L'utilizzo di orofaringea intratracheale PAMP Amministrazione e lavaggio broncoalveolare per valutare la risposta immunitaria nei topi Host

Riepilogo

La risposta immunitaria dell'ospite all'infezione patogeno è un processo strettamente regolata. Utilizzando un polmone modello di esposizione lipopolisaccaride nei topi, è possibile effettuare valutazioni ad alta risoluzione dei complessi meccanismi associati alla patogenesi della malattia.

Abstract

La risposta immunitaria agli agenti patogeni è un processo biologico complesso. La maggior parte degli studi in vivo impiegato classico per caratterizzare le interazioni ospite-patogeno approfittano di iniezioni intraperitoneali di selezionare batteri o modelli molecolari patogeni associati (PAMPs) nei topi. Anche se queste tecniche hanno prodotto dati enormi associati con infettiva patobiologia malattia, modelli iniezione intraperitoneale non sono sempre appropriati per studi di interazione ospite-patogeno nel polmone. Utilizzando un polmone modello infiammazione acuta nel topo, è possibile condurre una analisi ad alta risoluzione della risposta immunitaria innata utilizzando lipopolisaccaride (LPS). Qui, descriviamo i metodi per amministrare LPS utilizzando chirurgico orofaringea somministrazione endotracheale, monitorare i parametri clinici associati alla patogenesi della malattia, e utilizzare liquido di lavaggio broncoalveolare di valutare la risposta immunitaria dell'ospite. Le tecniche descrittesono ampiamente applicabile per studiare l'host innata risposta immunitaria ad una gamma diversificata di PAMPs e patogeni. Analogamente, con piccole modifiche, queste tecniche possono essere applicate anche in studi che valutano allergica infiammazione delle vie aeree e nelle applicazioni farmacologiche.

Introduzione

Infezioni polmonari associate a batteri patogeni specie sono una causa comune di morbilità e mortalità a livello mondiale. Determinare i meccanismi che guidano la risposta immunitaria a questi agenti patogeni promuoverà lo sviluppo di strategie di prevenzione e nuovi agenti terapeutici che attenuare l'impatto di queste infezioni. L'obiettivo generale del protocollo qui descritto è di fornire all'utente un metodo flessibile per valutare l'host risposta immunitaria innata all'infezione patogeno utilizzando un modello patogeno associato molecolare (PAMP) come surrogato batteri vivi. La maggior parte degli studi precedenti che valutano l'host innata risposta immunitaria ai batteri si sono concentrati su modelli peritoneali causa della relativa facilità di esecuzione. Anche se questi modelli sono molto utili e hanno portato a significativi progressi nel campo delle interazioni ospite-patogeno e infiammazione sistemica, i dati generati da questi modelli non sono sempre appropriati per gli studi involving il sistema respiratorio. Qui, un modello polmonare di infiammazione polmonare acuta si propone come un ampliamento pratico e clinicamente rilevante delle intraperitoneale (ip) modelli ad iniezione classici. La tecnica proposta consente la valutazione locale della risposta immunitaria innata in un sistema modello specifico organo.

I metodi qui descritti sono progettati per fornire una tecnica semplice e robusto per consentire agli utenti di valutare la risposta immunitaria a LPS, che è un PAMP comune. I metodi sono basati su endotracheale (it) instillazione di LPS, che induce una risposta immunitaria innata robusto nei polmoni dei topi e imita molte delle caratteristiche fisiopatologiche osservate in pazienti umani affetti da infezioni respiratorie e danno polmonare acuto ^1. Un vantaggio principale di questa tecnica è che permette all'utente di valutare la risposta immunitaria senza i fattori di confusione e problemi di sicurezza associati alla realizzazione di studi in vivoutilizzando batteri vivi. Allo stesso modo, la via orofaringea che la somministrazione di esposizione descritto in questo protocollo ha vantaggi significativi rispetto ad altre tecniche comunemente utilizzate, tra cui intranasale (in) amministrazione e l'amministrazione è chirurgica. Ad esempio, la somministrazione è orofaringea permette dosaggio in vasca relativamente accurato e deposizione polmonare rispetto al somministrazione, che soffre tipicamente da una maggiore variabilità di deposizione polmonare dovuta alla perdita di agenti nella cavità nasale e dei seni ^2-4. L'instradamento somministrazione elude queste cavità e consente l'accesso diretto alla trachea e vie aeree. Allo stesso modo, l'approccio chirurgico si tratta di un metodo di gestione molto più morboso e richiede una formazione da padroneggiare. I protocolli descritti qui includono anche una descrizione delle tecniche più comuni e marcatori surrogati utilizzati per valutare la progressione infiammazione e terminare con un protocollo che descrive le tecniche adeguate per la preparazione del luNGS per la valutazione istopatologica. Questi protocolli sono focalizzati sulla riduzione del numero di topi richiesti per ciascuno studio massimizzando i dati generati da ogni singolo animale.

