マウスにおける宿主の免疫応答を評価する口腔咽頭気管内PAMP管理および気管支肺胞の活用

要約

病原体感染に対する宿主の免疫応答が厳密に調節されたプロセスである。マウスにおけるリポ多糖肺露光モデルを利用し、それは疾患の病因に関連付けられている複雑な機構の高解像度の評価を実施することができる。

要約

病原体に対する宿主免疫応答は、複雑な生物学的プロセスである。 インビボ研究の大部分は、古典的宿主-病原体相互作用は、マウスにおけるセレクト細菌または病原体関連分子パターン（PAMP）の腹腔内注射を活用特徴付けるために用いられる。これらの技術は、感染症の病理生物学に関連した膨大なデータが得られているが、腹腔内注射モデルは常に、肺における宿主 - 病原体相互作用の研究には適していません。マウスにおける急性肺炎症モデルを利用し、それは先天性免疫応答は、リポ多糖（LPS）を利用してホストの高分解能解析を行うことができる。ここでは、非外科的口腔咽頭気管内投与を使用して、LPSを投与し、疾患の病因に関連する臨床パラメータをモニタし、宿主の免疫応答を評価するために気管支肺胞洗浄液を利用する方法を記載している。記載されている技術のPAMPおよび病原体の多様な範囲に対する宿主自然免疫応答を研究するために広く適用可能である。同様に、若干の変更を加え、これらの技術はまた、アレルギー性​​気道炎症を評価する研究および薬理学的用途に適用することができる。

概要

病原性細菌種に関連する肺感染は、世界的な罹患率および死亡率の一般的な原因である。これらの病原体に対する宿主の免疫応答をドライブするメカニズムを決定することは、これらの感染症の影響を減衰させる新たな予防戦略と治療薬の開発を推進していきます。ここに記載されたプロトコルの全体的な目標は、生きた細菌の代用物としての病原体関連分子パターン（PAMP）を用いて病原体感染に対する宿主の先天性免疫応答を評価するために柔軟な方法をユーザに提供することである。細菌に対する宿主自然免疫応答を評価する以前の研究の大部分は、実行が比較的容易に腹膜モデルに焦点を当てている。これらのモデルは非常に有用であり、宿主 - 病原相互作用および全身性炎症分野で大きな進歩をもたらしましたが、これらのモデルから生成されたデータには、常に問題研究のための適切ではありませんinvolvi呼吸器系ngの。ここでは、急性肺炎症の肺モデルは、古典的な腹腔内（ip）注射モデルの実用的かつ臨床的に関連する拡張として提案されている。提案された技術は、器官特異的モデル系における先天性免疫応答の局所的評価を可能にする。

ここで説明する方法は、ユーザが共通のPAMPであるLPSに対する宿主の免疫応答を評価することを可能にするための簡単​​かつ堅牢な技術を提供するように設計されている。方法は、マウスおよび呼吸器感染症及び急性肺障害に罹患している¹ヒト患者において観察される病態生理学的特徴の多くを模倣するの肺におけるロバストな先天性免疫応答を誘導するLPSの気管内（it）点滴に基づいている。この技術の主な利点は、ユーザがインビボ研究導通に関連付けられた交絡因子および安全性の懸念なしに宿主免疫応答を評価することを可能にすることである生菌を使用した。同様に、このプロトコルで説明した露光の口腔咽頭のIT投与経路は、行政（中）、鼻腔内、外科、IT管理など、他の一般的に利用された技術、上の重要な利点を持っています。例えば、口腔咽頭IT管理は、典型的に、鼻腔内のエージェントの損失に肺沈着の増加変動を患っており^、2〜4洞管理、中に比べて比較的正確な投薬および肺沈着を可能にします。それの投与経路は、これらの空洞を回避し、気管や気道に直接アクセスすることができます。同様に、外科的なITアプローチは、かなり多くの病的な投与方法で、マスターに広範囲の訓練を必要とします。ここで説明するプロトコルも記述一般的な技術と炎症の進行を評価し、LUを調製するための適切な技術を記載したプロトコルで終了するために使用する代理マーカーが含まれる組織病理学的評価のためのNGS。これらのプロトコルは、各々の動物から生成されたデータを最大にすることによって、各試験に必要なマウスの数を最小化に焦点を当てている。

