P-NMR spektrumunu kaydetme ve4 ml H2O içinde eritildi
    Not: Bu sentezleme prosedürü esas olarak tadil edilmiş deoksinükleosit trifosfat jenerasyonu üzerinde odaklanırken, çok benzer bir prosedür, (sadece, 3'-bis-O-asile ön-maddeleri 2 'kullanılarak) kendi RNA meslektaşları için uygulanabilir.

2. Modifiye nükleosid trifosfatlar HPLC ile saflaştırılması

  1. Trietilamonyum bikarbonat (Teab) bir 1 M stok çözeltisinin hazırlanması: 40
    1. Damıtılmış ve süzüldü H 2 O'dan ≈ 600 ml trietilamin 1 mol (139 mi) ihtiva eden bir çözelti hazırlayın
    2. Kabarcık CO2 (kuru buz ve bir gaz kabarcık ile) kuvvetli karıştırma altında çözelti içine 7.6 bir pH (bu, en az 10 saat sürer) ulaşana kadar. Bu stok çözeltisi, bir aya kadar buzdolabında muhafaza edilebilir.
  2. Arıtma:
    1. Ultra saf su içinde 50 mM Teab 2 L (eluent A) a: 1 M stok çözelti hazırlayın iki geçici belleknd 50% MeCN (eluent B) 50 mM Teab 1 L. Her iki yıkama sıvıları vakum altında ve 20 dakika boyunca karıştırıldıktan Degas (dikkat ve özen gaz alma sırasında CO2 kaldırarak pH değerini değiştirmek için o kadar olarak gereklidir).
    2. 300 ul damıtılmış H2O içinde ham trifosfat 10 ul eritilerek, bir analitik numune hazırlayın ve bir yarı-hazırlayıcı RP kolonu (C18) ile donatılmış ve değişen bir gradyan kullanılarak, bir HPLC sistemi içine enjekte edilir, 40 dakika içinde% 0-100 B (Şekil 4). Trifosfat R t (genellikle kromatogramda ana pik olan) ve (a biraz daha düşük R t vardır) difosfat göre HPLC programı ayarlayın. Bu koşulları ve bazı difosfat içerebilir ilk fraksiyonlar kaldırarak kullanılarak ham karışım arındırın.
    3. Ürünü içeren tüm fraksiyonlar birleştirilir ve dondurularak kuru (istenmeyen diphosph için hidrolizini minimuma indirmek amacıyla, döner buharlaştırıcı üzerinde buharlaştırma tercih edilir) yedik. (Saflaştırma maddesi kalıntısı trietilamin çıkarmak için) ultra-saf su ile bir kaç kez Coevaporate. NMR ile trifosfat saflığını standart protokoller uygulanmasıyla (1H ve31P NMR her ikisi) ve MALDI-TOF (bkz. Şekil 5) değerlendirmek. Bu protokolün uygulanması ile elde edilen tipik verimler, tipik olarak alt tabakaya bağlı olarak,% 30-70 aralığı içinde yer alır.

