Использование ротоглотки интратрахеального PAMP администрации и бронхоальвеолярного лаважа для оценки иммунного ответа хозяина у мышей

Резюме

Хозяин иммунный ответ на возбудителя инфекции является жестко регулируется процесс. Используя легких модель экспозиции липополисахарида у мышей, можно проводить оценки с высоким разрешением сложных механизмов, связанных с патогенезе заболевания.

Аннотация

Хозяин иммунный ответ на патогены является сложным биологическим процессом. Большинство естественных условиях исследования в классически используется для характеристики хост-патогенные взаимодействия воспользоваться внутрибрюшинных инъекций выберите бактерий или патогенных связанные молекулярные модели (PAMPs) у мышей. Хотя эти методы дали огромные данные, связанные с инфекционными патобиологии заболевания, внутрибрюшинные модели инъекции не всегда подходят для хост-патогенных исследований взаимодействия в легких. Используя острый воспаление легких у мышей модель, можно проводить анализ с высоким разрешением хоста врожденного иммунного ответа с использованием липополисахарид (LPS). Здесь мы опишем методы для управления ЛПС с помощью нехирургических ротоглотки трахею, контролировать клинические параметры, связанные с патогенезе заболевания, и использовать БАЛ оценить иммунного ответа. Методики, описанныешироко применяются для изучения хоста врожденной иммунной реакции на разнообразных PAMPs и патогенных микроорганизмов. Кроме того, с незначительными изменениями, эти методы могут также применяться в исследований по оценке аллергическое воспаление дыхательных путей и в фармакологических применений.

Введение

Легочные инфекции, связанные с патогенными бактериями вида являются частой причиной глобального заболеваемости и смертности. Определение механизмов, которые управляют иммунного ответа на эти патогенов будет способствовать развитию новых стратегий профилактики и терапевтических агентов, которые будут уменьшить воздействие этих инфекций. Общая цель протокола, описанного здесь, чтобы предоставить пользователю с гибким методом для оценки хоста врожденной иммунной реакции на возбудителя инфекции с использованием патогенных микроорганизмов, связанное молекулярную модель (PAMP) в качестве суррогата живых бактерий. Большинство предшествующих исследований по оценке хоста врожденной иммунной реакции на бактерии были сосредоточены на перитонеальных моделей из-за относительной легкости исполнения. В то время как эти модели являются очень полезными и привели к значительным достижениям в области хозяин-патоген взаимодействий и системного воспаления, данные, полученные от этих моделей не всегда подходят для исследований involviнг дыхательную систему. Здесь, легочной модели острого воспаления легких, предлагается в качестве практического и клинически значимого расширения классических внутрибрюшинного (IP) моделей инъекций. Предложенный способ позволяет локальной оценки врожденного иммунного ответа в модельной системе конкретного органа.

Методы, описанные здесь были разработаны для обеспечения простой и надежный метод, позволяющий пользователям оценить иммунного ответа на ЛПС, которая является общей ПАМП. Методы основаны на интратрахеального (это) закапывания ЛПС, который вызывает устойчивую врожденную иммунную реакцию в легких мышей и имитирует многих патофизиологических особенностей, наблюдаемых у больных людей, страдающих от респираторных инфекций и острого повреждения легких ^1. Основное преимущество этого метода в том, что он позволяет пользователю оценить иммунного ответа без сопутствующих факторов и проблем безопасности, связанных с проведением в естественных условиях исследованияиспользуя живые бактерии. Аналогично, ротоглотки это управление путь воздействия, описанного в данном протоколе имеет значительные преимущества по сравнению с другими обычно используемыми способами, в том числе интраназального (в) введения и введения хирургического он. Например, ротоглотки администрация это позволяет относительно точное дозирование и отложение легких по сравнению с в администрации, которая, как правило, страдает от повышенной изменчивости отложения в легких в связи с потерей средств в полости носа и придаточных пазух ^2-4. Маршрут его администрация обходит эти полости и обеспечивает прямой доступ к трахее и дыхательных путей. Кроме того, хирургическое это подход является методом значительно более болезненный администрация и требует серьезной подготовки к хозяину. Протоколы, описанные здесь, также включают в себя описание общих методов и суррогатные маркеры, используемые для оценки прогрессирования воспаления и заканчиваться протокола, описывающего правильные методы для подготовки луNGS для оценки гистопатология. Эти протоколы сосредоточены на минимизации количества мышей, необходимых для каждого исследования путем максимизации данные, полученные от каждого животного.