記載されたプロトコルは、非常に柔軟であり、容易に多様な範囲のPAMPのダメージ関連分子パターン（減衰）を評価するために修飾することができる。さらに、いくつかの追加の修飾と、これらのプロトコルはまた、アレルギー性気道疾患の進行または生細菌、ウイルスまたは真菌^5-10有する宿主-病原体相互作用を評価する研究に適用することができる。

プロトコル

すべての研究は、バージニア工科大学のための制度的管理使用委員会（IACUC）の承認の下や実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に従って行った。

1。口腔咽頭の管理ページを使用してLPSの気管内（IT）の接種

1. 各動物を一意に耳パンチ、耳標、またはその他の制度的に承認する方法のいずれかを使用して識別されていることを確認します。
2. 各動物についてベースライン体重および体温を記録する。
3. LPSの作業用ストックを準備します。各マウスは、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中1 mg / kgのLPSを50μl量を受けるであろう。モック処置した動物は、1×PBSを50μlの線量を受け取ります。
4. 次のドロップ法を用いたイソフルランの投与のために適切な容器を準備します。施設のガイドラインには、イソフルラン及びその他の麻酔薬と前initiatへの使用に関して異なる場合どんな研究をING、人が十分に満たされているすべてのガイドラインを確実にするために動物実験/福祉の彼らの機関の部門に連絡してください。ドロップ法イソフルランを選択できない場合、他の麻酔剤は、許容される代替物である。
   1. 適切な安全キャビネット内で、500ミリリットルのビーカーの底に折り畳まれた吸収性の紙タオルと場所にイソフルランの約3ミリリットルを適用します。
   2. ペーパータオルの上にアルミニウム箔の小片を配置し、透明な蓋付きビーカーを覆う。
5. その接種の際に利用されるツールおよび試薬を準備します。挿管スタンドに頭の動物を確保するゴムバンドを配置します。この手順では、ストレートピンセット、角度のついた又は湾曲したピンセット、とヒントとP200のピペットが必要になります。
6. 挿管スタンドの横に容易にアクセス可能な場所にピペットチップ、所定の位置に負荷のLPSを50μl。
7. マウスを麻酔イソフルラン室に動物を配置し、透明な蓋で容器を覆うことにより。第一室に置かれたとき、迅速かつ浅くされる、動物の呼吸パターンを観察します。呼吸率は通常、チャンバー内に配置する30秒以内に達成されている1息/ 2秒、近づくと動物が十分に麻酔をします。滴下法イソフルランを使用して承認された動物プロトコルに記載されているように、マウスを麻酔しなければならない。
8. 室から麻酔をかけたマウスを取り外し、フロント切歯によって挿管スタンドに動物を一時停止する。動物が確実に抑制し、口や舌がアクセス可能であることを確認してください。
9. 優しくストレートピンセットで舌を固定します。角度のついた鉗子で舌をつかみ、若干の抵抗が感じられるまでゆっくりと口から引き出します。このアクションは、喉頭蓋をブロックし、気管へのアクセスを得るために十分である。
10. に舌を押したまま延長された位置は、喉の奥にLPSを50μlの用量を投与し、すぐに手袋をはめた指で、動物の鼻の穴をカバーしています。マウスが吸入されるまでLPSは、喉の奥に表示されます。
11. 鼻の穴をカバーし、5月10日追加の呼吸のために拡張舌を押し続けます。
12. 挿管スタンドからマウスを取り外して、麻酔から回復するまで戻って新しいケージに動物を配置します。
13. 疾患の進行に関連する代理マーカーを監視します。体重および体温研究の期間毎に4-8時間を監視すべきである。同様に、行動特性の増加罹患率と関連する臨床症状を評価する。
14. LPS暴露後の特定の時点で疾患の進行、収穫マウスを評価した。 LPS曝露後の収穫のための典型的な時点は0、6、12、18、24、および48時間が含まれています。回復および生存率を評価するために、7 DA用のマウスを評価YS接種後。

