La utilización de la orofaringe Intratraqueal PAMP Administración y lavado broncoalveolar para evaluar el anfitrión respuesta inmune en ratones

Resumen

La respuesta inmune del huésped a la infección por patógenos es un proceso estrechamente regulado. Utilizando un modelo de exposición de pulmón lipopolisacárido en los ratones, es posible llevar a cabo las evaluaciones de alta resolución de los complejos mecanismos asociados con la patogénesis de la enfermedad.

Resumen

La respuesta inmune del huésped a patógenos es un proceso biológico complejo. La mayoría de los estudios in vivo empleado clásicamente para caracterizar las interacciones huésped-patógeno se aprovechan de inyecciones intraperitoneales de seleccionar las bacterias o los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) en ratones. Si bien estas técnicas han rendido enormes de datos relacionados con patobiología enfermedad infecciosa, los modelos de inyección intraperitoneal no siempre son apropiadas para estudios de interacción huésped-patógeno en el pulmón. Utilizando un modelo de inflamación pulmonar aguda en ratones, es posible llevar a cabo un análisis de alta resolución de la respuesta inmune del huésped innata la utilización de lipopolisacárido (LPS). A continuación, describimos los métodos para administrar el uso de la administración intratraqueal LPS orofaríngea no quirúrgico, el seguimiento de parámetros clínicos asociados con la patogénesis de la enfermedad, y utilizar el líquido de lavado broncoalveolar para evaluar la respuesta inmune del huésped. Las técnicas que se describenson ampliamente aplicables para el estudio de la respuesta inmune innata de acogida a un rango diverso de PAMP y patógenos. Del mismo modo, con pequeñas modificaciones, estas técnicas pueden también ser aplicadas en los estudios que evalúan la inflamación de las vías respiratorias alérgica y en aplicaciones farmacológicas.

Introducción

Las infecciones pulmonares asociadas a especies de bacterias patógenas son una causa frecuente de morbilidad y mortalidad global. La determinación de los mecanismos que conducen a la respuesta inmune del huésped a estos patógenos, promoverá el desarrollo de estrategias de prevención novedosas y agentes terapéuticos que atenuar el impacto de estas infecciones. El objetivo general del protocolo descrito aquí es proporcionar al usuario un método flexible para evaluar la respuesta inmune innata huésped a la infección del patógeno utilizando un patrón molecular asociado patógeno (PAMP) como un sustituto de bacterias vivas. La mayoría de los estudios previos de evaluación de la respuesta inmune innata de acogida a las bacterias se han centrado en modelos peritoneales debido a la relativa facilidad de ejecución. Aunque estos modelos son muy útiles y han dado lugar a avances significativos en el campo de las interacciones huésped-patógeno y la inflamación sistémica, los datos generados a partir de estos modelos no siempre son apropiadas para estudios involving el sistema respiratorio. Aquí, un modelo pulmonar de la inflamación pulmonar aguda se propone como una expansión práctico y clínicamente relevante de los modelos de inyección clásicos intraperitoneal (ip). La técnica propuesta permite la evaluación local de la respuesta inmune innata en un sistema de modelo específico de órganos.

Los métodos descritos aquí se han diseñado para proporcionar una técnica simple y robusto para permitir a los usuarios evaluar la respuesta inmune del huésped a LPS, que es un PAMP común. Los métodos se basan en intratraqueal (IT) de la instilación de LPS, que induce una respuesta inmune innata robusto en los pulmones de los ratones y imita muchas de las características fisiopatológicas observadas en los pacientes humanos que sufren de infecciones respiratorias y la lesión pulmonar aguda ^1. Una ventaja principal de esta técnica es que permite al usuario evaluar la respuesta inmune del huésped y sin los factores de confusión y problemas de seguridad asociados con la realización de estudios in vivoel uso de bacterias vivas. Del mismo modo, la vía de administración que orofaríngea de la exposición descrita en este protocolo tiene ventajas significativas sobre otras técnicas comúnmente utilizadas, incluyendo intranasal (in) administración y gestión se quirúrgico. Por ejemplo, la administración que orofaríngea permite la dosificación relativamente precisa y la deposición de pulmón en comparación con en la administración, que típicamente sufre de aumento de la variabilidad de la deposición en los pulmones debido a la pérdida de agentes en la cavidad nasal y los senos paranasales ^2-4. La vía de administración, elude estas cavidades y permite el acceso directo a la tráquea y las vías respiratorias. Del mismo modo, el enfoque que se quirúrgica es un método de administración mucho más morboso y requiere una amplia formación de dominar. Los protocolos descritos aquí también incluyen una descripción de las técnicas comunes y marcadores indirectos utilizados para evaluar la progresión de la inflamación y terminar con un protocolo que describe las técnicas adecuadas para la preparación de la luones para las evaluaciones de histopatología. Estos protocolos se centran en reducir al mínimo el número de ratones requeridos para cada estudio mediante la maximización de los datos generados a partir de cada animal individual.