Протоколы, описанные очень гибкие и могут быть легко изменены, чтобы оценить разнообразную PAMPs дальности и ущерба, связанных молекулярных моделей (DAMPS). Кроме того, с несколькими дополнительными модификациями, эти протоколы могут также применяться для исследований, оценивающих развитие аллергической дыхательных путей заболевания или хост-патогенных взаимодействия с живыми бактериями, вирусами или грибами ^5-10.

протокол

Все исследования проводились с одобрения Комитета Институциональная уходу и использованию (IACUC) для Вирджинии и в соответствии с Национальными Институтами Руководство здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Интратрахеального (это) Прививка ЛПС Использование ротоглотки администрации

1. Убедитесь, что каждое животное однозначно идентифицируется с использованием либо уха удар, ушную бирку или другой институционально утвержденного метода.
2. Запись исходного веса тела и температуру тела для каждого животного.
3. Подготовьте рабочую запас ЛПС. Каждая мышь получит 50 мкл дозу 1 мг / кг LPS в 1x фосфатным буферным раствором (PBS). Mock обработанных животных получит 50 мкл дозу 1x PBS.
4. Подготовить соответствующее камеру для введения изофлураном, используя следующий метод падение. Институциональные принципы меняться в связи с использованием изофлураном и других анестетиков и до initiatING какие-либо исследования, следует обратиться в отдел своего учреждения животного Care / благосостояния застраховать на все руководящие принципы надлежащим образом выполняли. Если метод падение изофлюран это не вариант, другие анестетики приемлемых альтернатив.
   1. В соответствующем безопасности шкафу, применять примерно 3 мл изофлуран в сложенном абсорбирующего бумажным полотенцем и поместить в нижней части стакан емкостью 500 мл.
   2. Поместите небольшой кусочек алюминиевой фольги на верхней части бумажным полотенцем и покрывают стакан с прозрачной крышкой.
5. Подготовьте инструменты и реагенты, которые будут использоваться во время его заражения. Установите резиновую ленту, которая будет обеспечить животные головой о интубации стенде. Эта процедура потребует пару прямых щипцов, пару угловых или изогнутых щипцов, и P200 пипетки с советами.
6. Нагрузка 50 мкл LPS в пипетки и место в легкодоступном месте около интубации стенде.
7. Обезболить мышьпоместив животное в камере изофлуран и охватывающий камеру с прозрачной крышкой. Соблюдайте образцы дыхания животного, которое будет быстрым и поверхностным, когда впервые помещают в камеру. Животное будет достаточно наркозом при дыхании ставки приближаются 1 дыхание / 2 сек, что обычно достигается в течение 30 секунд размещения в камере. Мышь должна быть под наркозом, как указано в утвержденном протоколе животных с использованием метода падение изофлурана.
8. Снимите наркозом мышь из камеры и приостановить животное на интубации стоять его передними резцами. Застраховать что животное надежно сдержан и рот и язык доступны.
9. Аккуратно закрепите язык с прямыми щипцами. Возьмитесь за язык с угловыми пинцетом и аккуратно выньте ее из уст пока небольшое не почувствуете сопротивление. Это действие является достаточным, чтобы блокировать надгортанник и получить доступ к трахее.
10. Продолжая удерживать язык ввыдвинутое положение, управлять 50 мкл дозу ЛПС в задней части горла и сразу покрыть ноздри животного с палец в перчатке. ЛПС будут видны в задней части горла, пока мышь не вдыхает.
11. Продолжить, чтобы покрыть ноздри и удерживайте язык продлен на 5-10 дополнительных вдохов.
12. Отключив мышь от интубации стенде и поместите животное обратно в новую клетку, пока он не оправится от анестезии.
13. Монитор суррогатных маркеров, связанных с прогрессированием заболевания. Вес тела и температура тела следует контролировать каждый 4-8 ч в течение всего срока исследования. Кроме того, оценить поведенческие характеристики и клинические симптомы, связанные с повышенной заболеваемости.
14. Для оценки прогрессирования заболевания урожая мышей в определенных временных точках после воздействия ЛПС. Типичные временные точки для сбора урожая после воздействия ЛПС включают 0, 6, 12, 18, 24 и 48 час. Для оценки восстановление и выживание, оценить мышей для 7 даYS после прививки.