3. Primer Uzatma Reaksiyonları ve TdT Polimerizasyon

  1. Primerin 5'-uç etiketleme
    1. Uygun primerin 30 pmol karıştırın (örneğin P1, Malzeme Listesi) 10x polinükleotid kinaz (PNK) tamponu, γ-[32P]-ATP, PNK 1 ul ve GKD 2 O 3 ul için (4 ul 40 ul toplam reaksiyon hacmi). 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve reaksiyon karışımı daha sonra kinaz (70 ° C 'de 10 dakika) ısı devre dışı bırakır.
    2. Etiketleme reaksiyonu sırasında hazırlamaksilanize cam yünü ile 1 ml pipet takıp ve G10 çözeltisi (GKD 2 O içinde% 10, otoklav) ile ucu doldurarak bir Sephadex G10 kolonu. Spin ve 500 ul GKD 2 O ve 50 ul GKD 2 O. ile son bir kez yıkama ile üç kez yıkayın (Serbest radyoaktif etiket çıkarmak için) G10 boyunca reaksiyon karışımının çalıştırın.
    3. Jel (PAGE% 20) radyo-etiketli primer arındırmak ve ezmek uygulanmasıyla kurtarmak ve 15 için 72 ° C'de% 1 LiClO 4 ve 1 mM 3 NEt (pH 8) ihtiva eden sulu bir çözelti ile 500 ul bir yöntem (yani, bir elüsyon emmek dk). Çökelti etanol ve G10 elüt oligonükleotid tuzunun giderilmesi.
  2. Primer uzatma reaksiyonu
    1. Tavlama 1 radyo-etiketli primer P1 pmol, 10 pmol primer P1 ve 10 (kullanılacak polimerazın tedarikçi tarafından sağlanan) 10x reaksiyon tamponu içinde şablon T1 (Malzeme Listesi) pmol t yerleştirerekUbe, sıcak (90-95 ° C) su içinde ve yavaş yavaş (45 dakika boyunca), oda sıcaklığına kadar soğuması için izin verilir.
    2. Buz üzerinde tüp koyun ve (sırayla) dNTP kokteyl ekleyin (değiştirilmiş veya her ikisini de içeren, doğal trifosfatı, 100 uM son konsantrasyon) ve DNA polimeraz 1 U (ekzo (Vent - Klenow, Pwo ya da 9 ° N,) m) ve 20 ul toplam reaksiyon hacmi için, su () ile tam. (-) Kullanılıyor Vent (ekzo 30 dakika boyunca, örneğin 60 ° C) enzim en uygun çalışma sıcaklığında inkübe edin.
    3. Durdurma solüsyonu (formamid (% 70), etilendiamintetraasetik asit (EDTA, 50 mM), bromofenol mavisi (% 0.1), ksilen siyanol (% 0.1)) 20 ul ekle örnekleri (95 ° C, 5 dakika) ısı, soğuk aşağı (0 ° C), ve denatüre poliakrilamid jel elektroforezi ile çözmek. Fosforimagere canlandırın.
  3. TdT polimerizasyon
    1. Tek şeritli 7 pmol seyreltin, Etiketlenmemiş primer P2 (Malzeme listesi), 1 ul tampon maddesi TdT 10x in radyo-etiketli primerden 1 pmol.
    2. Buz üzerinde tüp koyun ve (sırayla) (10 ve 200 uM arasında bulunan uygun bir konsantrasyonda) dNTP kokteyl ile TdT polimeraz (4 U) ekleyin. 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. Stop solüsyonu 10 ul ekleyin örnekleri (95 ° C, 5 dakika) ısıtın, (0 ° C) soğumaya bırakın ve (SAYFA 15%) denatüre poliakrilamid jel elektroforezi ile çözmek. Fosforimagere canlandırın.

4. Modifiye nükleosid trifosfatlar ile PCR

  1. Her ikisi de ileri 8 pmol karıştırın ve amplifiye edilecek şablonun 0.5 pmol ile geri primerler. 10x reaksiyon tamponu ve (200 uM son konsantrasyon) dNTP kokteyl ilave edin ve buz üzerinde tüp koydu. 20 ul bir son hacme ulaşmak için 1 U DNA polimeraz ve H2O ile birlikte ekleyin. PCR şişenin içine karışımı aktarın ve 30 PCR döngüleri yürütmek.
  2. 2x sakaroz yükleme tamponu 6 ul 6 ul seyreltin ve elektroforezi (etidyum bromür ile boyanmış) agaroz ile% 2 çözmek. Fosforimagere canlandırın.

Sonuçlar

Bu nükleik asitler 41 içine işlevsel grupların bir çok dizi kolay sokulması için izin verirse, modifiye nükleosit trifosfatlar sentetik hedefleri çekici edilir. Bununla birlikte, bu aktif yapı bloklarının izolasyonu ve karakterizasyonu genellikle zor olduğu ortaya çıkar. Sonuç olarak, bu tarifnamede gösterilen sonuçlar, belirtilen sentetik ve biyokimyasal işlemler (Şekil 1 B) içinde çeşitli adımları için bir yardım el sağlamak düşünülmektedir.

Tartışmalar

Nükleik asitlerin içine modifikasyonların dahil antisense ve antijen maddelerin geliştirilmesi 42,43, etiketleme ve oligonükleotidlerin 41 fonksiyonel etiketleme de dahil olmak üzere pek çok pratik uygulamalar için ilgi çekici olan ve genetik alfabe 44-46 genişletmek çabalarında. Kimyasal değişiklikler ve fonksiyonel gruplar genellikle, standart ve otomatik katı faz sentezi protokolleri uygulanmasıyla nükleik asitler dahil edilir. Bununla birlikte, fosforamidit yapı ta?...