I protocolli descritti sono estremamente flessibili e possono essere facilmente modificati per valutare una diversa PAMPs gamma e modelli molecolari di danno associato (smorza). Inoltre, con alcune modifiche supplementari, questi protocolli possono essere applicati anche a studi che hanno valutato la progressione della malattia delle vie respiratorie allergiche o interazioni ospite-patogeno con batteri vivi, virus o funghi ^5-10.

Protocollo

Tutti gli studi sono stati condotti sotto l'approvazione del Comitato Istituzionale Cura ed uso (IACUC) per Virginia Tech e secondo il National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. Endotracheale (it) inoculazione di LPS tramite Amministrazione orofaringea

1. Assicurarsi che ogni animale è identificato in modo univoco utilizzando un punzone orecchio, marchio auricolare, o altro metodo istituzionalmente approvato.
2. Registrare il peso corporeo iniziale e la temperatura corporea per ogni animale.
3. Preparare il brodo di lavoro di LPS. Ciascun topo riceverà una dose di 50 microlitri di 1 mg / kg di LPS in 1x tampone fosfato salino (PBS). Animali trattati Mock riceveranno una dose di 50 ml di 1x PBS.
4. Preparare una camera adeguato per la somministrazione di isoflurano utilizzando il seguente metodo goccia. Linee guida istituzionali variano per quanto riguarda l'uso di isoflurano e di altri agenti anestetici e prima initiatzione eventuali studi, le persone devono contattare il Dipartimento della loro istituzione di animali Cura / Welfare per assicurare le tutte le linee guida siano adeguatamente soddisfatte. Se il metodo goccia dell'isoflurano non è un'opzione, altri agenti anestetici sono alternative accettabili.
   1. In un armadietto di sicurezza appropriato, applicare circa 3 ml di isoflurano per un tovagliolo di carta assorbente piegato e posto sul fondo di un bicchiere da 500 ml.
   2. Mettere un piccolo pezzo di foglio di alluminio sulla parte superiore del tovagliolo di carta e coprire il becher con un coperchio trasparente.
5. Preparare gli strumenti e reagenti che verranno utilizzati durante la esso inoculazione. Posizionare l'elastico che garantirà gli animali testa sul cavalletto intubazione. Questa procedura richiede un paio di pinze diritte, una coppia di pinze inclinate o curve, e una pipetta p200 con punte.
6. Carico 50 ml di LPS nel puntale e posto in un luogo facilmente raggiungibile, accanto allo stand intubazione.
7. Anestetizzare il mouseponendo l'animale nella camera di isoflurano e coprendo la camera col coperchio trasparente. Osservare modelli di respirazione dell'animale, che sarà rapida e superficiale quando in primo luogo posto nella camera. L'animale sarà sufficientemente anestetizzati quando i tassi di respirazione avvicinano 1 respiro / 2 sec, che di solito è raggiungibile in 30 secondi di mettere nella camera. Il mouse deve essere anestetizzato come indicato nel protocollo animali approvato con il metodo goccia isoflurano.
8. Rimuovere il mouse anestetizzato dalla camera e sospendere l'animale sul intubazione stare dai suoi incisivi anteriori. Assicurare che l'animale è trattenuto in modo sicuro e la bocca e la lingua sono accessibili.
9. Garantire delicatamente la lingua con le pinze diritte. Afferrare la linguetta con le pinze ad angolo e tirare delicatamente fuori dalla bocca fino a quando una leggera resistenza. Questa azione è sufficiente a bloccare l'epiglottide e accedere alla trachea.
10. Mentre si continua a tenere la lingua inposizione estesa, somministrare la dose da 50 ml di LPS nella parte posteriore della gola e coprire immediatamente narici dell'animale con un dito guantato. L'LPS sarà visibile nella parte posteriore della gola finché il mouse inala.
11. Continuare a coprire le narici e tenere la lingua esteso per 5-10 respiri supplementari.
12. Rimuovere il mouse dal supporto intubazione e posizionare l'animale torna in una nuova gabbia fino a quando non recupera dall'anestesia.
13. Controllo marker associati alla progressione della malattia. Il peso corporeo e la temperatura corporea devono essere monitorati ogni 4-8 ore per la durata dello studio. Allo stesso modo, valutare le caratteristiche comportamentali e dei sintomi clinici associati a un aumento della morbilità.
14. Per valutare la progressione della malattia, topi raccolto in specifici punti temporali successivi l'esposizione LPS. Punti temporali tipici per la raccolta a seguito di esposizione LPS includono 0, 6, 12, 18, 24, e 48 hr. Per valutare il recupero e la sopravvivenza, valutare i topi per 7 bisys post-inoculazione.