2. Сыворотка и БАЛ (БАЛ) Коллекция

1. Жертвоприношение мышь с помощью институционально утвержденного метода.
2. Место животное на спину и закрепите его на аутопсии борту, в идеале 0,5 в (1,27 см) в высоту.
3. Смочите всю мышь с 70% этанола.
4. Использование 1 мл шприц с иглой 27 G, провести пункции сердца до внесения каких-либо разрезов. Должно быть возможно вывести 500-800 мкл цельной крови из одного мыши.
5. Удалите иглу от шприца и передачи цельной крови к prelabeled 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Для сбора сыворотки, позволяют цельной крови для коагуляции, по крайней мере 30 мин при комнатной температуре. В дополнение к сбору сыворотки, эта процедура также может быть изменен на основе антикоагулянт в трубке и шприца, до сбора цельной крови, чтобы изучить циркулирующих иммунных клеток.
6. Сделать горизонтальный разрез Апересекают длину брюшной полости и вертикальный разрез из брюшной полости в нижней челюсти мыши.
7. Использование щипцов, возьмитесь за обе стороны разреза и осторожно потяните кожу далеко от базовых брюшины и грудной полостей.
8. Сделать большой разрез вдоль длины брюшную полость из половых органов к грудине, заботясь, чтобы избежать сокращения диафрагмы. Аккуратно перенести кишечник в брюшной полости, чтобы обеспечить доступ к одной из почек.
9. Обрежьте почечной вены, ведущие к почке, чтобы служить в качестве дренажного точки для перфузии.
10. Ник диафрагма с помощью ножниц, стараясь избежать легкие и сердце, чтобы выставить левую сторону сердца.
11. Вручную заливать сердца с помощью 10 мл шприц с иглой 27 G и раствора 1X PBS. Избегайте применения чрезмерной силы во время перфузии для того, чтобы солевой раствор не был вынужден в легкие. Остальные крови должно вытечь из воротной вены разрез.
12. Аккуратно вырежьте грудную клетку вдоль грудины с использованием тупых / тупые ножницы, заботясь, чтобы избежать сокращения сердца и легких. Случайно резки легкие во время этой процедуры позволит значительно сократить количество БАЛ собранную и приведет к неспособности правильно раздувать легкие с фиксатором.
13. Аккуратно изолировать сердце и легкие вдали от грудной клетки с помощью щипцов. Аккуратно вырежьте каждую секцию грудной клетки, используя тупые / тупые ножницы как можно ближе к позвоночнику, насколько это возможно и полностью удалить обе секции.
14. Отделите слюнных желез с помощью щипцов или удалить их с помощью ножниц, чтобы выставить в трахею.
15. Аккуратно вырежьте мышцы, которые Overlay трахею с помощью ножниц. Очень важно, чтобы трахеи не быть сокращены в ходе этого процесса.
16. Используя ножницы, отделить ключицу, покрывающий трахею.
17. Аккуратно понять тимус с помощью щипцов и поднимите ткань от сердца. Снимите тимус с помощью ножниц, а с учетом необходимостиизбежать сокращения сердца или легких.
18. Сделайте небольшой горизонтальный разрез в трахее 1-2 кольца ниже гортани с использованием угловые ножницы (45-90 угол º, острый / острый). Разрез должен быть достаточно большим, чтобы надежно закрепить канюлю.
19. Вставьте канюлю таким образом, что конический конец простирается 2-3 кольца трахеи ниже разреза и закрепить канюлю на месте с помощью шелковый шов. Убедитесь, что шов проходит между трахеи и пищевода и сильно натянута на канюли.
20. Заполните 1 мл шприц с 1 мл Хенкса физиологический раствор (HBSS) и осторожно вставить его Луер в канюлю.
21. Использование медленный, но постоянное движение, придать ~ 900 мкл в трахею, раздувая легкие, и сразу же снять HBSS. Поместите восстановленный БАЛ в 15 мл коническую трубку.
22. Повторите этот промывание 2 раза, чтобы собрать примерно 3 мл БАЛ для последующего анализа. не хранить БАЛ на льду или при 4 ° С до готовности к использованию.