2。血清および気管支肺胞洗浄液（BALF）コレクション

1. 制度的に承認された方法を使用して、マウスを生け贄に捧げる。
2. その裏に動物を置き、高さ（1.27cm）の中で、理想的に0.5、剖検ボードに固定します。
3. 70％エタノールでマウス全体を濡らす。
4. 27 Gの針を有する1ミリリットルの注射器を使用して、前に任意の切開を行うに心臓穿刺を行っています。これは、単一のマウスから全血の500〜800μLを撤回することが可能なはずである。
5. 注射器から針を外し、前標識1.5ミリリットルの微量遠心管に全血を転送します。血清収集のために、全血を室温で少なくとも30分間凝固させることを可能にする。血清コレクションに加えて、この手順は、免疫細胞を研究するために、循環、全血を収集する前に、チューブ及びシリンジ内の抗凝固剤を組み込むことによって修飾することができる。
6. 横切開aを作るマウスの下顎に腹腔と腹膜腔からの垂直切開の長さを渡ります。
7. 鉗子を使用して、切開の両側をつかみ、静かに、基礎となる腹膜や胸腔から肌を引き出します。
8. ダイアフラムを切らないように注意しながら、性器から胸骨に腹腔の長さに沿って大きな切開を加えます。穏やかに腎臓の一つへのアクセスを可能にする腹腔内に腸をシフトする。
9. 灌流のための排水ポイントとして機能する腎臓につながる腎静脈を切った。
10. ニックは、振動板には、はさみを使って心臓の左側を露出させ、肺と心臓を避けるように注意しながら。
11. 手動で27 G針および1×PBS溶液で10mlの注射器を用いて心臓を灌流。生理食塩水が肺に強制されていないことを確実にするために灌流中、無理な力を加えないようにしてください。残血門脈切開から排出should。
12. 慎重に心臓や肺を切らないように注意しながら、鈍/鈍ハサミを使用して胸骨に沿って胸郭を切った。誤ってこの手順の間に肺を切断して大幅に収集されたBALFの量を減らすことになり、適切に固定液で肺を膨らませることができないことになります。
13. 静かにピンセットを用いて胸郭から心臓や肺を分離します。慎重に、できるだけ背骨の近くに鈍/鈍ハサミを使用して胸郭の各セクションをカットし、完全に両方のセクションを削除します。
14. ピンセットを用いて唾液腺を分離またはハサミで除去してください、気管を露出させる。
15. 慎重にハサミを使って気管をオーバーレイ筋肉を切る。これは、気管このプロセス中に切断されないことが必須である。
16. はさみを使用して、気管の上にある鎖骨を分離。
17. 優しく鉗子を使用して、胸腺を把握し、心臓から組織を持ち上げます。に注意しながら、はさみを使用して、胸腺を削除心臓や肺を切断しないようにします。
18. 角度のついたはさみ（45〜90度の角度、シャープ/シャープ）を使用して、1〜2輪喉頭下の気管に小さな横切開する。切開はしっかりとカニューレを固定するのに十分な大きさでなければなりません。
19. テーパ端部を切開下に2〜3気管輪を拡張するようにカニューレを挿入し、絹縫合糸を使用して所定の位置にカニューレを固定します。縫合糸が気管と食道の間を通過し、カニューレにきつく引っ張られていることを確認してください。
20. ハンクス溶液（HBSS）1mlで1ミリリットルの注射器を記入し、ゆっくりとカニューレにそのルアーを挿入します。
21. ゆっくりと、しかし一定の動きを使用して、肺を膨らませる、気管に〜900μLを注入し、すぐにHBSSを撤回。 15ミリリットルコニカルチューブに回収BALFを配置します。
22. 将来の分析のために、BALFの約3ミリリットルを収集するには、この洗浄を2回追加を繰り返します。使用するまで氷上で、または4℃でBALF保管してください。