Los protocolos descritos son altamente flexibles y pueden ser fácilmente modificados para evaluar una diversa gama PAMPs y los daños asociados a patrones moleculares (apaga). Por otra parte, con algunas modificaciones, estos protocolos también pueden ser aplicados a los estudios que evalúan la progresión de la enfermedad de las vías respiratorias alérgicas o interacciones huésped-patógeno con bacterias vivas, virus u hongos ^5-10.

Protocolo

Se realizaron todos los estudios bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso (IACUC) de Virginia Tech y de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Intratraqueal (it) La inoculación de LPS mediante Administración de orofaringe

1. Asegúrese de que cada animal se identifica unívocamente usando un punzón oído, marca auricular, u otro método aprobado institucionalmente.
2. Anotar el peso corporal inicial y la temperatura corporal de cada animal.
3. Preparar la solución de trabajo de LPS. Cada ratón recibe una dosis de 50 l de 1 mg / kg de LPS en 1x tampón fosfato salino (PBS). Animales tratados Mock recibirán una dosis de 50 l de PBS 1x.
4. Preparar una cámara apropiada para la administración de isoflurano usando el método de la gota siguiente. Directrices institucionales varían con respecto al uso del isoflurano y otros agentes anestésicos y antes de la iniciatuso de todo tipo de estudios, las personas deben comunicarse con el Departamento de Atención / Bienestar Animal de su institución para asegurar que las todas las directrices que se cumplan adecuadamente. Si método de la gota isoflurano no es una opción, otros agentes anestésicos son alternativas aceptables.
   1. En una cabina de seguridad apropiado, aplicar aproximadamente 3 ml de isoflurano a una toalla de papel absorbente plegada y el lugar en el fondo de un vaso de precipitados de 500 ml.
   2. Coloque un pequeño trozo de papel de aluminio en la parte superior de la toalla de papel y cubrir el recipiente con una tapa transparente.
5. Preparar las herramientas y reactivos que se utilizarán durante la inoculación ella. Coloque la banda de goma y que asegure los animales se dirigen en el stand de la intubación. Este procedimiento requiere un par de pinzas rectas, un par de pinzas en ángulo o curvados, y una pipeta P200 con puntas.
6. Carga 50 l de LPS en la punta de la pipeta y colocar en un lugar fácilmente accesible junto al stand de la intubación.
7. Anestesiar el ratóncolocando el animal en la cámara de isoflurano y que cubre la cámara con la tapa transparente. Observar los patrones de respiración del animal, que será rápida y superficial cuando primero colocado en la cámara. El animal será suficientemente anestesiado cuando las tasas de respiración aproximan 1 respiración / 2 seg, que normalmente se encuentra a 30 segundos de colocar en la cámara. El ratón debe ser anestesiado como se indica en el protocolo aprobado animales utilizando el método de caída de isoflurano.
8. Retire el ratón anestesiado de la cámara y suspender el animal en la intubación de pie por sus incisivos delanteros. Asegúrese de que el animal está bien sujetos y de la boca y la lengua son accesibles.
9. Asegurar la lengua suavemente con las pinzas rectas. Sujete la lengua con la pinza en ángulo y tire de él hacia fuera de la boca hasta que se note una ligera resistencia. Esta acción es suficiente para bloquear la epiglotis y obtener acceso a la tráquea.
10. Sin soltar la lengua en elposición extendida, administrar la dosis de 50 l de LPS en la parte posterior de la garganta y cubrir inmediatamente las fosas nasales del animal con un dedo enguantado. El LPS será visible en la parte posterior de la garganta hasta que inhala el ratón.
11. Continuar para cubrir las ventanas de la nariz y mantenga la lengua extendida durante 5-10 respiraciones adicionales.
12. Retire el ratón desde el stand de la intubación y coloque el animal de nuevo en una nueva jaula hasta que se recupere de la anestesia.
13. Monitorear marcadores indirectos asociados con la progresión de la enfermedad. El peso corporal y la temperatura corporal deben ser controlados cada 4-8 horas durante la duración del estudio. Del mismo modo, evaluar las características de comportamiento y síntomas clínicos asociados con una mayor morbilidad.
14. Para evaluar la progresión de la enfermedad, los ratones de cosecha en los puntos de tiempo específicos después de la exposición LPS. Puntos de tiempo típicos para la cosecha después de la exposición LPS incluyen 0, 6, 12, 18, 24 y 48 h. Para evaluar la recuperación y la supervivencia, evaluar los ratones durante 7 days después de la inoculación.