3. Гистопатология Подготовка

1. Вставка 10 мл шприц в легких инфляции стенда. Соберите трубку к Luer, в Luer к краном, и краном в шприц. Убедитесь, что кран находится в закрытом положении. Шприц 10 мл будет служить в качестве резервуара тяжести течения. Резервуар должен быть прикреплен к инфляции стоять 4,75 в выше животного и верхняя часть резервуара должна распространяться 10,5 в выше животного.
2. Заполните шприц с нейтральным буферным раствором формалина. Убедитесь, что шприц полностью заполнен фиксатора.
3. Поместите абсорбирующее полотенце под открытом конце трубки и открыть кран, чтобы фиксатор, чтобы заполнить трубки. Как только фиксатор начинается течет из трубки, немедленно закрыть кран и залить шприц к вершине с фиксатором. Важно, что шприц быть полностью заполнен, чтобы обеспечить соответствующее количество давления на инфляцию легких.
4. Осторожно пройти вторую часть шовной нити под трахеи, примерно в 1-2 кольца трахеи ниже конца канюли.
5. Свяжите один свободный узел на нити; Однако, не тяните узел туго.
6. Вставьте трубку от инфляции мыши стоять в канюлю.
7. Откройте кран и позволяют легкие заполнить самотеком инфляции.
8. После того, как легкие достигают своего максимального уровня инфляции, тянуть шов плотно и завяжите второй узел.
9. Закройте кран и снимите трубку из канюли.
10. Аккуратно снимите канюли из трахеи, взявшись за шов с парой щипцов и проведение канюли с пальцами. Твердо тянуть шов вниз к грудной полости и канюли обратно к носу мыши.
11. Осторожно возьмитесь за трахею или швы щипцами и поднимите трахею от полости шеи.
12. Sever трахеи каудально к привязанной шва с помощью тупых ножниц.
13. Как только tracheсвободен от подлежащих тканей, начинают тянуть в трахею от мыши. Аккуратно поднимите легкие из грудной полости.
14. Аккуратно вырежьте соединительную ткань держит легкие в грудной полости. Продолжайте передвигать трахею от тела мыши и применять устойчивый восходящий силы при сокращении основные соединения. Позаботьтесь, чтобы избежать сокращения легкие. Обратите внимание, что сердце должно быть оставлено прикреплен к легким использованием этого метода.
15. После того, как легкие были удалены, разместить их в 10 мл буферном растворе формалина.
16. Удалить раздел хвоста мыши для генотипирования.
17. Утилизировать туши мыши, следуя соответствующим ведомственным руководящим принципам.

4. Цитокинов Оценка

1. Центрифуга цельной крови, собранной в соответствии с шагом 2,5, при 12000 х г в течение 5 мин, чтобы изолировать сыворотки. Трансфер сыворотку к prelabeled 1,5 мл трубки микроцентрифужных и хранить при температуре -80 ° С.
2. Оцените СеруУровни м цитокинов ELISA или другого подобного анализа. Развести сыворотку 1:05 - 1:20 в соответствующем буфере для разведения, в зависимости от анализа, следуя инструкциям производителей. Эти разведения следует эмпирически определяется до запуска большую часть образцов.
3. Из-за низкого объема сыворотки, собранной, уменьшить объем образца, загруженной на тарелку ELISA наполовину. Например, большинство коммерческих ИФА используют 100 томов мкл стандартов и образцов. Для экономии образцы, нагрузку 50 мкл стандартов и разбавленный сыворотку на лунку.
4. Центрифуга БАЛ в охлажденном настольной центрифуге при 200 х г в течение 5 мин. Перенести бесплатно супернатант клеток на два prelabeled 1,5 мл микроцентрифужных пробирок и хранить при температуре -80 ° С.
5. Оцените БАЛ цитокины по ELISA или другого подобного анализа без разбавления.
6. Храните неиспользуемые сыворотки и БАЛ при -80 ° С

5. Дифференциальный Окрашивание и БАЛ клеточность Оценка

1. После БАЛ центрифугирования и полного удаления HBSS, лизирования осаждали красных кровяных клеток с использованием гипотонического физиологический раствор. Ресуспендируют клеток в 900 мкл дистиллированной воды. Сразу добавить 100 мкл 10х PBS.
2. Индивидуально лизировать каждый образец. Если образцы содержат избыточное количество эритроцитов, клетки могут быть осаждали в таблице центрифуге при 400 х г в течение 5 мин и красный протокол лизис клеток крови может быть повторен.
3. Определите общее БАЛ клеточность в суспензии 1 мл с использованием гемацитометра под 10X или 20-кратным увеличением с трипанового синего окрашивания. Оценка и представить эти данные в виде клеток / мл.
4. Подготовка материалов для Cytospin и дифференциального окрашивания. Этикетка стандартные микроскопа с помощью карандаша или устойчивы к воздействию растворителей ручку. Безопасность слайды в Cytospin кронштейном и воронку. Закрепите слайд сборку в Cytospin ротора.
5. Cytospin 150 мкл БАЛ при 100 мкг в течение 5 мин. Если плотность клеток слишком велика, чтобы эффективнооценки клеточной морфологии, уменьшите громкость закрученная вниз на слайдах. Разрешить слайды высохнуть на воздухе в течение ночи.
6. Дифференциальный пятно слайды следуя производит протоколов. Разрешить слайды высохнуть на воздухе в течение ночи. Покровные стекла слайдов с использованием предметный столик Permount и оценивать слайды с помощью микроскопа, снабженного 20X 40X и цели.
7. Урожай оставшиеся клетки для последующего анализа, такие как FACS, электронной микроскопии, конфокальной микроскопии, выделения РНК для оценки экспрессии генов, и / или экстракции белка для вестерн-блоттинга.