3。組織病理準備

1. 肺膨張スタンドに10ミリリットルの注射器を挿入します。シリンジにルアーにチューブ、ストップコックにルアー、およびストップコックを組み立てます。ストップコックが閉じた位置にあることを確認してください。 10mlシリンジは、重力流溜めとして機能する。リザーバは、動物の上に4.75スタンドとリザーバの上部が動物上で10.5を拡張する必要があり、インフレに添付する必要があります。
2. 中性緩衝ホルマリン溶液で注射器を埋める。注射器が完全に固定液で満たされていることを確認します。
3. チューブの開放端部の下に吸収性タオルを置き、固定液は、チューブを埋めることができるようにストップコックを開いてください。固定液は、チューブから流れる始まると、すぐにストップコックを閉じて、固定剤でトップに注射器を補充します。それは、注射器が完全に肺のインフレ圧力の適切な量を提供するために満たされることが重要である。
4. 静かに約1〜2気管輪カニューレの終わりの下に、気管の下に縫合糸の第二の一枚を渡す。
5. 縫合糸の単一緩い結び目を作る。しかし、結び目をしっかり引っ張らないでください。
6. カニューレにマウスインフレスタンドからチューブを挿入します。
7. ストップコックを開き、肺が重力インフレによって埋めることができます。
8. 肺は彼らの最大のインフレ水準に達すると、縫合糸がきつく引っ張り、二結び目を作る。
9. ストップコックを閉じて、カニューレからチューブを取り外します。
10. 静かにピンセットで縫合糸をつかみ、指でカニューレを保持することによって気管からカニューレを取り外します。しっかりと胸腔とバックマウスの鼻に向けてカニューレに向けて縫合糸を引っ張る。
11. 優しく鉗子で気管または縫合糸をつかみ、首キャビティから気管に持ち上げます。
12. 鈍いはさみを使用して結ば縫合糸に気管尾を切断。
13. 一度trache離れてマウスの気管を引っ張って始め、基盤となる組織がない。優しく胸腔から肺を持ち上げます。
14. 慎重に胸腔内の肺を保持する結合組織をカット。根本的な接続を切断しながら、離れてマウスの体から気管を引っ張って継続し、着実に上向きの力を適用します。肺を切らないように注意してください。心臓が左に、この方法を使用して肺に接続する必要があることに注意してください。
15. 肺が削除された後は、緩衝ホルマリン10mlに配置します。
16. ジェノタイピングのためのマウス尾の部分を削除します。
17. 適切な施設のガイドライン以下のマウス死体を処分。

4。サイトカイン評価

1. 血清を単離するために5分間12,000×gで、ステップ2.5の下で採取した全血を、遠心分離する。 -80℃での前標識1.5 mlのマイクロ遠心チューブとストアに血清を転送
2. 干せるを評価ELISAまたは他の同様のアッセイによるMのサイトカインレベル。製造指示に従って、アッセイに応じて、適切な希釈バッファーで1時20分 - 血清を1:5に希釈します。これらの希釈液は、経験的に前のサンプルの大部分を実行しているに判断すべきものである。
3. 採取した血清の低容量に起因して、半分にELISAプレート上にロードしたサンプルの体積を減少させる。たとえば、ほとんどの市販のELISAは、標準および試料100μlの容量を利用する。標本、負荷50規格のμLとウェルあたり希釈した血清を節約する。
4. 遠心分離機5分間200×gで冷蔵卓上遠心機でBALF。 2に、無細胞上清を移し-80℃で1.5 mlマイクロチューブや店舗を前標識
5. 希釈することなく、ELISAまたは他の類似のアッセイにより、BALFのサイトカインを評価します。
6. -80℃で保存し、未使用の血清およびBALF

5。染およびBAL細胞性評価

1. BALFを遠心分離し、完全HBSSを除去した後、低張性食塩水を用いてペレット化した赤血球を溶解。蒸留水900μLで細胞を懸濁します。すぐに10倍のPBS 100μLを加える。
2. 個別に各サンプルを溶解。サンプルは、赤血球の過剰な量が含まれている場合、細胞は、5分および赤血球溶解プロトコル400×gでテーブルトップ遠心機でペレット化することができる繰り返すことができる。
3. トリパンブルー染色で10倍または20倍の倍率の下で血球計を使用して、1ミリリットルの懸濁液中の総BALF細胞性を決定します。細胞/ mlとして、これらのデータを評価し、提示する。
4. サイトスピンや染のための材料を準備します。鉛筆や耐溶剤性のペンを使用して標準的な顕微鏡用スライドにラベルを付けます。サイトスピンブラケットと漏斗にスライドを固定します。サイトスピンローターでスライドアセンブリを固定します。
5. 5分間100×gでBALFのサイトスピン150μL。細胞密度を効果的に大きすぎると細胞形態を評価し、スライド上にスピンダウンし、ボリュームを下げる。スライドを一晩乾燥を放送することができます。
6. 差動製造プロトコル以下のスライドを染色する。スライドを一晩乾燥を放送することができます。パーマウントを使用してスライドをカバースリップし、20Xおよび40X目的を備えた顕微鏡を使用してスライドを評価します。
7. 例えば、FACS、電子顕微鏡、共焦点顕微鏡、遺伝子発現の評価のためのRNAの抽出、および/またはウェスタンブロットのためのタンパク質抽出などのその後の分析のために残りの細胞を、収穫。