2. Siero e di lavaggio broncoalveolare Fluid (BALF) Collezione

1. Sacrifica il mouse utilizzando un metodo istituzionalmente riconosciuto.
2. Mettere l'animale sul dorso e assicurarlo ad un bordo necroscopia, idealmente 0,5 in (1,27 cm) di altezza.
3. Bagnare l'intero mouse con il 70% di etanolo.
4. Usando una siringa da 1 ml con un ago 27 G, condurre una puntura cardiaca prima di effettuare qualsiasi incisioni. Dovrebbe essere possibile ritirare 500-800 microlitri di sangue intero da un singolo mouse.
5. Rimuovere l'ago dalla siringa e trasferire il sangue intero di un prelabeled provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Per la raccolta del siero, permettono il sangue intero a coagulare per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Oltre alla raccolta siero, questa procedura può anche essere modificato incorporando un anticoagulante nel tubo e siringa, prima di raccogliere il sangue intero, per studiare cellule immunitarie circolanti.
6. Effettuare una incisione orizzontale aattraversare la lunghezza della cavità peritoneale e una incisione verticale dalla cavità peritoneale alla mascella inferiore del mouse.
7. Utilizzando pinze, afferrare entrambi i lati della incisione e tirare delicatamente la pelle dalla cavità peritoneale e toracica sottostanti.
8. Fare una grande incisione lungo la lunghezza della cavità peritoneale dai genitali allo sterno, avendo cura di evitare di tagliare il diaframma. Spostare delicatamente l'intestino nella cavità peritoneale per consentire l'accesso a uno dei reni.
9. Tagliare la vena renale che porta al rene per servire come un punto di drenaggio per perfusione.
10. Nick diaframma usando forbici, avendo cura di evitare i polmoni e il cuore, per esporre il lato sinistro del cuore.
11. Perfusione manualmente cuore utilizzando una siringa da 10 ml con un ago 27 G e soluzione PBS 1x. Evitare di applicare una forza eccessiva durante la perfusione per garantire che la soluzione salina non è costretto nei polmoni. Il sangue residuo deve defluire dalla incisione della vena porta.
12. Tagliare con cautela la cassa toracica lungo lo sterno usando contundenti / forbici spuntate, avendo cura di evitare di tagliare il cuore ei polmoni. Accidentalmente taglio polmoni durante questa procedura riduce significativamente la quantità di BALF raccolti e si tradurrà in una incapacità di gonfiare correttamente polmoni con fissativo.
13. Isolare delicatamente il cuore ed i polmoni di distanza dalla gabbia toracica con pinze. Tagliare con cautela ogni sezione della gabbia toracica con le forbici smussate / smussato il più vicino alla colonna vertebrale come possibile e rimuovere completamente entrambe le sezioni.
14. Separare le ghiandole salivari con pinze o rimuoverli con le forbici, per esporre la trachea.
15. Tagliare con cura i muscoli che si sovrappongono la trachea con le forbici. È essenziale che la trachea non essere tagliata durante questo processo.
16. Utilizzando le forbici, separare la clavicola sovrastante la trachea.
17. Afferrare il timo con pinze e sollevare il tessuto lontano dal cuore. Togliere il timo con le forbici, avendo cura dievitare di tagliare il cuore oi polmoni.
18. Fai una piccola incisione orizzontale nella trachea 1-2 anelli sotto la laringe con le forbici angolate (45-90 º angolo, tagliente / sharp). L'incisione dovrebbe essere grande abbastanza per fissare saldamente la cannula.
19. Inserire la cannula in modo che l'estremità rastremata estende 2-3 anelli tracheali sotto l'incisione e fissare la cannula in posizione con una sutura di seta. Assicurarsi che la sutura passa tra la trachea e l'esofago ed è ben teso sulla cannula.
20. Riempire una siringa da 1 ml di 1 ml di soluzione salina tamponata Hanks (HBSS) e inserire delicatamente la sua luer nella cannula.
21. Con un movimento lento, ma costante, iniettare ~ 900 microlitri nella trachea, gonfiando i polmoni, e ritirare immediatamente la HBSS. Posizionare il BALF recuperato in un tubo da 15 ml.
22. Ripetere questo lavaggio 2 volte supplementari per raccogliere circa 3 ml di BALF per analisi future. Conservare il BALF su ghiaccio oppure a 4 ° C fino al momento dell'uso.