6. Гистопатология Оценка

1. Подготовка легкие для оценки патоморфологическую. После 24-48 часов формалина фиксации, вентрально ориентировать целые завышенные легкие и заливали в парафин. Вырезать результирующие блоки выставить основной проводящий дыхательных путей.
2. Чтобы повысить точность подсчета очков, поместите в легкие в том же положении и отделка каждого блока, чтобы получить максимальную продольную визуализацию тон внутрилегочного основной осевой дыхательных путей. С этой точки, вырезать 5 микрон серийных срезов и пятно с гематоксилином и эозином (H & E). Дополнительные разделы могут быть сокращены и подготовлены к в гибридизация с использованием стандартных протоколов.
3. Оцените гистопатологию помощью полуколичественную систему оценки, основанную на следующих воспалительных параметров, которые набрали от 0 (отсутствуют) и 3 (тяжелой): мононуклеарной и полиморфноядерных клеточной инфильтрацией; эпителия дыхательных путей гиперплазии клеток и травм; экстравазация; периваскулярный и peribroncheolar образование скоплений лейкоцитов вокруг кровеносных сосудов; и процент легких, связанных с воспалением. Легких гистопатология должны быть оценены опытным патологоанатомом.
4. Средний все оценки параметров для генерации общий балл гистопатология или использовать индивидуальные оценки количественно определенные аспекты прогрессирования заболевания. Провести все забил в двойном слепом, с рецензентами ослепленных и к генотипа и лечения. Эта система подсчета очков была previouslу описано ^6,7,10.

Результаты

Клеточные стенки грамотрицательных бактерий состоят из LPS, что весьма распространены в окружающей среде. Вдыхание ЛПС в чувствительных человеческих популяциях усугубляет реактивность дыхательных путей и способен вызывать сильного иммунного response11. ЛПС также общая ПАМП используется ?...

Обсуждение

Наиболее важные шаги для успешного оценки иммунного ответа в легких мышей выглядит следующим образом: 1) выбрать подходящий штамм мыши и секс для модели оценки; 2) оптимизировать доставку PAMP в легкие; 3) правильно собирать и обрабатывать БАЛ; и 4) правильно зафиксировать и подготовить лег?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6J	The Jackson Laboratory	Stock 000664
Compact Scale	Ohaus Scale Corporation	71142845
Small Animal Rectal Thermometer	Braintree Scientific	TH 5
Rectal Probe for Rodents	Braintree Scientific	RET 3
Ear Punch	Braintree Scientific	EP-S 901
Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4	InvivoGen	LPS-EB
1x Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-023
Isoflurane	Baxter	40032609
Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand	ICAP Manufacturing	n/a
Rodent Intubation Stand	Braintree Scientific	RIS 100
Scissors (blunt/sharp)	Fisher Scientific	13-806-2
forceps (straight)	Fisher Scientific	22-327-379
forceps (45º, curved)	Fisher Scientific	10-275
Scissors (blunt/blunt)	Fisher Scientific	08-940
Pipette (200 µl Capacity)	Gilson	F123601
Ethanol	Sigma	459844
1 ml Syringe	BD Medical	301025
10 ml Syringe	BD Medical	301604
27 G x 0.5 in Needle	BD Medical	305109
Refrigerated Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-676
1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter	Harvard Apparatus	732836
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-076
4-0 Silk Braided Surgical Suture	Ethicon	A183
Luer to Tube Connector Kits	Harvard Apparatus	721406
Luer Stopcock Kit	Harvard Apparatus	721664
Tygon formula E-3603 Laboratory Tubing	Sigma	R-3603
Formalin Solution, neutral buffered, 10%	Sigma	HT501128-4L
Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	559603
Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	550950
Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	560478
Hemocytometer	Hausser Scientific	3520
Hemocytometer Cover Glasses	Thermo Scientific	22-021-801
Trypan Blue	Thermo Scientific	SV3008401
Cytology Funnel Clips	Fisher Scientific	10-357
Cytology Funnels	Fisher Scientific	10-354
Filter Cards	Fisher Scientific	22-030-410
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-1
Cover Glasses	Fisher Scientific	12-540A
Cytospin Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003
Diff Quick Staining Kit	Fisher Scientific	47733150
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500