2. El suero y lavado broncoalveolar de fluido (BALF) Colección

1. Sacrificar el ratón usando un método aprobado institucionalmente.
2. Colocar el animal sobre su espalda y fijarlo a un tablero de la necropsia, lo ideal es 0,5 en (1.27 cm) de altura.
3. Mojar todo el ratón con etanol al 70%.
4. Con una jeringa de 1 ml con una aguja de 27 G, llevar a cabo una punción cardíaca antes de hacer ninguna incisión. Debería ser posible retirar 500-800 l de sangre entera de un solo ratón.
5. Retire la aguja de la jeringa y transfiera toda la sangre a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml premarcan. Para la recolección de suero, permite toda la sangre para coagular durante al menos 30 min a temperatura ambiente. En adición a la colección de suero, este procedimiento también se puede modificar mediante la incorporación de un anti-coagulante en el tubo y la jeringa, antes de recoger la sangre entera, para estudiar células inmunes circulantes.
6. Haga una incisión horizontal acruzar la longitud de la cavidad peritoneal y una incisión vertical de la cavidad peritoneal a la mandíbula inferior del ratón.
7. Con unas pinzas, sujete ambos lados de la incisión y tire suavemente de la piel lejos de las cavidades peritoneales y torácicas subyacentes.
8. Hacer una incisión grande a lo largo de la longitud de la cavidad peritoneal de los genitales con el esternón, teniendo cuidado de evitar el corte de la membrana. Desplazar suavemente los intestinos en la cavidad peritoneal para permitir el acceso a uno de los riñones.
9. Cortar la vena renal que conduce a la riñón para servir como un punto de drenaje para la perfusión.
10. Nick el diafragma con unas tijeras, teniendo cuidado de evitar los pulmones y el corazón, para exponer el lado izquierdo del corazón.
11. Perfundir manualmente el corazón con una jeringa de 10 ml con una aguja de 27 G y 1 x solución de PBS. Evitar la aplicación de fuerza excesiva durante la perfusión para asegurar que la solución salina no está forzada en los pulmones. La sangre restante debe escurrirse de la incisión de la vena porta.
12. Corte con cuidado la caja torácica a lo largo del esternón utilizando tijeras de punta roma / roma, teniendo cuidado de no cortar el corazón y los pulmones. Cortar accidentalmente los pulmones durante este procedimiento reducirá significativamente la cantidad de BALF recogido y dará lugar a una incapacidad para inflar correctamente los pulmones con fijador.
13. Aislar suavemente el corazón y los pulmones de distancia de la caja torácica con fórceps. Corte cuidadosamente cada sección de la caja torácica con unas tijeras romas / roma tan cerca de la columna vertebral como sea posible y completamente eliminar ambas secciones.
14. Separe las glándulas salivales utilizando fórceps o eliminarlos con unas tijeras, para exponer la tráquea.
15. Corte cuidadosamente los músculos que cubren la tráquea con una tijera. Es esencial que la tráquea no ser cortado durante este proceso.
16. Con unas tijeras, separar de la clavícula que recubre la tráquea.
17. Agarre suavemente el timo utilizando pinzas y levantar el tejido desde el corazón. Retire el timo utilizando tijeras, velando al mismo tiempoevitar cortar el corazón o los pulmones.
18. Haga una pequeña incisión horizontal en la tráquea 1-2 anillos debajo de la laringe con tijeras en ángulo (ángulo de 45-90 º, agudo / agudo). La incisión debe ser lo suficientemente grande para asegurar firmemente la cánula.
19. Inserte la cánula de manera que el extremo cónico se extiende 2-3 anillos traqueales por debajo de la incisión y asegurar la cánula en su lugar usando una sutura de seda. Asegúrese de que la sutura pasa entre la tráquea y el esófago y se tensa en la cánula.
20. Llene una jeringa de 1 ml con 1 ml de solución salina tamponada de Hanks (HBSS) e insertar suavemente su luer dentro de la cánula.
21. Con un movimiento lento, pero constante, inyectar ~ 900 l en la tráquea, inflar los pulmones, y el retiro inmediato del HBSS. Coloque el BALF recuperado en un tubo cónico de 15 ml.
22. Repita este lavado 2 veces adicionales para recoger aproximadamente 3 ml de BALF para el análisis futuro. Guarde el BALF en hielo oa 4 º C hasta que esté listo para su uso.