3. Istopatologia Preparazione

1. Inserire una siringa da 10 ml in stand inflazione polmone. Assemblare il tubo al luer, il luer al rubinetto, e il rubinetto alla siringa. Assicurarsi che il rubinetto è in posizione chiusa. La siringa 10 ml servirà come un serbatoio a gravità. Il serbatoio deve essere fissato al basamento inflazione 4,75 in sopra l'animale e la parte superiore del serbatoio deve estendersi 10.5 sopra l'animale.
2. Riempire la siringa con soluzione neutra formalina tamponata. Assicurarsi che la siringa è completamente riempito con il fissativo.
3. Inserire un telo assorbente sotto l'estremità aperta del tubo e aprire il rubinetto per consentire il fissativo per riempire il tubo. Una volta che il fissativo inizia a scorrere dal tubo, chiudere immediatamente il rubinetto e riempire la siringa verso l'alto con fissativo. E 'importante che la siringa sia completamente riempito di fornire la giusta quantità di pressione per il gonfiaggio polmonare.
4. Passare delicatamente un secondo pezzo di filo di sutura sotto la trachea, circa 1-2 anelli tracheali sotto dell'estremità della cannula.
5. Legare un unico nodo sciolto nella sutura; tuttavia, non tirare il nodo stretto.
6. Inserire il tubo dalla inflazione del mouse stare nella cannula.
7. Aprire il rubinetto e permettono ai polmoni di riempirsi dall'inflazione gravità.
8. Una volta che i polmoni raggiungono il loro massimo livello di inflazione, tirare la sutura stretto e legare un secondo nodo.
9. Chiudere il rubinetto e rimuovere il tubo dalla cannula.
10. Rimuovere delicatamente la cannula dalla trachea afferrando la sutura con un paio di pinze e tenendo la cannula con le dita. Saldamente tirare la sutura verso la cavità toracica e la cannula indietro verso il naso del mouse.
11. Afferrare la trachea o le suture con una pinza e sollevare la trachea lontano dalla cavità del collo.
12. Sever caudale trachea alla sutura legato con le forbici spuntate.
13. Una volta che la tracheostomiaa è libero dai tessuti sottostanti, cominciano a tirare la trachea lontano dal mouse. Sollevare delicatamente i polmoni dalla cavità toracica.
14. Tagliare con cautela il tessuto connettivo che tiene i polmoni nella cavità toracica. Continuare a tirare la trachea lontano dal corpo del mouse e applicare una forza costante verso l'alto mentre il taglio dei collegamenti sottostanti. Fare attenzione a non tagliare i polmoni. Si noti che il cuore deve essere lasciato attaccato ai polmoni utilizzando questo metodo.
15. Una volta che i polmoni sono stati rimossi, metterli in 10 ml di formalina.
16. Rimuovere una sezione di coda di topo per la genotipizzazione.
17. Smaltire la carcassa del mouse seguendo le linee guida istituzionali appropriati.