6。組織病理学的評価

1. 組織病理学的評価のための肺を準備します。ホルマリン固定の24〜48時間後に、腹全体の膨張した肺を配向し、パラフィンに包埋した。メイン誘導気道を露出させられたブロックをカット。
2. 採点の精度を向上させるために、同じ位置に肺を位置決めし、tの最大前後視覚化を得るために各ブロックをトリム彼はメインの軸方向の気道を肺内。この点から、5ミクロンの連続切片ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）で染色を切った。追加の切片を切り出し、標準的なプロトコルを用いてin situハイブリダイゼーションのために調製することができる。
3. 0（不在）及び3（重度）の間で採点され、以下の炎症性パラメータに基づいて半定量的スコアリングシステムを用いて組織病理を評価する：核及び多核細胞浸潤;上皮細胞過形成や傷害気道;溢出;血管周囲とperibroncheolarカフィング;および炎症に関与肺のパーセント。肺の組織病理は、経験豊富な病理学者で評価してください。
4. 総組織病理学スコアを生成したり、病気の進行の特定の側面を定量化するために個々のスコアを使用して、パラメータのスコアがすべて平均。遺伝子型と治療の両方を知らされていない査読者との、二重盲検法ですべてのスコアリングを行っています。このスコアリングシステムは、previouslされているYは^、6,7,10を記述した。

結果

グラム陰性菌の細胞壁は、環境において非常に豊富であるLPS、から構成されている。敏感なヒト集団におけるLPSの吸入は気道反応性を悪化させると、強い免疫response11をトリガすることができます。 LPSはまた、堅牢な先天性免疫応答を誘発するためにマウスモデルで使用される一般的なPAMPである。ここに記載されたプロトコルでは、マウスは、E.から単離されたLPSのそれの投与を受け?...

ディスカッション

成功したマウスの肺における宿主免疫応答を評価するための最も重要なステップは次のとおりです。1）評価対象モデルに適したマウス系統、性別を選択する。 2）肺へのPAMPの配信を最適化する。 3）正しくBALFを収集し、処理する。そして4）適切に修正し、組織病理学的評価のための肺の準備。

マウス株の選択は、宿主の免疫応答を評価する上で重要な要因である。 C57BL...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6J	The Jackson Laboratory	Stock 000664
Compact Scale	Ohaus Scale Corporation	71142845
Small Animal Rectal Thermometer	Braintree Scientific	TH 5
Rectal Probe for Rodents	Braintree Scientific	RET 3
Ear Punch	Braintree Scientific	EP-S 901
Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4	InvivoGen	LPS-EB
1x Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-023
Isoflurane	Baxter	40032609
Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand	ICAP Manufacturing	n/a
Rodent Intubation Stand	Braintree Scientific	RIS 100
Scissors (blunt/sharp)	Fisher Scientific	13-806-2
forceps (straight)	Fisher Scientific	22-327-379
forceps (45º, curved)	Fisher Scientific	10-275
Scissors (blunt/blunt)	Fisher Scientific	08-940
Pipette (200 µl Capacity)	Gilson	F123601
Ethanol	Sigma	459844
1 ml Syringe	BD Medical	301025
10 ml Syringe	BD Medical	301604
27 G x 0.5 in Needle	BD Medical	305109
Refrigerated Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-676
1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter	Harvard Apparatus	732836
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-076
4-0 Silk Braided Surgical Suture	Ethicon	A183
Luer to Tube Connector Kits	Harvard Apparatus	721406
Luer Stopcock Kit	Harvard Apparatus	721664
Tygon formula E-3603 Laboratory Tubing	Sigma	R-3603
Formalin Solution, neutral buffered, 10%	Sigma	HT501128-4L
Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	559603
Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	550950
Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	560478
Hemocytometer	Hausser Scientific	3520
Hemocytometer Cover Glasses	Thermo Scientific	22-021-801
Trypan Blue	Thermo Scientific	SV3008401
Cytology Funnel Clips	Fisher Scientific	10-357
Cytology Funnels	Fisher Scientific	10-354
Filter Cards	Fisher Scientific	22-030-410
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-1
Cover Glasses	Fisher Scientific	12-540A
Cytospin Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003
Diff Quick Staining Kit	Fisher Scientific	47733150
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500