3. Preparación Histopatología

1. Inserte una jeringa de 10 ml en el soporte de la inflación pulmonar. Montar el tubo a la de luer, el luer a la llave de paso, y la llave de paso a la jeringa. Asegúrese de que la llave de paso está en la posición cerrada. La jeringa de 10 ml servirá como un depósito de flujo por gravedad. El depósito debe estar unido a la inflación de pie por encima de 4,75 en el animal y la parte superior del depósito debe extenderse en 10,5 por encima del animal.
2. Llene la jeringa con solución de formalina tamponada neutra. Asegúrese de que la jeringa se llena completamente con el fijador.
3. Coloque una toalla absorbente debajo del extremo abierto del tubo y abrir la llave de paso para permitir que el fijador para llenar el tubo. Una vez que el fijador comienza a fluir desde el tubo, cerrar inmediatamente la llave de paso y volver a llenar la jeringa hasta el tope con fijador. Es importante que la jeringa se llena por completo para proporcionar la cantidad apropiada de presión para la inflación pulmonar.
4. Pasar suavemente una segunda pieza de hilo de sutura bajo la tráquea, aproximadamente 1-2 anillos traqueales por debajo del extremo de la cánula.
5. Haga un solo nudo flojo en la sutura; Sin embargo, no tire el apretado nudo.
6. Insertar el tubo de la inflación del ratón de pie dentro de la cánula.
7. Abra la llave de paso y permitir que los pulmones se llenen por la inflación gravedad.
8. Una vez que los pulmones llegan a su nivel máximo de inflación, tirar de la sutura apretada y ata un segundo nudo.
9. Cierre la llave de paso y quite el tubo de la cánula.
10. Retire con cuidado la cánula de la tráquea agarrando la sutura con un par de pinzas y la celebración de la cánula con los dedos. Jale firmemente la sutura hacia abajo, hacia la cavidad torácica y la cánula de nuevo hacia la nariz del ratón.
11. Agarre suavemente la tráquea o los puntos de sutura con las pinzas y levante la tráquea fuera de la cavidad del cuello.
12. Cortar el caudal tráquea a la sutura atada con unas tijeras romas.
13. Una vez que el Tracheuna es libre de los tejidos subyacentes, empiezan a tirar de la tráquea de distancia del ratón. Levante suavemente los pulmones fuera de la cavidad torácica.
14. Corte cuidadosamente el tejido conectivo que sostiene los pulmones en la cavidad torácica. Continuar tirando de la tráquea de distancia del cuerpo del ratón y aplicar fuerza ascendente constante, mientras que el corte de las conexiones subyacentes. Tenga cuidado de no cortar los pulmones. Tenga en cuenta que el corazón se debe dejar conectado a los pulmones utilizando este método.
15. Una vez que se han eliminado de los pulmones, el lugar en 10 ml de formalina tamponada.
16. Eliminar una sección de cola de ratón para el genotipado.
17. Deshágase de la canal del ratón siguiendo las directrices institucionales apropiados.