4. Valutazione citochine

1. Centrifugare il sangue intero, raccolto sotto passo 2.5, a 12.000 xg per 5 min a isolare il siero. Trasferire il siero di un prelabeled 1,5 ml provetta da microcentrifuga e conservare a -80 ° C.
2. Valutare il Serui livelli di citochine m di ELISA o un kit simile. Diluire il siero 1:05-01:20 in un tampone di diluizione appropriata, a seconda del dosaggio, seguendo le istruzioni del fabbricante. Le diluizioni devono essere empiricamente determinato prima di eseguire la maggior parte dei campioni.
3. A causa del basso volume di siero raccolti, ridurre il volume del campione caricato sulla piastra ELISA metà. Ad esempio, la maggior parte dei test ELISA commerciali utilizzano 100 volumi microlitri di standard e campioni. Per conservare i campioni, carico 50 ml di standard e siero diluito per bene.
4. Centrifugare la BALF in una centrifuga da tavolo refrigerata a 200 xg per 5 min. Trasferire il surnatante libero cella in due prelabeled provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -80 ° C.
5. Valutare citochine BALF da ELISA o un kit simile senza diluire.
6. Conservare siero inutilizzato e BALF a -80 ° C.

5. La colorazione differenziale e BAL Cellularità valutazione

1. Dopo BALF centrifugazione e rimozione completa HBSS, la lisi dei globuli rossi pellet con soluzione salina ipotonica. Risospendere le cellule in 900 ml di acqua distillata. Aggiungere immediatamente 100 ml di 10x PBS.
2. Lisi singolarmente ogni campione. Se i campioni contengono quantità eccessive di globuli rossi, le cellule possono essere in pellet nella centrifuga da tavolo a 400 xg per 5 min e il protocollo sangue rosso lisi cellulare può essere ripetuto.
3. Determinare la cellularità BALF totale della sospensione 1 ml utilizzando un emocitometro sotto 10X o 20 ingrandimenti con Trypan Blue colorazione. Valutare e presentare questi dati come cellule / ml.
4. Preparare i materiali per la cytospin e colorazione differenziale. Etichettare vetrini da microscopio standard, con una matita o una penna resistente ai solventi. Fissare le diapositive in una staffa cytospin e imbuto. Fissare il gruppo di scorrimento nel rotore cytospin.
5. Cytospin 150 ml di BALF a 100 xg per 5 min. Se la densità cellulare è troppo grande per efficacementevalutare la morfologia cellulare, ridurre il volume filata giù sui fogli. Lasciare i vetrini all'aria secca durante la notte.
6. Macchia differenziale le diapositive seguendo i protocolli manufatti. Lasciare i vetrini all'aria secca durante la notte. I vetrini coprioggetto utilizzando Permount e valutare i vetrini con un microscopio dotato di un obiettivo 20X e 40X.
7. Raccogliere le restanti cellule per analisi successive, come FACS, microscopia elettronica, microscopia confocale, estrazione di RNA per la valutazione dell'espressione genica, e / o estrazione di proteine ​​per western blot.