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (Hibeler n PZ00P2_126430 / 1 ° ve PZ00P2_144595) tarafından desteklenmiştir. Prof C. Leumann minnetle laboratuvar alanı ve ekipman sağlayarak, hem de onun sürekli destek için için kabul edilmektedir. Bayan Sue Knecht verimli tartışmalar için kabul edilmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
tributylammonium pyrophosphate Sigma AldrichP8533Hygroscopic solid, keep under Ar
2-chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one Sigma Aldrich324124Moisture sensitive
PyridineSigma Aldrich82704Under molecular sieves
DioxaneSigma Aldrich296309Under molecular sieves
dimethylformamide (DMF)Sigma Aldrich40248Under molecular sieves
Acetonitrile Fisher ScientificHPLC grade
TriethylamineSigma Aldrich90342
TributylamineSigma Aldrich90781
ddH2OMilli-Qdeionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC)
Diethylpyrocarbonate (DEPC)Sigma Aldrich159220
D2OCambridge Isotope Laboratories, Inc.DLM-4-25
Biochemical reagents
g-[32P]-ATPHartmann AnalyticsFP-301
Natural dNTPsPromegaU1420
Vent (exo-) DNA polymeraseNEBM0257S
DNA polymerase I, Large (Klenow) FragmentNEBMO210S
9°Nm DNA polymeraseNEBMO260S
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT)PromegaM828A
Pwo DNA polymerasePeqlab01 01 5010
T4 PNKThermo ScientificEK0032
Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%)Serva10679.01
AgaroseApollo ScientificBIA1177
G10 SephadexSigmaG10120
UreaApollo ScientificBIU4110
Equipment
Jupiter semi-preparative RP-HPLC column (5m C18 300Å)Phenomenex
Gene Q Thermal CyclerBioconceptBYQ6042E
PCR vialsBioconcept3220-00
HPLC systemAmersham Pharmacia BiotechÄkta basic 10/100
Oligonucleotides
All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE
5'-CAAGGACAAAATACCTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAAT-AGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGG-ACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles:
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320 – 13330
Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F.