4. Evaluación de citocinas

1. Centrifugar la sangre total, recogido en la etapa 2.5, a 12.000 xg durante 5 min para aislar el suero. Transferir el suero a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml premarcan y almacenar a -80 ° C.
2. Evaluar la Seruniveles m de citoquinas por ELISA u otro ensayo similar. Diluir el suero 1:05-1:20 en un tampón de dilución apropiado, dependiendo del ensayo, siguiendo las instrucciones del fabricante. Estas diluciones se deben determinar empíricamente antes de ejecutar la mayor parte de las muestras.
3. Debido al bajo volumen de suero recogido, reducir el volumen de la muestra se carga en la placa de ELISA por medio. Por ejemplo, la mayoría de las pruebas ELISA comerciales utilizan volúmenes de 100 l de estándares y muestras. Para conservar las muestras, carga 50 l de normas y suero diluido por pocillo.
4. Centrifugar el BALF en una centrífuga de mesa refrigerada a 200 xg durante 5 min. Transferir el sobrenadante libre de células en dos premarcan 1,5 ml tubos de microcentrífuga y se almacena a -80 ° C.
5. Evaluar citoquinas BALF por ELISA u otro ensayo similar sin diluir.
6. Tienda de suero utilizados y BALF a -80 ° C.

5. La tinción diferencial y BAL celularidad Evaluación

1. Después de la centrifugación BALF y la eliminación completa de HBSS, lisar las células rojas de la sangre sedimentadas utilizando solución salina hipotónica. Resuspender las células en 900 l de agua destilada. Inmediatamente después, añadir 100 l de 10x PBS.
2. Individualmente lisar cada muestra. Si las muestras contienen cantidades excesivas de las células rojas de la sangre, las células pueden ser sedimentaron en la centrífuga de mesa superior a 400 xg durante 5 min y la sangre protocolo de lisis de glóbulos rojos se puede repetir.
3. Determine la celularidad total de BALF en la suspensión 1 ml utilizando un hemocitómetro bajo 10X o 20X de aumento con la tinción de azul de tripano. Evaluar y presentarán los datos como células / ml.
4. Preparar los materiales para la cytospin y tinción diferencial. Etiquetar los portaobjetos de microscopio estándar utilizando un lápiz o un bolígrafo resistente a los disolventes. Asegure las diapositivas en un soporte cytospin y embudo. Fije el conjunto de diapositivas en el rotor cytospin.
5. Cytospin 150 l de BALF en 100 xg durante 5 min. Si la densidad celular es demasiado grande para efectivamenteevaluar la morfología celular, reducir el volumen hilado hacia abajo sobre las diapositivas. Permitir a las diapositivas para aire durante la noche seca.
6. Mancha Diferencial las diapositivas siguiendo los protocolos de confección. Permitir a las diapositivas para aire durante la noche seca. Cubreobjetos las diapositivas usando Permount y evaluar los portaobjetos usando un microscopio equipado con un objetivo de 20X y 40X.
7. Recoger las células restantes para su posterior análisis, tales como FACS, microscopía electrónica, microscopía confocal, la extracción de RNA para la evaluación de la expresión génica, y / o extracción de proteína de transferencia de western.