6. Valutazione Istopatologia

1. Preparare i polmoni per la valutazione istopatologica. Dopo 24-48 ore di fissazione in formalina, ventralmente orientare l'intero polmoni gonfiati ed inclusi in paraffina. Tagliare i blocchi risultanti per esporre la principale vie di conduzione.
2. Per migliorare la precisione di punteggio, posizionare i polmoni nella stessa posizione e tagliare ogni blocco di cedere la visualizzazione longitudinale massima di tegli intrapolmonare principale vie aeree assiale. Da questo punto, tagliate 5 micron sezioni seriali e macchia con ematossilina ed eosina (H & E). Sezioni aggiuntive possono essere tagliati e preparati per l'ibridazione in situ utilizzando protocolli standard.
3. Valutare istopatologia utilizzando un sistema di punteggio semiquantitativo basato sui seguenti parametri infiammatori, intaccate tra 0 (assente) e 3 (grave): mononucleare polimorfonucleati e infiltrazione di cellule; Airway iperplasia delle cellule epiteliali e lesioni; stravaso; perivascolare e cuffing peribroncheolar; e la percentuale del polmone coinvolto con infiammazione. Polmone esame istopatologico dovrebbe essere valutato da un esperto patologo.
4. Media di tutti i punteggi dei parametri per generare un punteggio totale istopatologia o utilizzare i punteggi individuali per quantificare aspetti specifici della progressione della malattia. Condurre tutti segnando in doppio cieco, con revisori cieco sia il genotipo e il trattamento. Questo sistema di punteggio è stato precedente ay descritto ^6,7,10.

Risultati

Le pareti cellulari di batteri gram-negativi sono composti da LPS, che è molto abbondante nell'ambiente. L'inalazione di LPS in popolazioni umane sensibili aggrava reattività delle vie aeree ed è capace di innescare un response11 immunitaria robusta. LPS è anche un PAMP comune utilizzato in modelli murini per suscitare una risposta immunitaria innata robusta. Nel protocollo qui descritto, i topi hanno ricevuto una dose di LPS è isolato da E. coli (sierotipo 0111: B4) utilizzando l'amministrazio...

Discussione

I passaggi più critici per valutare correttamente la risposta immunitaria nei polmoni del mouse è il seguente: 1) scegliere il ceppo del mouse appropriato e sesso per il modello in corso di valutazione; 2) ottimizzare la consegna PAMP ai polmoni; 3) raccogliere ed elaborare correttamente il BALF; e 4) correttamente correggere e preparare i polmoni per le valutazioni istopatologiche.

La scelta del ceppo di topo è un fattore importante per la valutazione della risposta immunitaria dell'...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6J	The Jackson Laboratory	Stock 000664
Compact Scale	Ohaus Scale Corporation	71142845
Small Animal Rectal Thermometer	Braintree Scientific	TH 5
Rectal Probe for Rodents	Braintree Scientific	RET 3
Ear Punch	Braintree Scientific	EP-S 901
Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4	InvivoGen	LPS-EB
1x Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-023
Isoflurane	Baxter	40032609
Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand	ICAP Manufacturing	n/a
Rodent Intubation Stand	Braintree Scientific	RIS 100
Scissors (blunt/sharp)	Fisher Scientific	13-806-2
forceps (straight)	Fisher Scientific	22-327-379
forceps (45º, curved)	Fisher Scientific	10-275
Scissors (blunt/blunt)	Fisher Scientific	08-940
Pipette (200 µl Capacity)	Gilson	F123601
Ethanol	Sigma	459844
1 ml Syringe	BD Medical	301025
10 ml Syringe	BD Medical	301604
27 G x 0.5 in Needle	BD Medical	305109
Refrigerated Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-676
1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter	Harvard Apparatus	732836
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-076
4-0 Silk Braided Surgical Suture	Ethicon	A183
Luer to Tube Connector Kits	Harvard Apparatus	721406
Luer Stopcock Kit	Harvard Apparatus	721664
Tygon formula E-3603 Laboratory Tubing	Sigma	R-3603
Formalin Solution, neutral buffered, 10%	Sigma	HT501128-4L
Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	559603
Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	550950
Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	560478
Hemocytometer	Hausser Scientific	3520
Hemocytometer Cover Glasses	Thermo Scientific	22-021-801
Trypan Blue	Thermo Scientific	SV3008401
Cytology Funnel Clips	Fisher Scientific	10-357
Cytology Funnels	Fisher Scientific	10-354
Filter Cards	Fisher Scientific	22-030-410
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-1
Cover Glasses	Fisher Scientific	12-540A
Cytospin Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003
Diff Quick Staining Kit	Fisher Scientific	47733150
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500