Referanslar

  1. Hocek, M., Fojta, M. Cross-coupling reactions of nucleoside triphosphates followed by polymerase incorporation. Construction and applications of base-functionalized nucleic acids. Org. Biomol. Chem. 6, 2233-2241 (2008).
  2. Hollenstein, M. Nucleoside Triphosphates - Building Blocks for the Modification of Nucleic Acids. Molecules. 17, 13569-13591 (2012).
  3. Lauridsen, L. H., Rothnagel, J. A., Veedu, R. N. Enzymatic Recognition of 2'-Modified Ribonucleoside 5'-Triphosphates: Towards the Evolution of Versatile Aptamers. ChemBioChem. 13, 19-25 (2012).
  4. Roychowdhury, A., Illangkoon, H., Hendrickson, C. L., Benner, S. A. 2'-Deoxycytidines Carrying Amino and Thiol Functionality: Synthesis and Incorporation by Vent (Exo-) Polymerase. Org. Lett. 6, 489-492 (2004).
  5. Dewey, T. M., Mundt, A. A., Crouch, G. J., Zyzniewski, M. C., Eaton, B. E. New Uridine Derivatives for Systematic Evolution of RNA Ligands by Exponential Enrichment. J. Am. Chem. Soc. 117, 8474-8475 (1995).
  6. Kuwahara, M., et al. Direct PCR amplification of various modified DNAs having amino acids: Convenient preparation of DNA libraries with high-potential activities for in vitro selection. Bioorg. Med. Chem. 14, 2518-2526 (2006).
  7. Jäger, S., Famulok, M. Generation and Enzymatic Amplification of High-Density Functionalized DNA Double Strands. Angew. Chem. Int. Ed. 43, 3337-3340 (2004).
  8. Thum, O., Jäger, S., Famulok, M. Functionalized DNA: A New Replicable Biopolymer. Angew. Chem. Int. Ed. 40, 3990-3993 (2001).
  9. Jäger, S., et al. A versatile toolbox for variable DNA functionalization at high density. J. Am. Chem. Soc. 127, 15071-15082 (2005).
  10. Vaught, J. D., et al. Expanding the Chemistry of DNA for in Vitro Selection. J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151 (2010).
  11. Sakthivel, K., Barbas, C. F. Expanding the Potential of DNA for Binding and Catalysis: Highly Functionalized dUTP Derivatives That Are Substrates for Thermostable DNA Polymerases. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2872-2875 (1998).
  12. Raindlová, V., Pohl, R., Hocek, M. Synthesis of Aldehyde-Linked Nucleotides and DNA and Their Bioconjugations with Lysine and Peptides through Reductive Amination. Chem. Eur. J. 18, 4080-4087 (2012).
  13. Hollenstein, M. Deoxynucleoside triphosphates bearing histamine, carboxylic acid, and hydroxyl residues – Synthesis and biochemical characterization. Org. Biomol. Chem. 11, 5162-5172 (2013).
  14. Cheng, Y., et al. Synthesis, and Polymerase-Catalyzed Incorporation of Click-Modified Boronic Acid-TTP Analogues. Chem. Asian J. 6, 2747-2752 (2011).
  15. Lin, N., et al. Design and synthesis of boronic-acid-labeled thymidine triphosphate for incorporation into DNA. Nucleic Acids Res. 35, 1222-1229 (2007).
  16. Schoch, J., Jäschke, A. Synthesis and enzymatic incorporation of norbornenemodified nucleoside triphosphates for Diels–Alder bioconjugation. RSC Adv. 3, 4181-4183 (2013).
  17. Biomol Chem, O. r. g. . 9, 7482-7490 (2011).
  18. Hollenstein, M. Synthesis of deoxynucleoside triphosphates that include proline, urea, or sulfamide groups and their polymerase incorporation into DNA. Chem. Eur. J. 18, 13320-13330 (2012).
  19. Ikonen, S., Macíčková-Cahová, H., Pohl, R., Šanda, M., Hocek, M. Synthesis of nucleoside and nucleotide conjugates of bile acids, and polymerase construction of bile acid-functionalized DNA. Org. Biomol. Chem. 8, 1194-1201 (2010).
  20. Baccaro, A., Steck, A. -. L., Marx, A. . Barcoded Nucleotides. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 254-257 (2012).
  21. Santoro, S. W., Joyce, G. F., Sakthivel, K., Gramatikova, S., Barbas, C. F. RNA cleavage by a DNA enzyme with extended chemical functionality. J. Am. Chem. Soc. 122, 2433-2439 (2000).
  22. Sidorov, A. V., Grasby, J. A., Williams, D. M. Sequence-specific cleavage of RNA in the absence of divalent metal ions by a DNAzyme incorporating imidazolyl and amino functionalities. Nucleic Acids Res. 32, 1591-1601 (2004).
  23. Perrin, D. M., Garestier, T., Hélène, C. Bridging the gap between proteins and nucleic acids: A metal-independent RNAseA mimic with two protein-like functionalities. J. Am. Chem. Soc. 123, 1556-1563 (2001).
  24. Hollenstein, M., Hipolito, C., Lam, C., Dietrich, D., Perrin, D. M. A highly selective DNAzyme sensor for mercuric ions. Angew. Chem. Int. Ed. 47, 4346-4350 (2008).
  25. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A self-cleaving DNA enzyme modified with amines, guanidines and imidazoles operates independently of divalent metal cations (M2). Nucleic Acids Res. 37, 1638-1649 (2009).
  26. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A DNAzyme with Three Protein-Like Functional Groups: Enhancing Catalytic Efficiency of M2+-Independent RNA Cleavage. ChemBioChem. 10, 1988-1992 (2009).
  27. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. Toward the Combinatorial Selection of Chemically Modified DNAzyme RNase A Mimics Active Against all-RNA Substrates. ACS Comb. Sci. 15, 174-182 (2013).