6. Evaluación Histopatología

1. Preparar los pulmones para la evaluación de histopatología. Después de 24 a 48 horas de fijación en formol, ventralmente orientar enteros los pulmones inflados e incluidos en parafina. Cortar los bloques resultantes para exponer la principal vía aérea conductora.
2. Para mejorar la precisión de puntuación, la posición de los pulmones en la misma posición y recorte cada bloque para producir la visualización longitudinal máximo de tque las vías respiratorias intrapulmonares axial principal. Desde este punto, corte 5 micras secciones seriadas y se tiñen con hematoxilina y eosina (H & E). Las secciones adicionales se pueden cortar y se prepararon para la hibridación in situ utilizando protocolos estándar.
3. Evaluar la histopatología usando un sistema de puntuación semicuantitativo basándose en los siguientes parámetros inflamatorios, que se puntúan entre 0 (ausentes) y 3 (grave): mononucleares y polimorfonucleares infiltración de células; vías respiratorias hiperplasia de las células epiteliales y lesiones; extravasación; perivascular y manguitos peribroncheolar; y el porcentaje del pulmón implicado con la inflamación. Histopatología de pulmón debe ser evaluada por un patólogo experimentado.
4. Promedio de todas las puntuaciones de los parámetros para generar una puntuación total histopatología o utilizar las puntuaciones individuales para cuantificar aspectos específicos de la progresión de la enfermedad. Llevar a cabo todos los de puntuación de una manera doble ciego, con revisores cegados a ambos genotipo y tratamiento. Este sistema de puntuación ha sido previously describió ^6,7,10.

Resultados

Las paredes celulares de las bacterias gram-negativas se componen de LPS, que es altamente abundante en el medio ambiente. La inhalación de LPS en las poblaciones humanas sensibles exacerba la reactividad de las vías respiratorias y es capaz de desencadenar una response11 inmune robusta. LPS es también un PAMP común utilizado en modelos de ratón para provocar una respuesta inmune innata robusta. En el protocolo descrito aquí, los ratones recibieron una dosis de LPS es aislado a partir de E. coli (serotipo...

Discusión

Los pasos más importantes para evaluar con éxito la respuesta inmune del huésped en los pulmones del ratón es el siguiente: 1) elegir la cepa de ratón apropiado y sexo para el modelo que se está evaluando; 2) optimizar la entrega de PAMP a los pulmones; 3) recopilar y procesar correctamente la BALF; y 4) fijan correctamente y preparar los pulmones para las evaluaciones histopatológicas.

La elección de la cepa de ratón es un factor importante en la evaluación de la respuesta inmune ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6J	The Jackson Laboratory	Stock 000664
Compact Scale	Ohaus Scale Corporation	71142845
Small Animal Rectal Thermometer	Braintree Scientific	TH 5
Rectal Probe for Rodents	Braintree Scientific	RET 3
Ear Punch	Braintree Scientific	EP-S 901
Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4	InvivoGen	LPS-EB
1x Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-023
Isoflurane	Baxter	40032609
Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand	ICAP Manufacturing	n/a
Rodent Intubation Stand	Braintree Scientific	RIS 100
Scissors (blunt/sharp)	Fisher Scientific	13-806-2
forceps (straight)	Fisher Scientific	22-327-379
forceps (45º, curved)	Fisher Scientific	10-275
Scissors (blunt/blunt)	Fisher Scientific	08-940
Pipette (200 µl Capacity)	Gilson	F123601
Ethanol	Sigma	459844
1 ml Syringe	BD Medical	301025
10 ml Syringe	BD Medical	301604
27 G x 0.5 in Needle	BD Medical	305109
Refrigerated Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-676
1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter	Harvard Apparatus	732836
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-076
4-0 Silk Braided Surgical Suture	Ethicon	A183
Luer to Tube Connector Kits	Harvard Apparatus	721406
Luer Stopcock Kit	Harvard Apparatus	721664
Tygon formula E-3603 Laboratory Tubing	Sigma	R-3603
Formalin Solution, neutral buffered, 10%	Sigma	HT501128-4L
Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	559603
Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	550950
Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	560478
Hemocytometer	Hausser Scientific	3520
Hemocytometer Cover Glasses	Thermo Scientific	22-021-801
Trypan Blue	Thermo Scientific	SV3008401
Cytology Funnel Clips	Fisher Scientific	10-357
Cytology Funnels	Fisher Scientific	10-354
Filter Cards	Fisher Scientific	22-030-410
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-1
Cover Glasses	Fisher Scientific	12-540A
Cytospin Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003
Diff Quick Staining Kit	Fisher Scientific	47733150
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500