  28. Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Lam, C. H., Perrin, D. M. Protein-inspired modified DNAzymes: dramatic effects of shortening side-chain length of 8-imidazolyl modified deoxyadenosines in selecting RNaseA mimicking DNAzymes. Org. Biomol. Chem. 9, 2266-2273 (2011).
  29. Lam, C. H., Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Perrin, D. M. A divalent metal-dependent self-cleaving DNAzyme with a tyrosine side chain. Org. Biomol. Chem. 9, 6949-6954 (2011).
  30. Wiegand, T. W., Janssen, R. C., Eaton, B. E. Selection of RNA amide synthase. Chem. Biol. 4, 675-683 (1997).
  31. Battersby, T. R., et al. Quantitative Analysis of Receptors for Adenosine Nucleotides Obtained via In Vitro Selection from a Library Incorporating a Cationic Nucleotide Analog. J. Am. Chem. Soc. 121, 9781-9789 (1999).
  32. Latham, J. A., Johnson, R., Toole, J. J. The application of a modified nucleotide in aptamer selection: novel thrombin aptamers containing -(1-pentynyl)-2'-deoxyuridine. Nucleic Acids Res. 22, 2817-2822 (1994).
  33. Masud, M. M., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Sialyllactose-binding modified DNA aptamer bearing additional functionality by SELEX. Bioorg. Med. Chem. 12, 1111-1120 (2004).
  34. Shoji, A., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Modified DNA aptamer that binds the (R)-Isomer of a thalidomide derivative with high enantioselectivity. J. Am. Chem. Soc. 129, 1456-1464 (2007).
  35. Yu, H., Zhang, S., Chaput, J. C. Darwinian Evolution of an Alternative Genetic System Provides Support for TNA as an RNA Progenitor. Nat. Chem. 4, 183-187 (2012).
  36. Davies, D. R., et al. Unique motifs and hydrophobic interactions shape the binding of modified DNA ligands to protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 19971-19976 (2012).
  37. Kuwahara, M., Sugimoto, N. Molecular Evolution of Functional Nucleic Acids with Chemical Modifications. Molecules. 15, 5423-5444 (2010).
  38. Burgess, K., Cook, D. Syntheses of Nucleoside Triphosphates. Chem. Rev. 100, 2047-2059 (2000).
  39. Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5'-0-(1-thiotriphosphates), 5'-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. J. Org. Chem. 54, 631-635 (1989).
  40. Williams, D. M., Harris, V. H., Murphy, J. Chapter 3. Organophosphorus Reagents: A Practical Approach in Chemistry. 9, 237-275 .
  41. Hocek, M., Fojta, M. Nucleobase modification as redox DNA labelling for electrochemical detection. Chem. Soc. Rev. 40, 5802-5814 (2011).
  42. Kurreck, J. Antisense technologies - Improvement through novel chemical modifications. Eur. J. Biochem. 270, 1628-1644 (2003).
  43. Wilson, C., Keefe, A. D. Building oligonucleotide therapeutics using non-natural chemistries. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 607-614 (2006).
  44. Krueger, A. T., Kool, E. T. Model systems for understanding DNA base pairing. Curr. Opin. Chem. Biol. 11, 588-594 (2007).
  45. Krueger, A. T., Lu, H., Lee, A. H. F., Kool, E. T. Synthesis and Properties of Size-Expanded DNAs: Toward Designed, Functional Genetic Systems. Acc. Chem. Res. 40, 141-150 (2007).
  46. Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Alternative DNA base-pairs: from efforts to expand the genetic code to potential material applications. Chem. Soc. Rev. 40, 5669-5679 (2011).
  47. Weisbrod, S. H., Marx, A. Novel strategies for the site-specific covalent labelling of nucleic acids. Chem. Commun. 30 (44), 5675-5685 (2008).
  48. Lim, S. E., Copeland, W. C. Differential Incorporation and Removal of Antiviral Deoxynucleotides by Human DNA Polymerase γ. J. Biol. Chem. 276, 23616-26623 (2001).
  49. Cho, Y., Kool, E. T. Enzymatic Synthesis of Fluorescent Oligomers Assembled on a DNA Backbone. ChemBioChem. 7, 669-672 (2006).
  50. Hollenstein, M., Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Polymerase incorporation of pyrene-nucleoside triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4428-4430 (2012).
  51. Kuwahara, M., et al. Smart conferring of nuclease resistance to DNA by 3'-end protection using 2',4'-bridged nucleoside-5'-triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2941-2943 (2009).
  52. Horáková, P., et al. Tail-labelling of DNA probes using modified deoxynucleotide triphosphates and terminal deoxynucleotidyl tranferase. Application in electrochemical DNA hybridization and protein-DNA binding assays. Org. Biomol. Chem. 9, 1366-1371 (2011).
  53. Motea, E. A., Berdis, A. J. Terminal deoxynucleotidyl transferase: The story of a misguided DNA polymerase. Biochim. Biophys. Acta. 1804, 1151-1166 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

ChemistrySay 86n kleik asit analoglarBioorganic ChemistryPCRprimer uzatma reaksiyonlarorganik sentezPAGEHPLCn kleosid trifosfatlar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır